Pencegahan Herpes SimplexVirus diinduksi Stroma Keratitis oleh

Glycoprotein B-Spesifik Antibodi monoklonal

ABSTRAK
Meningkatnya insiden asiklovir (ACV) dan strain resisten pada pasien dengan kornea
HSV-1 infeksi yang menyebabkan herpes stroma Keratitis (HSK) merupakan masalah kesehatan
utama di negara-negara industri dan sering mengakibatkan kebutaan. Untuk mengatasi kendala
ini, kami sebelumnya telah mengembangkan antibodi monoklonal HSV-gB-spesifik (mAb 2c)
yang terbukti sangat protektif di imunodefisiensi NOD / SCID-tikus terhadap infeksi genital.
Dalam

penelitian

ini,

kami

menguji

efektivitas

mAb

2c

dalam

mencegah

penyakitimmunopathological HSK dalam model mouse / c HSK BALB. Oleh karena itu, tikus
diinokulasi dengan HSV-1 regangan KOS pada kornea diskarifikasi untuk menginduksi HSK
dankemudianbaik secara sistemik atau topikal diperlakukan dengan mAb 2c. Pengobatan
sistemik dilakukan dengan pemberian intravena mAb 2c 24 jam sebelum infeksi (pre-exposure
prophylaxis) atau 24, 40, dan 56 jam setelah infeksi (post-exposure imunoterapi). Pengobatan
topikal dilakukan oleh inokulasi berkala (5 kali per hari) dari antibodi yang mengandung tetes
mata sebagai kontrol, mulai dari 24 jam pasca infeksi. Pengobatan antibodi sistemik nyata
mengurangi viral load pada tempat infeksi dan benar-benar melindungi tikus dari
mengembangkan HSK. Administrasi antibodi infeksi sebelumnya atau posting antivirus samasama efektif. Pengobatan topikal tidak berpengaruh meningkatkan pada tingkat keparahan HSK.
Kesimpulannya, data kami menunjukkan bahwa mAb 2c terbukti menjadi obat yang sangat baik
untuk pengobatan infeksi HSV kornea dan untuk pencegahan HSK dan kebutaan. Selain itu,
rekan manusiawi (mAb hu2c) sama-sama efektif dalam melindungi tikus dari HSV-induced HSK
jika dibandingkan dengan antibodi tikus tua. Hasil ini menjamin pembangunan masa depan
antibodi ini sebagai pendekatan baru untuk pengobatan kornea HSV-infeksi pada manusia.

Introduksi
1

Okular Herpes Simplex Virus tipe 1 (HSV-1) diinduksi keratitis adalah salah satu
penyebab utama kebutaan menular di dunia industri. Insiden global HSV disebabkan penyakit
mata kira-kira 1,5 juta, termasuk perkiraan jumlah 40.000 kasus baru gangguan penglihatan
bermata parah atau kebutaan setiap tahun [1]. HSV-1 infeksi kornea sering mengakibatkan
penyakit mulai dari radang epitel ringan sampai ulserasi kronis kornea yang dimediasi system
imun, seperti keratitis stroma nekrotik berat, juga disebut herpes stroma Keratitis (HSK) [2, 3].
Setelah infeksi primer kornea virus bereplikasi di epitel kornea dan bermigrasi ke ganglion
trigeminal dengan memindahkan langsung antara sel-sel epitel yang berdekatan, dari sel epitel ke
neuron, dengan transportasi aksonal intraseluler dan melalui transfer di sinapsis saraf untuk
menyebar dari perintah pertama ke perintah kedua neuron rangka[4]. Kedua, penyebaran sel-sel
dan transportasi aksonal intraseluler adalah mekanisme kunci dari HSV untuk memfasilitasi
penyebaran virus secara cepat dan melarikan diri dari host sistem pertahanan imun seluler dan
humoral [5]. HSV terjadinya laten, infeksi asimtomatik dalam neuron dari sistem saraf perifer.
Reactivasi berkala virus laten dan transmisi dari ganglia trigeminal ke menyebar ke pinggiran
melalui sel ke sel dapat menyebabkan infeksi berulang dari kornea berhubungan dengan lesi
inflamasi dimediasi sel T yang parah yang akhirnya dapat mengakibatkan HSK [6 ] dan kebutaan
[7]. Saat ini, pengobatan sistemik atau topikal dengan acyclovir (ACV) berhasil digunakan untuk
menekan replikasi virus pada pasien dengan berulang herpes reaktivasi. Selain itu, kortikosteroid
digunakan untuk menekan respon kekebalan pada kornea untuk menghindari jaringan parut
kornea. Studi terbaru menunjukkan bahwa kejadian resistensi asiklovirHSV-1 strain telah secara
dramatis meningkat menjadi sekitar 6,4% pada pasien imunokompeten dengan HSK [1, 8].
Karena beberapa efek samping yang serius penggunaan gansiklovir (GCV) atau foscarnet (FOS)
terbatas [9]. Selanjutnya, resistensi silang terhadap GCV, FOS atau sidofovir (CDV) semakin
terlihat [10]. Oleh karena itu penting untuk mengembangkan seri, ditoleransi pilihan pengobatan
untuk pasien dengan asiklovir berulang atau resisten silang HSV-1 infeksi kornea.
Dalam penelitian sebelumnya, kami telah melaporkan bahwa monoklonal antibodi mAb
2c dikembangkan sebagai senyawa yang sangat ampuh untuk netralisasi obat resistensi Herpes
Simplex Virus [11, 12]. Antibodi ini mengakui epitop umum pada glikoprotein B dari HSV-1 dan
HSV-2 dan terlihat lebih dari biasanya khasiat antivirus tinggi in vitro dan pada tikus sangat
imunodefisiensi NOD / SCID. Urutan epitope dikenali oleh mAb 2c sangat dibiakan di isolasi
HSV-1 dan HSV-2 dan terbukti menjadi penting untuk virulensi dan kebugaran virus [13].
2

Berbeda dengan sebagian besar antibodi manusia yang dihasilkan selama infeksi HSV atau
disebabkan oleh vaksinasi dengan vaksin protein rekombinan, antibodi ini tidak hanya
menetralisir virus yang beredar, tetapi juga menghambat HSV penyebaran transmisi oleh sel ke
sel [11]. Mekanisme ini dikenal menjadi penting selama pembentukan laten dan juga selama
reaktivasi [5, 14]. Karena sifat unik dari mAb 2c, kami merancang derivate mAb hu2c mansia
untuk pengobatan infeksi HSV resisten terhadap obat antivirus standar [11, 12]. Baik antibody
manusia dan antibodi mencit memperlihatkan sifat yangsama mengikat dan mampu menetralisir
berbagai klinis isolat resisten terhadap ACV, FOS atau CDV. In vivo, mAb hu2c juga mencegah
NOD / tikus SCID terhadap mematikan infeksi HSV-1 dengan multidrug resisten isolat klinis
[15]. Berdasarkan data-data yang menjanjikan, kami menyimpulkan bahwa antibodi ini harus
menjadi pilihan perawatan yang tepat untuk infeksi kornea berat HSV-1 menginduksi HSK.
Akibatnya, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji kapasitas netralisasi dari
antibodi monoklonal HSV-gB-spesifik terhadap mata-patogen HSV-1 galur KOS dan isolat klinis
ACV resisten in vitro dan kemanjurannya dalam pencegahan HSK di imunokompeten pada
mencit BALB model / c.

