Review Jurnal

Validation of a Simple, Rapid and

Sensitive LC Method for Quantification
of Riluzole in Rat Plasma and its
Pharmacokinetic Application
Oleh :
Jessica
Rosalia Lestari
Venny Claudia H.
Lotmi Sabaretnam B.
Stephanie

( 128114132 )
( 128114133 )
( 128114139 )
( 128114144 )
( 128114145 )

LABORATORIUM BIOFARMASETIKA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014

PENDAHULUAN
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) : penyakit yang progresif,
fatal, neurodegenerative yang disebabkan oleh penurunan
kemampuan syaraf pengontrol otot untuk bergerak.
RLZ digunakan untuk terapi ALS.
Mekanisme :menghambat pelepasan asam amino eksitatori,
menghambat stimulasi dari reseptor asam amino eksitatori,
dan menstabilkan lokasi voltage-dependent kanal ion Na yang
tidak aktif.

Contd.
RLZ mempunyai rumus kimia 6
(triflorometoksi)
benzotiazol-2amin, sangat larut dalam air dan
merupakan basa lemah (pKa
3,5).
RLZ dapat menimbulkan efek
samping pada jaringan otak.
Farmakokinetika dan formulasi
RLZ
dapat
mempengaruhi
efektivitasnya dalam hewan uji.
Membutuhkan
metode
bioanalisis
yang
sederhana,
reprodusibel, dan murah.

Contd.
HPLC untuk analisis RLZ digunakan dalam :
Plasma manusia : membutuhkan plasma yang banyak (1 mL),
memiliki tahapan yang kompleks, mahal, dan terbatas untuk
penelitian menggunakan tikus.
LC MS untuk analisis RLZ digunakan dalam :
Plasma tikus (mouse) : memiliki waktu retensi yang lama (lebih
dari 20 menit), sensitifitas yang rendah (LOQ = 100 ng/mL)

METODE
Analisis riluzole (RLZ) pada plasma tikus
Instrumen
: HPLC detektor UV
Kolom
: C-18 Phenomenex (250 mm)
Fase gerak
: metanol & buffer fosfat
(70 :
30 ) % v/v
Mode
: Isokratik
Standar internal
: Nebivolol
Panjang gelombang : 264 nm & 280 nm
Kurva kalibrasi
: 50-4000 ng/mL
Aliran fase gerak : 1 mL/menit selama 1 jam
Injeksi
: 50L

Contd.
Preparasi larutan stok

Preparasi larutan kalibrasi

Ke dalam 90 uL drug-free plasma (obat bebas dalam
plasma), ditambahkan 10 uL larutan standar RLZ 50,
100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000 dan 4000 ng/mL.

Contd.
Teknik ekstraksi (metode presipitasi protein)

VALIDASI METODE
Linearitas, Akurasi, Presisi dan Spesifisitas
Linearitas

Akurasi dan Presisi

Contd.
Spesifisitas

Sensitivitas

Contd.
Recovery

Stabilitas

Contd.
Stabilitas

 Studi Farmakokinetik

PEMBAHASAN
Analisis RLZ yang merupakan basa lemah digunakan
ion pair HPLC dengan kolom C-18
Jumlah dan komposisi buffer kondisi pH yang
bervariasi pada waktu retensi dan hasil peak simetrik
dari RLZ optimal buffer fosfat (25 mM KH2PO4)
lebih cocok digunakan (pKa 2,1) untuk mengurangi
faktor tailing dan meningkatkan bentuk peak dari RLZ.
Fase gerak waktu pengerjaan yang singkat, faktor
simetrik, sensitifitas, kemudahan dalam preparasi dan
faktor ekonomis dari metode in vivo pada tikus yang
digunakan dalam penelitian ini fase gerak metanol
70% memiliki waktu retensi antara 6,8 0,11 menit
untuk RLZ.

Contd.
Standar internal mempengaruhi presisi, akurasi dan
perolehan kembali (recovery) dari metode yang digunakan.
Standar internal acyclovir, diklofenak, nebivolol dan
raloxifen telah diuji coba sebagai standar internal pada
optimasi kondisi kromatografi hanya nebivolol yang dapat
terpisah dengan baik dari pengotor plasma dan RLZ
dengan waktu yang singkat selama 10 menit (SI)
Pada kondisi kromatografi yang optimal, waktu retensi untuk
standar internal dan RLZ 5,3 0,09 dan 6,8 0,11 menit
dengan pemisahan yang baik (resolusi > 2) antara peak
analit masih memenuhi syarat % RSD yaitu 15 % untuk
analisis senyawa dalam matriks biologis (Snyder, 1997).

Contd.
Validasi metode :
Spesifisitas : peak tidak dipengaruhi pengotor dari plasma
Linearitas : y = 0,00085( 0,00007)x 0,03835 (0,0012)
dengan r2 = 0,999
Akurasi : LQC = 250 ng/mL, MQC = 750 ng/mL, dan HQC
= 3000 ng/mL menunjukkan range akurasi dari -1,22%
sampai 3,25% dengan % RSD maksimum sebesar 4,11%
melewati range QC

Contd.
Presisi : %RSD intraday = 4,10; % RSD interday
= 4,02
Sensitifitas : LLOQ 49,09 ng/mL merupakan
hasil yang reliabel, reprodusibel, dan akurat
untuk metode yang diusulkan nilai LLOQ
yang diperoleh pada penelitian ini meningkat
secara
signifikan
dibandingkan
dengan
penelitian sebelumnya (LLOQ 100 ng/mL) oleh
Colovic et al. pada plasma tikus.

 Tabel Akurasi dan Presisi Intermediet

Contd.
Recovery : rentang 81,3% - 85,5%; RSD
kurang dari 4,11%
Uji stabilitas : tidak ada degradasi yang
signifikan dari RLZ pada plasma yang
telah dicek pada beberapa kondisi stress
yaitu kondisi suhu ruangan, 3 siklus
freeze-thaw, kondisi penyimpanan dalam
waktu lama.

 Grafik Uji Stabilitas

 Aplikasi farmakokinetika : Sampel dikoleksi

sampai 16 jam setelah administrasi obat secara
oral

 Konsentrasi vs Waktu RLZ

KESIMPULAN
Pengembangan metode HPLC cepat, tepat,
spesifik, sensitif dan biaya yang efektif
Stabilitas RLZ stabil dalam kondisi
penyimpanan
Persiapan sampel dan waktu analisis singkat
bisa untuk banyak sampel
Metode dapat digunakan dalam menentukan
parameter
farmakokinetik
obat
setelah
pemberian oral pada tikus