TUGAS MATA KULIAH ANALISIS PANGAN

PROSEDURE ANALISA KOMPONEN BAHAN PANGAN

DENGAN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI

Di susun Oleh :
Bagas Aryo Sasongko

135100100111015

Hasna Nadhiroh

135100100111019

Ine Elsa Putri

135100101111024

Sonia Laily Rahmadita

135100101111058

Meidinar Rizky A

135100101111060

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2015

1. Prosedur Analisa Asam Lemak Menggunakan Derivatisasi-GC

Preparasi Sampel dan Procedure Penelitian
Yang dilakukan pada preparasi sampel yaitu pencucian dengan akuades, pemotongan sampel
untuk memperluas permukaan dan pengeringan pada oven pada suhu 6500C. Penghalusan
sampel sampai terbentuk serbuk.
Ekstraksi Soxhletasi.
Setelah dilakukan preparasi untuk mengetahui kandungan asam lemak dilakukan ekstraksi
dengan soxhletasi sebelum dilakukan derivatisasi GC. Ekstraksi tersebut menggunakan
pelarut n-heksana yang dipekatkan dalam rotary evaporator pada temperatur 500 C sehingga
diperoleh minyak sampel pekat dan dihitung rendemennya.
Hidrolisis Sampel.
Sampel dihidrolisis sebanyak 25 g dimasukkan kedalam labu leher tiga. Kemudian
ditambahkan 50 mL metanol dan 50 mL larutan KOH 12%. Campuran direfluks dengan
pengadukan pada temperatur 600 C selama 90 menit. Hasil refluks dimasukkan kedalam
corong pisah dan ditambahkan dengan 125 mL aquades serta 31,25 mL n-heksana. Larutan
dikocok dengan kuat dan didiamkan sampai terbentuk dua lapisan yaitu lapisan air dan lapisan
organik. Lapisan air dipisahkan dari lapisan organik. Lapisan air ditambahkan dengan asam
sulfat 1 M sampai pH 1. Asam lemak bebas dipisahkan dari lapisan air.
Tahap Esterifikasi Asam Lemak Bebas
Sebanyak 10 g asam lemak sampel masing-masing dimasukkan kedalam labu leher tiga yang
dilengkapi dengan termometer. Selanjutnya ditambahkan 8,7 mL metanol dan 0,087 mL (87
L) H2SO4 pekat. Kemudian campuran tersebut direfluks selama 1 jam pada temperatur
500C. Campuran hasil refluks selanjutnya didinginkan dan dimasukkan dalam corong pisah.
Selanjutnya ditambahkan 20 mL aquades dan dilanjutkan dengan penambahan larutan
NaHCO3 tetes demi tetes sambil dikocok dan diukur pH dengan indikator universal hingga
netral. Setelah itu dilakukan salting out dengan menambahkan 5 mL larutan NaCl jenuh
hingga campuran terpisah sempurna. Larutan dikocok dengan kuat dan didiamkan hingga
terbentuk dua lapisan. Lapisan organik ditambahkan magnesium sulfat anhidrat.
Identifikasi Asam Lemak
Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester minyak sampel pada
alat kromatografi gas-spektroskopi massa Shimadzu QP 2010. Dengan demikian spektrum
yang terdeteksi oleh KG-SM merupakan spektrum dari metil ester asam lemak. Analsis yang
dilakukan menggunakan kromatografi :
gas-spektroskopi massa
: model Shimadzu QP 2010
temperatur oven kolom
: 800C, temperatur injeksi 3100C,
tekanan
: 10,9 kPa, total aliran 72,5 mL/menit,
laju alir
: 24,8 cm/detik dan aliran kolom 0,3 mL/menit.
Ekstraksi minyak sampel menggunakan ekstraktor soxhlet dengan menggunakan pelarut nheksana disebabkan karena minyak yang akan diekstrak dari sampel memiliki sifat nonpolar,
sehingga diperlukan pelarut n-heksana yang sifatnya nonpolar juga. Hidrolisis tersebut
merupakan proses pemisahan zat yang disebabkan oleh molekul air (H2O). Hidrolisis dapat
terjadi pada kondisi asam maupun basa. Hidrolisis minyak sampel pada jurnal tersebut
berlangsung pada kondisi basa dengan menggunakan basa kuat KOH. Penggunaan basa KOH
ini disebabkan karena air tidak dapat menghidrolisis secara sempurna minyak sampel,
sehingga diperlukan larutan basa untuk menghidrolisis minyak tersebut. Reaksi antara minyak
dengan basa dikenal dengan reaksi saponifikasi atau sering disebut reaksi penyabunan. Reaksi
penyabunan pada minyak menghasilkan garam asam lemak atau sabun. Selanjutnya garam