Bahan dan Metode

Pernyataan Etika
Hewan percobaanyang dipakai sesuai dengan peraturan ketat Masyarakat Jermanuntuk
Laboratorium Ilmu Hewan(GV-SOLAS) danUU Kesehatan Eropa dari Federasi Laboratorium
Hewan Asosiasi Ilmu(FELASA). Protokolini disetujuioleh Badan Westphalia Negara Rhine
Alam, Lingkungan Hidup danPerlindungan Konsumen (LANUV) (Izin nomor: G1194-1111).
Persiapan neuronsensorik mencit dilakukan sesuai dengan Undang-UndangJerman Animal
Welfare. Semuaupaya dilakukanuntuk meminimalkan penderitaan. Untukimunofluoresensi
percobaan mikroskop(lihat di bawah), kami menggunakanserummanusiayang sehat, HSV-1
seronegatifvolunteers.Writteninformed consent dari donor darah diperoleh. Izin diberikan oleh
Lembaga Review Boarddari Hannover Medical School(persetujuan nomor893).

Hewan
3

Mencit BALB/c betina, 8 minggu usia, yang dibeli dari Charles River Laboratories (Charles
River Laboratories, Sulzfeld, Jerman) dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen. Semua in
vivo percobaan dilakukan sesuai dengan persyaratan hukumJerman dengan persetujuan fasilitas
hewan University Hospital Essen. Untuk mengisolasi neuronprimer, tikus C57BL/6JhanZtm
dibiakkandan dipelihara di Fasilitas Hewan Laboratorium Hannover Medical School.

Sel
Sel Vero (American Type Culture Collection, ATCC, CCL81, Rockville, MD) yang
dikultur

di

Dulbecco'sModified

EagleMedium

(DMEM,

Life

Technologies

Gibco,

Darmstadt, Jerman) yang mengandung 10% (v / v) serum janin anak sapi (FCS; Life
Technologies Gibco), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. BHK-21 sel (ATCC
CCL-10) dikultur in minimum EssentialMedium (MEM, Cytogen, Sinn, Jerman) ditambah
dengan 10% FCS (v / v), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. Sel epitel C127I
(ATCC CRL-1616) dikultur dalam DMEM (Life Technologies Gibco) yang mengandung 10% (v
/ v) FCS (PAA, Saarbrcken, Jerman), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. Budaya
utama akar dorsal ganglion (DRG) neuron disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [16,
17]. Neuron tersebut terinfeksi dalam perjalanan manusia dan murine HSV-1 infeksi [18-21].
Secara singkat, dewasa C57BL / 6J tikus dikorbankan, DRG dari serviks, tingkat toraks dan
lumbal hewan yang dibedah dan dikumpulkan dalam 1x Hank Seimbang Salt Solution (HBSS,
mengandung 5 mMHEPES, 10 MMD-Glukosa, pH 7,4). Ganglia pertama kali dicerna selama 20
menit pada 37 C dengan 20 mg / ml papain (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Jerman) di papain
solusi aktivasi (0,4 mg / ml L-sistein, 0,5 mMEDTA, 1,5 mMCaCl2 2H2O, pH 7,4) diikuti
oleh pencernaan dengan 10 mg / ml kolagenase IV (Invitrogen) dan 12 mg / ml dispase II
(Sigma-Aldrich) di 1xHBSS. Ganglia yang pellet dan diresuspensi dalam 1 ml 1xHBSS dan
triturated menggunakan pipet Pasteur dengan ujung menyempit. Neuron-suspensi itu berputar
selama 8 menit pada 381 g melalui bantal yang terdiri dari 20% (v / v) Percoll di media CO2independen (Life Technologies Gibco) yang mengandung 10 MMD-glukosa, 5 mMHEPES, 10%
FCS, 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. Setelah menghapus supernatan, pelet sel
resuspended dalam 2 ml CO2-independen menengah dan akhirnya disentrifugasi selama 2 menit
pada 1000 g.The pelet diresuspensi dalam medium F-12 campuran nutrisi Ham mengandung
10% FCS, 50 ng / ml 2,5 S NGF (Promega Corporation, Fitchburg, WI, AS), 100 U / ml penisilin
4

dan 0,1 mg / ml streptomisin dan unggulan ke slip penutup dilapisi dengan 0,01% (b / v) dalam
H2Opoli-L-lisin (150,000-300,000 gmol-1Sigma-Aldrich) dan laminin mencit alami(0,8
gpercoverslip,Invitrogen) dalam 24piring. Neuron yang ditanam pada 37Cdan5% CO2dalam
inkubator

dilembabkandan

sedangberubah dua kaliperminggu.

Obatantimitosis

1--D-

arabinofuranosylcytosine (Sigma-Aldrich) ditambahkan kekonsentrasi akhir 2Mto menekan

proliferasi membagi, sel-selnon-saraf dan dicuci sebelum infeksi. Setelahsatu minggu budidaya,
neuronyang digunakan untuk melakukan eksperimen.