asam lemak dengan penambahan H2O dengan katalis asam (H2SO4) menjadi asam lemak
bebas.
Esterifikasi adalah tahap konversi asam lemak bebas menjadi ester, dengan mereaksikan asam
lemak dengan alkohol. Asam lemak bebas dari sampel yang diperoleh dari proses hidrolisis
ditambahkan dengan metanol (CH3OH) dan asam kuat H2SO4 sebagai katalis sehingga
terbentuk senyawa metil ester. Derivatisasi asam lemak menjadi senyawa metil ester
bertujuan untuk menurunkan titik didih dari masing-masing asam lemak agar lebih mudah
diuapkan dan dipisahkan sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang lebih baik.
Selain itu, proses esterifikasi ini dilakukan untuk keperluan analisis kadar asam lemak
menggunakan KG-SM. Hal ini dikarenakan asam lemak yang diperoleh dari hidrolisis bersifat
nonvolatil (tidak mudah menguap), sementara syarat senyawa yang diperlukan untuk
keperluan analisa harus bersifat volatil. Sehingga diperlukan adanya konversi asam lemak
bebas menjadi senyawa metil ester. Senyawa metil ester sendiri bersifat volatil (mudah
menguap).

2. Prosedur Pengukuran Kadar Gula Menggunakan HPLC

Penelitian yang dilakukan oleh Dira Swantara (1995) menyatakan bahwa pemisahan
dan analisis senyawa monosakarida dan disakarida pada madu dan bahan sejenis lainnya
dapat dilakukan dengan menggunakan teknik HPLC.
Kolom
: Bondapak-NH2 dan
Fase gerak
: eluen campuran asetonitril:air (75:25) yang mengandung 1,0 x 10-5 M
etanolamin.
Laju alir
: ditentukan pada 0,6 ml/menit
Detektor
: UV
panjang gelombang :195 nm.
Namun pada penelitian tersebut tidak dilihat pengaruh suhu kolom terhadap pemisahan
masing-masing komponen madu.
Berdasarkan latar belakang tersebut, peneliti melakukan pengukuran kadar glukosa
dan fruktosa dari jenis madu randu dan madu kelengkeng yang ditentukan dengan
menggunakan metode HPLC dengan mangatur laju alir eluen dan suhu kolom dengan
menggunakan eluen air deionisasi, kolom Metacarb 87oC dan dideteksi dengan menggunakan
detektor indeks bias.
Preparasi sampel dan Prosedure Penelitian
Langkah pertama yaitu dengan pembuatan larutan standar glukosa dan fruktosa
dengan menimbang masing-masing senyawa sebanyak 1 gram, dimasukkan ke dalam labu
ukur 20 ml, dan ditambahkan aquades sampai tanda batas (kadar glukosa dan fruktosa
masing-masing 5% b/v). Dari konsentrasi tersebut dibuat campuran dengan konsentrasi
masing-masing 1%; 0,5%; 0,25%; dan 0,125%. Apabila masing-masing campuran glukosa
dan fruktosa telah dibuat, selanjutnya disaring dengan kertas saring 0,45 m.
- Penentuan Kondisi HPLC untuk Pemisahan Glukosa dan Fruktosa
Kondisi analisis penentuan kadar glukosa dan fruktosa pada madu dapat dilihat dari
hasil pemisahan kromatogram. Kondisi yang baik akan tercapai jika hasil kromatogram
dari masing-masing komponen tidak tumpang tindih satu dengan yang lain. Kromatogram
yang tidak terjadi tumpang tindih dapat dicapai dengan mengatur suhu kolom dan laju alir
dari eluen. Kondisi pemisahan dapat ditentukan pada saat pengukuran larutan standar,
dimana eluen yang digunakan adalah air deionisasi pada kolom Metacarb 87oC dan
dideteksi menggunakan detektor indeks bias.
- Pembuatan Kurva Standar