VIRUS
Strain patogen mata HSV-1 strain KOS dan isolat ACV resisten yang disebarkan pada sel Vero
dan disimpan pada -80 C. Untuk pemeriksaan virus titer supernatan sel atau organ yang
homogenizates dititrasi pada sel Vero seperti yang dijelaskan sebelumnya [22]. Tiga isolat klinis
dengan resistensi terhadap ACV [10] yang baik yang disediakan oleh GeorgesM.GM Verjans
(Departemen Virologi, Erasmus Medical Centre, Rotterdam, Belanda). Reporter virus HSV-1 (17
+) LoxpMCMVmCherry, HSV-1 pendek (17 +) Lox-Che, telah diturunkan dari HSV-1 (17 +) LoxGFP [23]. Gen GFP dari HSV-1 (17 +) Lox-GFP telah mengganti dengan gen untuk

pMCMV

monomer Cherry (R. Budida, A. Pohlmann, B. Sodeik, dan G. Behrens, yang akan diterbitkan di
tempat lain); kedua strain mengekspresikan protein fluorescent GFP atau mCherry sebagai
penanda pengganti dapat digunakan untuk memantau HSV-1 ekspresi gen virus awal. HSV-1 (17
+) Lox-Che itu disebarkan menggunakan BHK-21 sel dan dimurnikan seperti yang dijelaskan
sebelumnya [24, 25]. Titer ditentukan oleh tes plak, genom untuk membentuk plak unit (PFU)
rasio ditentukan dengan real time PCR [24, 25].

Antibodi
Antibodi monoklonal mAb 2c dan mAb hu2c dimurnikan dari hibridoma bebas serum atau
supernatan SP2 / 0 sel dengan protein kromatografi A seperti yang dijelaskan sebelumnya [11,
15]. Purity telah dikonfirmasi oleh FPLC? 95%. Konsentrasi diukur dengan NanoDrop 2000
spektrometer

Netralisasi Assay
Kapasitas netralisasi dari mAb2c ditentukan pada sel Vero oleh end point pengenceran seperti
yang dijelaskan sebelumnya[11]. Secara singkat, pengenceran serial antibodi diinkubasi dengan
100 TCID 50 dari HSV-1 KOS atau isolat klinis resistenACVselama 1 jam pada37Cdalam
5

mediumkultur sel. Virus antibodi inokulum diaplikasikan mono layers sel Vero tumbuh baik
di96piring, dan efek sitopatik(CPE) yangtercipta setelah48jam inkubasipada 37C. Konsentrasi
antibodiyang diperlukan untuk penghambatan lengkap virus yang disebabkan CPE ditentukan
sebagai titer netralisasi. [11, 15].

Inhibisi penyebaran sel ke sel

Efektivitas mAb 2c untuk menghambat transmisi sel ke sel dari strain patogen mata HSV-1 KOS
dianalisis dengan imunofluoresensi seperti yang dijelaskan sebelumnya [11]. Secara singkat,
monolayers konfluen sel Vero, tumbuh di 24-baik piring kultur jaringan, terinfeksi 100 TCID50
dari HSV-1 KOS. Setelah 4 jam adsorpsi pada 37 C inokulum virus telah dihapus. Sel
diinkubasi selama 48 jam dalam DMEM yang mengandung 2% FCS di hadapan 500 nM (75 g /
ml) mAb 2c, dikumpulkan sera manusia (1:40 diencerkan dalam medium) yang berasal dari
donor dengan titer tinggi imunoglobulin anti HSV (penetral titer 1: 256 total netralisasi 100
TCID50 dari HSV-1 KOS), atau media saja. Konsentrasi antibodi dalam supernatant sel
mewakili konsentrasi berlebih diperlukan untuk netralisasi lengkap virus yang dikeluarkan.
Pembentukan plak terdeteksi oleh imunofluoresensi. HSV-1 sel yang terinfeksi diwarnai dengan
anti-HSV-1/2-gD-antibodi tikus (Acris Antibodi, San Diego, CA, USA) dan Alexa Fluor 488
kambing anti IgG antibodi sekunder spesifik (Invitrogen). Baik antibodi Manusia atau antibodi
mencit diwarnai dengan Cy3 kambing terkonjugasi anti IgG tikus atau antibodi sekunder IgG
kambing anti manusia (Invitrogen), masing-masing. Gambar imunofluoresensi diperoleh dengan
fluoresensi mikroskop Zeiss Pengamat Z1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman) pada pembesaran
100 kali lipat.

Analisis penyebaran sel epitel ke neuron dan neuron ke epitel

Sel C127Inaif ditransfeksikan dengan GFP mengekspresikan plasmid pEGFP-N1 (Invitrogen)
untuk identifikasi. Transfeksi dilakukan dengan reagen GeneJuice sesuai dengan protokol
produsen (Merck Millipore, Darmstadt, Jerman). Sel terbalik transfected dan diinkubasi selama
24 jam sebelum digunakan. Untuk menguji pengaruh antibodi yang berbeda pada HSV-1
transmisi sel neuron-to-epitel, neuron DRG terinfeksi 2.5x107 PFU / ml HSV-1 (17 +) Lox-Che.
Pada 24 jam pasca infeksi, sel C127I transfected yang terpisah dengan accutase (GE Healthcare
Eropa, Freiburg, Jerman) dan dicampur dengan antibodi hu2c, 2c atau dengan IgG manusia
dikumpulkan (Anti-HSV-positif; Sigma-Aldrich) di 75 g / ml atau pura-pura diobati. Campuran