Larutan standar glukosa dan fruktosa mulai dari konsentrasi 0,125%; 0,25%; 0,5%;
dan 1 % diinjeksikan sebanyak 20 l dengan menggunakan auto syringe injector dan
dibiarkan sampai semua komponen keluar dan terpisah dari kolom.
Penentuan Kadar Glukosa dan Fruktosa
a. Perlakuan Sampel
Sampel madu yaitu madu kelengkeng dan madu randu dipipet sebanyak 0,5 ml dan
diencerkan sampai volumenya 50 ml serta dilakukan sentrifugasi selama 30 menit.
Tujuan dilakukan sentrifugasi adalah untuk memisahkan komponen yang larut air
dengan yang tidak larut air. Hasil dari sentrifugasi yaitu dengan terbentuknya dua
lapisan. Lapisan atas diambil dan dilakukan penyaringan dengan kertas saring 0,45
m. Filtrat hasil penyaringan kemudian diambil 20 l dan disuntikkan ke alat HPLC.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Eluen yang digunakan adalah air deionisasi yang memiliki sifat kepolaran yang sesuai
dengan karbohidrat dan menghasilkan resolusi yang baik untuk pemisahan glukosan dan
fruktosa.
a. HPLC dengan larutan standar
Komponen
Konsentrasi (%)
Laju alir (ml/menit)
WR (menit)
Glukosa
5
1
6,025
Fruktosa
5
1
7,822
Glukosa muncul sebagai puncak pada waktu retensi yang lebih ceoat daripada
fruktosa. Hal ini disebabkan karena adanya interaksi yang lebih kuat antara fruktosa
dengan fase diam daripada interaksi antara glukosa dengan fase diam. Semakin mirip
sifat kepolaran antara senyawa yang dipisahkan dengan fase diam, maka interaksinya
akan semakin kuat, sehingga waktu retensinya akan semakin lama.
b. Penentuan kondisi
WR (menit)
Konsentrasi
Laju alir
Suhu
Resolusi
o
(%)
(ml/menit)
( C)
Pemisahan
Glukosa Fruktosa
75
6,310
7,957
6,76
0,6
80
6,522
7,895
5,40
1
70
6,492
7,823
7,85
1
80
6,212
7,793
9,32
Jika laju alir dipercepat atau suhu kolom ditingkatkan, maka komponen akan keluar
sebagai puncak pada waktu retensi yang lebih pencek. Sedangakn jika laju alir
diperlambat atau suhu kolom diturunkan, maka akan dihasilkan puncak pada waktu
retensi yang lebih lama.
Kondisi operasional yang terbaik diperoleh pada suhu kolom 80oC dan laju alir 1 ml/menit
dengan menggunakan detektor indeks bias karena dihasilkan waktu retensi untuk glukosa
sebesar 6,212 menit dan waktu retensi fruktosa sebesar 7,793 menit dengan resolusi
pemisahan yang paling tinggi yaitu 9,32. Kadar glukosa pada madu randu adalah sebesar
27,31 % dan pada madu kelengkeng sebesar 28,09 %. Sedangkan kadar fruktosa pada madu
randu sebesar 40,99 % dan pada madu kelengkeng sebesar 40,03 %. Kadar glukosa dan
fruktosa dari tiap-tiap sampel madu telah memenuhi syarat mutu madu nasional (SII) dimana
kadar gula pereduksi total pada madu randu sebesar 68,12 % dan pada madu kelengkeng
sebesar 68,12 %.