sel-antibodi seperti kemudian diunggulkan di atas neuron DRG yang terinfeksi. Untuk menguji
dampak dari mAbs 2c dan hu2c pada epitel sel-to-neuron menyebar, sel C127I terinfeksi dengan
7,5 106PFU / ml selama 15 jam. Sel-sel kemudian terpisah dengan accutase, dicampur dengan
antibodi yang ditunjukkan seperti dijelaskan di atas, dan unggulan di atas neuron DRG naif. Selsel cocultured yang tetap pada titik waktu yang ditunjukkan dengan PHEMO-fix (68 mM PIPA,
25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mMMgCl2, 10% (v / v) DMSO, 3,7% (b / v)
paraformaldehyde (PFA) , 0,05% (v / v) glutaraldehid, 0,5% (v / v) Triton X-100, pH 6,9) pada
suhu kamar selama 10 menit, dan kemudian dicuci selama dua kali 5 menit dengan PHEMObuffer (68 mM PIPA, 25 mM HEPES, 15 mMEGTA, 3 mM MgCl2, 10% (v / v) DMSO, pH 6,9)
selama 5 menit pada 37 C [26, 27]. Fiksatif sisa dipadamkan dengan 50 mMNH4Cl di PBS.
Situs mengikat tidak spesifik dan Fc-reseptor dari GE kompleks / GI dari HSV-1 [28] dilucuti
oleh inkubasi dengan memblokir reagen yang mengandung 5% (w / v) BSA dan 10% (v / v)
manusia HSV-1 seronegatif serum di PBS selama 30 menit. Antibodi diencerkan dalam
menghalangi reagen dan diinkubasi dengan sel dalam ruang dilembabkan selama 30 sampai 60
menit. Antibodi monoklonal yang ditujukan terhadap -tubulin-III (mab5564 mouse, Merck
Millipore, Darmstadt, Jerman) digunakan untuk mengidentifikasi neuron. Antibodi sekunder
untuk mikroskopi imunofluoresensi terhadap tikus yang konjugasi Alexa Fluor (Life
Technologies Gibco). Akhirnya, sampel tertanam dalam pemasangan menengah (6 g gliserol, 2.6
gMowiol 40-88, 6 ml H2O, 12 ml 0.2MTris, pH 8,5) yang mengandung 0,1 g / ml DABCO (1,4Diazabicyclo [2, 2, 2] oktan). Sampel dianalisis dengan mikroskop Zeiss Axiovert 200M
dilengkapi dengan unit laser scanning LSM 510Meta confocal dengan argon (Argon2, 488 nm)
dan helium-neon (HeNe1, 543 nm, HeNe1, 633 nm) laser menggunakan 63x minyak rencanaapochromatic Tujuan -immersion dengan aperture numerik dari 1,4. Gambar diperoleh dengan
Browser Zeiss LSMImage (versi 4.2.0.121), dianalisis dengan ImageJ (Versi 1,45 h, Wayne
Rasband, National Institute of Health, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/) dan diproses dengan
Adobe Photoshop CS4 (Versi 11.0, Adobe Systems Inc, San Jose, CA, USA). Sebuah area
melingkar dari 85 m2 ditempatkan ke pusat neuron, seperti yang diidentifikasi oleh -tubulin-IIIlabel atau sel C127I transfected, seperti yang diidentifikasi oleh ekspresi GFP.

Infeksi kornea pada tikus dan studi desain

7

Tikus dibius dengan injeksi intraperitoneal ketamin hidroklorida (2 mg) dan mepivacaine
hidroklorida (400 ng). Epitel mata kanan menggaruk delapan kali dalam pola silang dan
diinokulasi dengan 1 105PFU dariHSV-1 KOS di media 5l [29]. Tikus yang terinfeksi baik
sistemik atau topikal diperlakukan denganantibodimAb 2c mencit. Pengobatan topikal dilakukan
oleh inokulasi berkala (5 kali per hari) dari mata yang terinfeksi dengan 5 l (28,5 g) solusi
antibodi (tetes mata) mulai 24 jam post infeksi (pi) sampai 7 p.i hari ini. Pengobatan sistemik
dilakukan oleh intravena 300 g mAb 2c atau mAb hu2c 24 jam sebelum infeksi untuk profilaksis
pra pajanan, atau 24, 40, dan 56 jam setelah infeksi pasca pajanan untuk imunoterapi. Perjalanan
penyakit yang ditandai dengan penentuan tingkat keparahan penyakit (skor klinis blepharitis,
cacat epitel dan HSK) dengan mikroskop operasi (Zeiss, Oberkochen, Jerman), masing-masing
pada skala 0 sampai 4, yang konsisten dengan peradangan dari kelopak mata, efek cytopathic
dari sel-sel epitel kornea atau opak kornea dengan neovaskularisasi, edema dan nekrosis [22].
Viral load mata terinfeksi diukur pada hari ke 5 pasca infeksi dengan uji standar plak (N = 6
dalam setiap kelompok) [30]. Sel-sel inflamasi di kornea dihitung seperti yang dijelaskan
sebelumnya [31]. Jumlah sel total dalam limpa dan kelenjar getah bening dihitung setelah
homogenisasi organ dengan saringan sel 70 m (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

Kuantifikasi Sitokin dengan ELISA

Pengeringan kelenjar getah bening(DLN) dan limpa dari mencit yang terinfeksi HSV-1 KOS
yang menerimasalah satu pengobatan antibodi atau PBS dikumpulkan pada hari ke-14 setelah
infeksi.

Setelahorgan-organyangterhomogenisasidan5106seldikulturtiga

ulangandi

hadapan2107PFUUV-tidak aktif HSV-1 KOSatau mediasaja. Setelah24jam, jumlah IL-2

daninterferon(IFN) di supernatan sel yang dihitung dengan ELISA (OptEIA, PharMingen,
Hamburg, Jerman) seperti yang dijelaskan sebelumnya[32].

Floriferasi assay
Antigen dan mitogen diinduksi proliferasi dari splenosit atau sel pengeringan kelenjar getah
bening dinilai melalui aliran cytometry assay berdasarkan seperti yang dijelaskan sebelumnya
[33]. Secara singkat, limfosit terwarnai dengan eFluor 670 (eBioscience, Frankfurt am Main,
Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. 1 105sel / baik dikultur dalam 96 cawan yang
bawahnya bulat dengan media, UV-HSV-1 (2 107 PFU / ml sebelum UV-inaktivasi) atau
Concanavalin A (Biochrom, Berlin, Jerman). Karena pembelahan sel, sel-sel kehilangan setengah

dari fluoresensi dengan masing-masingpembelahan sel. Setelah 4 hari, sel-sel permukaan

bernoda sesuai instruksi pabrik (eBioscience) menggunakan antibodi monoklonal berikut: tikustikus anti-CD4-PE, rat-anti-mouse CD8-FITC, tikus IgG2a kontrol k isotipe FITC, dan tikus
IgG2b K Kontrol isotipe PE. Untuk membedakan antara sel-sel yang layak dan tidak layak, sel
diwarnai dengan 7-AAD menurut instruksi pabrik (BD, Heidelberg, Jerman). Proliferasi dinilai
melalui aliran cytometry (FACSCalibur, BD). Setidaknya 2.000 layak 7-AAD negatif (BD) CD4
+ (eBioscience, Jerman) dan 1000 CD8 + (eBioscience) dimasukkan untuk analisis. Data alirancytometric dianalisis melalui Cytomation Summit Offline V3.1. software (Dako, Hamburg,
Jerman).

Trigeminal ganglia Reaktivasi assay

Untukdeteksiviruslaten, gangliatrigeminal(TG) yang ditanamkan pada hari ke-14setelah infeksi
dan ditanam dengan mono layers sel Vero selama tiga minggu seperti yang dijelaskan
sebelumnya[34]. Untuk mendeteksi efek cytopathic kultur diperiksa pada interval harian.