3. INTISARI ANALISIS ASAM AMINO DALAMCUMI-CUMI

(TODARODES PASIFICUS)
Masalah pertama dalam analisis asam amino adalah pemisahan dan sensitifitasnya. Beberapa
protein asam amino mempunyai rantai samping dengan sifat fisik yang dapat langsung diketahui
dalam larutan. Gugus-gugus utama seperti fenilalanin, tirosin, triptopan dapat dideteksi dengan
detektor UV-Vis, fluorosens dan elektrokimia karena mempunyai gugus aromatik, tetapi secara umum
asam amino mempunyai sedikit gugus kromofor sehingga untuk dapat dideteksi dengan detektor
UVVis maka asam amino tersebut perlu diderivatifkan terlebih dahulu. Reagen penderivatif yang akan
digunakan yaitu PITC dan untuk memisahkan asam amino hasil hidrolisis sampel digunakan KCKT
dengan detektor UV-Vis. Tujuan utama dari proses derivatisasi asam amino adalah diperolehnya suatu
senyawa baru yang mempunyai gugus kromofor sehingga diharapkan dapat menaikkan sensitivitas
deteksi dengan demikian senyawa baru tersebut dapat terdeteksi dengan detektor UV-Vis.

Preparasi Sampel dan Prosedur Penelitian

Analisis Asam Amino Standart
Analisis asam amino standar dilakukan dengan menderivatisasi terlebih dahulu kedelapan
asam-asam amino murni yaitu glutamat fenilalanin, histidin, prohn, arginin, leusin, valin dan
treonin yang masing-masing dilarutkan dalam akuabides sehingga diperoleh larutan asam amino
0,01 M. Larutan asam amino dikeringkanvakum kemudian dilarutkan dakm pelarut etanol: air:
trietilamin(TEA) = 2:2:1 (v/v).
Campuran larutan tersebut dikeringkan vakum lagi selama 15 menit, setelah itu
ditambahkan etanol:TEA:air:PITC =7:1:1:1 (v/v) dan dikeringkan vakum selama 20 menit. Hasil
derivatisasi tersebut dilarutkan dalam larutan buffer asetat 0,01 M pH 4,9 : asetonitril = 62:38
(v/v). Terhadap 3 asam amino yang pertama yaitu glutamat,fenilalanin dan histidin dikkukan
pemanasan saat pengeringan vakum hingga suhu 50 C. Asam-asam amino murni yang telah
diderivatisasi dianalisis dengan HPLC.
Analisis Asam Amino Sampel
Sampel cumi-cumi dibuat tepung terlebih dahulu kemudian dihidrolisis dengan asam
klorida dalam oven hingga suhu 110 C selama 24 jam. Hasil hidrolisis sampel disentrifugasi
kemudian filtratnya dipisahkan. Filtrat dikeringkan vakum kemudian dilarutkan dalam
etanol:air:TEA = 2:2:1 (v/v). Larutan ini dikeringkan vakum lagi selama 15 menit kemudian
ditambahkan etanol:TEA:air:PITC = 7:1:1:1 (v/v). Hasil reaksi derivatisasi ini kemudian
dikeringkan vakum lagi selama 20 menit kemudian dilarutkan dalam 100 ml pelarut buffer asetat
pH 4,9 : asetonitril = 62:38 (v/v). Sampel hasil derivatisasi diinjeksikan ke dalam alat HPLC

dengan detektor UV-Vis pada panjang gelombang 254 nm dengan kondisi yang sama dengan analisis

asam amino standar.

Kolom
: CI8
Suhu kolom : Suhu kamar
Laju alir eluen: 1 ml/menit
Detektor
: Detektor UV-Vis padapanjanggelombang254 nm.
Fase Gerak : Eluen A yaitu larutan buffer asetat pH 4,9 : asetonitril= 47:3 (v/v) dan eluen
B yaitu asetonitril: air = 60 :40 (v/v)