Kuantifikasi DNA
HSV-1 genom yang diukur dengan real-time PCR seperti yang dijelaskan sebelumnya [11].
Secara singkat, DNA dimurnikan dari ganglia trigeminal dari HSV-1 KOS tikus yang terinfeksi
menggunakan magna Pure LC sistem ekstraksi asam nukleat otomatis (Roche, Penzberg,Jerman)
sesuai dengan instruksi pabrik. Jumlah DNA virus kemudian dihitung dengan real-time PCR
(LightCycler; Roche) menggunakan Artus HSV-1/2 LC PCR Kit (Qiagen, Hilden, Jerman). Batas
deteksi analisis untuk HSV-1-DNA diisolasi dari ganglia trigeminal bertekad untuk menjadi 200
eksemplar / ganglion menurut protokol pabrik.

Pewarnaan Histologi
Untuk analisismikroskop cahaya, mata difiksasi(64% isopropanol, 3,7% formaldehida, 2,5%
asam asetat), dikeringkan dengan isopropanol, dan ditanam dalam parafin seperti yang dijelaskan
sebelumnya[35]. Bagian lima mikro meter kemudian diwarnai dengan hematoxylin-eosin
dandianalisis dengan mikroskop cahaya

Deteksi antibody HSV-specifik pada sera and cairan air mata

Sera (60 l) dan cairan air mata (10 l cairan yang berasal dari mata dibilas dengan PBS) dari HSV1 KOS mencit yang terinfeksi yang dipanen pada hari ke-14 pasca infeksi dan diperiksa untuk
pengikatan terhadap HSV-1 sel yang terinfeksi Vero oleh aliran cytometry seperti yang dijelaskan
9

sebelumnya [11]. Data dianalisis dengan menggunakan Flowjo versi 7.2.5 (Pohon Bintang Inc,
Ashland, OR, USA)

Deteksi sistemik diberikan antibodi manusia di HSV-1 KOS kornea

yang terinfeksi
Untuk menyelidiki apakah antibodi sistemik diterapkan dapat mencapai kornea terinfeksi, kami
memeriksa bagian jaringan kornea dari HSV-1 KOS tikus

yang terinfeksi setelah injeksi

intravena mAb hu2c oleh imunofluoresensi. Oleh karena itu, tikus korneanya terinfeksi seperti
dijelaskan di atas dan dosis tunggal 300 g mAb hu2cantibodimanusia itu disuntikkanintravena 48
jam pasca infeksi. Tikus kontrol menerima PBS. Enam jam kemudian mata telah dihilangkan dan
dibekukan dalam nitrogen cair. Mata beku yang tertanam dalam media jaringan-Tek O.C.T.
(Sakura, Alphen aan den Rijn, Nederlands) dan dipotong (7 m) dengan Frigocut 2800 mikrotom
(Reichert-Jung, Nussloch, Jerman). Bagian beku dikeringkan selama 30 menit, tetap dengan
didinginkan aseton selama 10 menit dan diinkubasi dengan mencegah penyangga (10% FCS di
PBS) selama 15 menit. Selanjutnya, bagian kornea yang terwarnai secara bersamaan untuk HSV1 infeksi dan terikat mAb hu2c dengan poliklonal anti-HSV 1 FITC antibodi kambing
terkonjugasi (Bethyl laboratorium, Montgomery, USA) dan antibodi sekunder IgG kambing Cy3terkonjugasi anti-manusia(Invitrogen, Darmstadt, Jerman). Inti diwarnai dengan Hoechst
(Hoechst 33342, 1 g / ml; Sigma, St. Louis, MO) selama 5 menit sesuai dengan protokol pabrik.
Gambar imunofluoresensi diperoleh dengan fluoresensi mikroskop Zeiss Observer Z1 dengan
perbesaran 200 kali lipat

Analisa Statistik
Data dianalisis dengan menggunakan Graph Pad Prism5(GraphPad PrismSoftware, LaJolla, CA,
USA). Analisis statistik dilakukandengannonparametrikANOVA(Kruskal-Wallis) da npost hoc
Dunn beberapa tes perbandingan atau parametrik ANOVA(analisis satu arah)danpost hocTukey's
beberapa perbandingan tes. Perbedaan antara jumlah yang terinfeksi secara laten ganglion
trigeminal dan jumlah ganglion trigeminal menunjukkan reaktivasi diperiksa dengan uji eksak
Fisher. Perbandingan dianggap signifikan pada P<0,05

HASIL
Netralisasi efektif HSV-1 KOS dan isolat klinis ACV resisten
10

Penyebaran Sel ke sel sangat penting untuk propagasi virus dalam kulit dan selaput lendir serta
untuk transmisi dari sel epitel ke neuron sebelum retrograde transportasi ke trigeminal dan
ganglia akar dorsal, dan juga untuk transmisi dari neuron ke epitel sel setelah Oleh karena itu
reaktivasi dan transportasi anterograde. Kamimenandai khasiat antivirus dari HSV-gB spesifik 2c
mAb antibodi monoklonal terhadap HSV-1 KOS dan tiga asiklovir isolat klinis tahan diperoleh
dari pasien dengan HSK [10] .MAb 2c sepenuhnya dinetralkan viral load yang sama 100
TCID50 dari virus diuji pada konsentrasi 7,8 nM atau 15,6 nM (data tidak ditampilkan). Hal ini
terkait dengan efisiensi netralisasi yang mAb 2c dipamerkan untuk obat lainnya sensitif HSV-1
strain dan isolat resisten obat yang diperoleh dari transplantasi sumsum tulang [11]. Seperti strain
HSV lainnya, patogen matastrain HSV-1 menyebarkan oleh sel ke sel penyebaran menghindari
pertahanan kekebalan tubuh inang [5] .Kami karena menganalisis pengaruh mAb 2c pada
penyebaran sel ke sel dari HSV-1 KOS. Berbeda dengan imunoglobulin manusia (Gambar. 1,
baris atas), mAb 2c terbatas infeksi virus ke sel-sel yang terinfeksi awalnya (Gbr. 1, baris
bawah). Hasil kami menunjukkan bahwa 500 nM (75 g / ml) dari 2c mAb cukup untuk
penghambatan lengkap dari sel ke sel menyebar. Hasil ini konsisten dengan penelitian
sebelumnya kami dengan HSV-1 F [11].
Untuk menentukan apakah mAbs 2c dan hu2c mampu menghambat rute langsung dari transmisi
antara epitel dan neuron, baik neuron yang tidak terinfeksi adalah co-kultur dengan sel yang
terinfeksi epitel (penyebaran sel epitel -neuron) atau neuron yang terinfeksi adalah co-kultur
dengan sel-sel epitel yang tidak terinfeksi (penyebaran neuron-ke-sel epitel ) dengan adanya atau
tidak adanya antibodi yang ditunjukkan atau pooled IgG manusia sebagai kontrol. Untuk
menguji penghambatan sel-neuron menyebar, dipisahkan murine DRG yang dilapis dengan HSV1 (17 +) Lox-Che terinfeksi sel C127I yang telah diobati dengan baik dikumpulkan manusia IgG
(Gbr. 2C), mAb 2c (Gbr. 2D ), manusiawi mAb 2c (Gbr. 2E) atau yang pura-pura diperlakukan
(Gambar. 2B) sebagai kontrol. Kuantifikasi sel ke sel penyebaran ditampilkan sebagai total
tingkat fluoresensi yang disebabkan oleh HSV-infeksi (Gbr. 2F). Untuk penyelidikan
penghambatan sel neuron-to-disebarkan oleh mAbs 2c dan hu2c setup berlawanan digunakan
(Gbr. 2G-L). Dengan demikian, neuron DRG terinfeksi HSV-1 (17 +) Lox-Che dan dilapis
dengan GFP transfected sel C127I yang diobati dengan antibodi yang ditunjukkan. SementaraHSV 1 ditularkan dari sel yang terinfeksi C127I (panah pada Gambar. 2) ke neuron (panah pada
11

Gambar. 2) dengan tidak adanya antibodi (Gbr. 2B) atau dengan adanya IgG manusia
dikumpulkan (Gbr. 2C) , penambahan mAb 2c (Gambar. 2Dii) atau manusiawi mAb hu2c
(Gambar. 2Eii) sepenuhnya menghambat penyebaran sel-neuron seperti yang ditunjukkan oleh
kurangnya neuron primer mengekspresikan mCherry. Demikian pula, sel ke sel menyebar dari
neuron yang terinfeksi ke sel C127I ditandai dengan ekspresi GFP benar-benar dihambat oleh
mAb 2c (Gambar. 2Jiv) atau hu2c (Gambar. 2Kiv). IgG manusia sebagai kontrol tidak
berdampak pada penularan virus dalam percobaan ini (Gambar. 2Iiv). Secara bersama-sama hasil
kami menunjukkan bahwa mAb 2c menengahi netralisasi virus yang efektif dan penghambatan
transmisi sel ke sel mata-patogen HSV-1 strain.Selanjutnya, mAb 2c serta manusiawi mAb
antibodi hu2c yang mampu menghambat transmisi HSV antara sel-sel dan neuron primer.

Pencegahan penyakit kornea pada tikus oleh aplikasi antibodi

sistemik
Berdasarkan sifat unik dari antibodi ini, kami meneliti khasiat antivirus pengobatan mAb 2c
topikal atau sistemik pada perjalanan penyakit tikus BALB / c yang korneanyaterinfeksi dengan
1 105 PFU HSV-1 KOS. Antibodi ini diterapkan topikal atau sistemik. Empat belas hari setelah
infeksi, sembilan dari sepuluh kornea dari kelompok kontrol menunjukkan gejala HSK dengan
nekrosis parah dan ulserasi, disertai dengan kelopak mata yang sangat bengkak dan meradang
(Gambar. 3 dan 4A). Epitel kornea mata ini menunjukkan lesi epitel, mencerminkan sitolisis
virus pada tahap awal, dan kerusakan jaringan dan ulserasi pada tahap akhir penyakit (Gambar. 3
dan 4A), sedangkan refleks mata-blink bisa lagi induksi. Dengan demikian, peningkatan jumlah
sel inflamasi, terutama polimorfonuklear (PMN) dan sel mononuklear, ditemukan di kornea
sentral (Gbr. 5). Jumlah rata-rata sel inflamasi infiltrasi kornea sentral dalam kelompok kontrol
adalah c = 238,5 / grid (Gbr. 5). Sebaliknya, perkembangan penyakit kornea HSV dimediasi
sepenuhnya dibatalkan oleh aplikasi antibodi sistemik bila diterapkan sebagai profilaksis atau
pengobatan pasca-paparan. Rata-klinis blepharitis, cacat epitel dan HSK secara signifikan (P
<0,05) menurun (Gambar. 3). Semua tikus sistemik diobati menunjukkan kelopak mata yang
normal dengan hampir tidak ada peradangan. Dengan demikian, infiltrasi

12

kornea oleh sel inflamasi tidak diamati (c = 0 / grid;.. Gambar 4 dan Gambar 5), dan refleks
mata-blink masih utuh, mirip dengan kornea terinfeksi (data tidak ditampilkan). Dari catatan,
aplikasi topikal dari mAb 2ctidak efek menguntungkan pada perkembangan penyakit kornea
(Gbr. 3). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam tingkat infiltrasi sel antara kelompok
kontrol (c = 238,5 / grid) dan kelompok topikal diperlakukan (c = 137,7 / grid) ditemukan (Gbr.
5). Kesimpulannya, hasil ini menunjukkan sukses mencegah penyakit kornea HSV yang
dimediasi pada aplikasi 2c mAb sistemik. Ada juga bukti kuat bahwa antibodi dioleskan tidak
berpengaruh pada terapi.

Pengaruh pengobatan mAb2c pada reaksi imun anti HSV

Secara signifikan menurun reaksi inflamasi dan infiltrasi sel dalam kornea tikus sistemik diobati
mengarah pada asumsi bahwa mAb 2c juga dapat mempengaruhi respon imun sistemik setelah
infeksiHSV-1. Untuk menyelidiki lebih lanjut ini, kami memeriksa nomor jumlah sel dalam
pengeringan kelenjar getah bening (DLN) dan limpa, dan HSV-1 titer antibodi spesifik dalam
serum

dan

cairan

air

mata

tikus

pada

hari

ke-14

pasca

infeksi.

13

Sesuai dengan pengamatan klinis, DLNs tikus kontrol atau tikus menerima pengobatan topikal
terilhat perkembangan nya secara mencolok. Total jumlah sel di DLNs yang 3,1 10 7 8,7 106
(kontrol) atau 3,5 107 9.2 106 (pengobatan topikal) masing-masing yang secara signifikan
lebih tinggi bila dibandingkan dengan tikusdiobatisistemik (profilaksis: 1,3 10 71,0 x 106;
terapi: 1,0 107 3,7 x 106) (Gambar 6A). Perbedaan ini tidak diamati dalam limpa tikus dari
kelompok yang berbeda

14

(Gambar. 6B). Secara signifikan titer antibodi rendah ditemukan di sera dan air mata cairan tikus
diobatisistemik jika dibandingkan dengan kontrol atau kelompok perlakuan secara topikal
(Gambar. 6C dan D). Tidak ada antibodi HSV-spesifikyang terdeteksi dalam cairan air mata tikus
diobatisistemik. Sebaliknya, kadar antibodi serupa ditemukan dalam cairan air mata topikal yang
diobati dan tikuskontrol. Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa baik respon imun
seluler dan humoral terhadap HSV-1 jelas menurun setelah aplikasi 2c mAb sistemik.

Berkurangnya respon imun spesifik HSV-1 pada tikus yang diobati

secara sistemik
Jumlah sel menurun di pengeringan kelenjar getah bening dari mAb 2c tikus perlakuan
menunjukkan bahwa rute sistemik aplikasi mungkin mengurangi respon imun seluler HSV-1
spesifik. Untuk menentukan peran CD4 + dan CD8 + limfosit setelah terapi antibodi analisis
berikutnya respon sel T dilakukan. Respon proliferatif dari splenosit atau DLN-limfosit setelah
stimulasi dengan antigenHSV-1 menunjukanrespon imun spesifik terutamaHSV-1 didorong oleh
sel CD4 + T (Gbr. 7). Sel CD4 + T proliferasi meresponsecara nyata berkurang ketika tikus

15

diobatisistemik dengan mAb 2c (Gbr. 7). CD4 + Type-1 T limfosit (Th1) terutama mensekresi
interleukin 2 (IL-2) dan IFN- ditunjukkan untuk terjadinya immunopatologi dalam perjalanan

penyakit kornea [36-38]. Untuk menyelidiki apakah pengobatan mAb 2c mempengaruhi sekresi
IFN- dan IL-2, kita perlakukan 5 tikus BALB / c dengan 300 g mAb 2c atau PBS oleh intravena
injeksi 24 jam sebelum infeksikornea HSV-1 KOS. Setelah 14 hari kami menganalisis produksi
sitokin limfosit yang diisolasi dari pengeringan kelenjar getah bening atau limpa setelah
stimulasi dengan-tidak aktif UV HSV-1 KOS. Sekresi IFN- dan IL-2 berkurang secara signifikan
di DLN-limfosit dan splenosit diisolasi dari tikus diobatisistemik dengan mAb 2c (Gbr. 8).
Secara bersama-sama, hasil ini mengkonfirmasi bahwa mAb 2c secara signifikan mengurangi
respon HSV-1spesifik CD4 + T pada tikus yang diobatisecara sistemik.

Efektifitas Netralisasi HSV-1 oleh mAb2c ditempat infeksi

Untuk menyelidiki apakah pengobatan topikal atau sistemik dengan mAb 2c dapat menurunkan
viral load di tempat infeksi, kita isolasi mata awalnya terinfeksi dari 6 tikus perwakilan dari
masing-masing kelompok pada hari ke 5 setelah infeksi dan memeriksa konten virus
menggunakan alat tes plak standar. Sistemik diterapkan mAb 2c dimediasi pengurangan
substansial dari HSV-1 di mata terinfeksi (Gambar. 9). Penurunan besar viral load diamati pada
tikus yang menerima dosis tunggal 300 g mAb 2c 24 jam sebelum infeksi. Terlihat penurunan
yang signifikan dari viral load terdeteksi pada tikus yang menerima tiga dosis terapi (300 g) dari

16

mAb 2c, mulai 24 jam setelah infeksi (Gbr. 9). Dalam kelompok ini virus benar-benar tersingkir
di 5 dari 6 tikus. Sebaliknya, tidak ada pengurangan dari titer virus diamati pada tikus yang
diobati dengan mAb 2c mengandung tetes mata. Hasil ini jelas menunjukkan bahwa mAb 2c
efektif mengurangi HSV-1 di situs kornea infeksi bila diterapkan secara sistemik. Hasil ini
konsisten dengan perjalanan penyakitdan menunjukkan bahwa efektifitas netralisasi virus
mungkin penting untuk pencegahan HSK.

Efektifitas Pengurangan penyebaran virus dan reaktivasi dari TG

dim Ab2c pada mencit perlakuan
Tingkat keparahan penyakit kornea sangat berkorelasi dengan frekuensi reaktivasi HSV dari
pada pasien terinfeksi HSV laten. Dilihat dalam konteks ini, kita hipotesis bahwa membatasi
penyebaran virus HSV ke neuron anatomis terkait di mana virus maka biasanya menetapkan
latency mungkin memiliki efek menguntungkan pada terjadinya reaktivasi. Akibatnya, kita
menyelidiki apakah mAb 2c mampu menghambat penyebaran virus HSV ke ganglia trigeminal
oleh uji virus reaktivasi. Oleh karena itu, ganglia trigeminal diisolasi dari situs ipsilateral dan
kontralateral mata terinfeksi pada hari ke-14 setelah infeksi.

17

Ganglia yang co-kultur dengan sel Vero selama tiga minggu, dan dimonitor untuk reactivations
virus. Pemulihan HSV-1 diamati pada semua ipsilateral dan kontralateral TG terisolasi dari tikus
kelompok kontrol (10/10). Pada tikus diobatitopikal, virus diaktifkan kembali itu sama
ditemukan di 10/10 dari ipsilateral TG dan 8/10 dari kontralateral TG, mengungkapkan tidak ada
perbedaan yang signifikan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sebaliknya, secara
sistemik diterapkan mAb 2c signifikan membatasifrekuensireaktivasi virus dari ganglia
trigeminal. Meskipun virus dapat diaktifkan dari 10 dari 10 (profilaksis) atau 9 dari 10 (terapi)
ganglia ipsilateral, tidak ada virus pengaktifan ditemukan di situs kontralateral dari infeksi.

18

Data ini menunjukkan penghambatan efektif virus menyebar dari ipsilateral ke ganglia
kontralateral (Gbr. 10A). Untuk memverifikasi temuan kami mengulangi percobaan ini (5 tikus
masing-masing kelompok) dalam kondisi yang sama dan dihitung DNAHSV-1 dari ganglia
trigeminal. Tidak ada HSV-DNA dapat dideteksi pada ganglia kontralateral tikus 2c diperlakukan
secara sistemik mAb. Sebaliknya, HSV-DNA terdeteksi pada 5/5 ipsilateral dan kontralateral 4/5
ganglia pada kelompok kontrol PBS (Gambar.10C).
Menariknya, percobaan reaktivasi mengungkapkan tidak ada perbedaan antara kelompok yang
menerima mAb 2c sebelumnya atau post infeksi. Namun, penularan virus ke TG mata yang
terinfeksi tidak dapat dicegah pada tikus yang terinfeksi dengan dosis tinggi (1 10 5 PFU) dari
HSV-1 KOS. Untuk menyelidiki apakah penyebaran virus ke ipsilateral TG dapat benar-benar
dihambat oleh mAb 2c dalam infeksi HSV dosis rendah, 5 tikus per kelompok terinfeksi dengan
dosis menurun virus (105, 104 atau 103 PFU) dari HSV-1 KOS 24 jam setelah intravena
19

penerapan 300 g mAb 2c. Mengaktifkan virus dari ipsilateral TG dapat dideteksi pada 5/5 atau
2/5 tikus yang tidak diobati terinfeksi 104 atau 103 PFU HSV-1 KOS. Sebaliknya, frekuensi
virus mengaktifkan itu nyata berkurang pada tikus secara diobatisistemik dengan mAb 2c. Virus
mengaktifkan dapat dideteksi pada 3/5 tikus yang terinfeksi dengan 104 PFU HSV-1 KOS, dan
tidak ada reaktivasi diamati dari ganglia tikus yang terinfeksi dengan 10 3 PFU HSV-1 KOS (Gbr.
10B). Hasil ini menunjukkan bahwa penularan virus dari pinggiranke ganglia trigeminal
mungkin dihambat oleh mAb 2c dalam infeksi virus tergantung dengan dosis.

Pencegahan HS Koleh antibodi manusia mAbhu2c

Berkaitan dengan aplikasi klinis masa depan antibodi monoklonal HSV-gB spesifik pada
manusia untuk pencegahan HSK, kami kemudian meneliti efek perlindungan dari varian
antibodimanusia ini (mAb hu2c) di corneatikus yang terinfeksiHSV-1. Karena rute topikal
aplikasi tidak menunjukkan efek perlindungan pada perkembangan penyakit kornea, hanya
aplikasirute sistemik diselidiki untuk mAb hu2c. Tikus terinfeksi dengan HSV-1 KOS dan
sistemik diobati dengan mAb hu2c sebelum pasca infeksi HSV-1 seperti yang dijelaskan di atas
untuk antibodi tikus tua. Antibodi manusia terbukti sama-sama efektif dalam pencegahan HSK
jika dibandingkan dengan antibodi tikus. Gejala yang menyertai dari HSK (blepharitis, cacat
epitel dan HSK) secara signifikan (P <0,05) menurun pada tikus secara sistemik diobati dengan
mAb hu2c, dibandingkan dengan kontrol (Gambar. 11). Semua tikus yang diobati menunjukkan
kelopak mata yang normal dengan hampir tidak ada peradangan. Mata-blink refleks masih utuh
dan mirip dengan kornea terinfeksi (data tidak ditampilkan). Secara bersama-sama, baik antibodi
20

tikus tua serta varian manusiawi yang menunjukkan efek perlindungan yang sama pada
pengembangan HSK dan kebutaan pada model tikus yang sangat relevan.

Deteksi sistemik diberikan mAbhu2c dikornea terinfeksi

Tidak adanya antibodi HSV-spesifik dalam cairan air mata tikus diobati secara sistemik
menunjukkan bahwa adanya antibodi dalam cairan air mata mungkin tidak berdampak pada
perkembangan penyakit. Namun, mengurangi viral load di mata tikus diobati secara sistemik
menunjukkan bahwa antibodi disuntikkan mungkin menetralisir virus. Untuk mengklarifikasi
apakah sistemik diterapkan mAb hu2c benar-benar dapat mencapai jaringan kornea
menunjukkan aktivitas antivirus, kami memeriksa bagian kornea berasal dari HSV-1 KOS
terinfeksi tikus intravena disuntikkan dengan mAb hu2c di infeksi pasca 48 jam oleh
imunofluoresensi. Mata diisolasi dan dipotong enam jam setelah injeksi untuk memungkinkan
antibodi untuk berdistribusi ke jaringan kornea. Antibodi manusia terdeteksi pada kornea
terinfeksi HSV ketika colocalized dengan antigen HSV. Sebaliknya, tidak ada antibodi dapat
dideteksi pada kornea terinfeksi, termasuk fluoresensi mengikat atau latar belakang tidak spesifik
(Gbr. 12).Hasil ini memberikan bukti untuk distribusi sukses mAb hu2c ke kornea terinfeksi.

21

Diskusi
Meskipun kemajuan medis yang sangat besar selama dekade terakhir, herpes stroma Keratitis
masih tetap menjadi penyebab utama kebutaan kornea menular. Sampai saat ini, tidak ada vaksin
yang efektif yang tersedia [39, 40]. Penggunaan obat-obatan antiviral tersebar luas, tetapi
terbatas karena toksisitas dan resistensi virus [41]. Meningkatnya prevalensi asiklovir dan
multidrug resistant strain HSV (6,4%) di antara pasien dengan HSK adalah penyebab utama
kegagalan terapi inflamasiInfeksi HSV kornea [8, 42]. Penggunaan antibodi monoklonal untuk
pencegahan infeksi HSV kornea yang luas dibahas dalam penelitian sebelumnya [7, 43-47].
Antibodi monoklonal yang ditujukan terhadap HSV glikoprotein gB, gC, gD, dan GE
22

menunjukkan efek menguntungkan pada tingkat keparahan penyakit kornea pada tikus di bekas
penelitian [44]. Meskipun perlindungan terbatas dari HSK juga bisa diamati pada tikus yang
diobati dengan non-antibodi monoklonal spesifik untuk HSV-1 gC, efek terapi terbaik bisa
dicapai pada tikus diobati dengan antibodi monoklonal menetralkan Fd79 dan mAb 8D2, khusus
untuk glikoprotein gB dan gD, masing-masing [7, 43, 44]. Meskipun demikian, pretreatment
antibodi bahkan tidak diselidiki (Fd79) atau gagal (mAb 8D2) untuk mencegah perkembangan
kekeruhan kornea [43]. Sampai saat ini, tidak ada antibodi ini selanjutnya dilaporkan untuk
penggunaan klinis.

23

Konsisten dengan temuan bahwa beberapa vaksin HSV eksperimental yang protektif pada model
binatang tetapi tidak pada manusia, studi terbaru menunjukkan bahwa kualitas respon
imunhumoral terhadap HSV signifikan berbed antara manusia, marmut da nmencit .Ketika
vaksin rekombinan gD sangat menginduksi antibodi pada model binatang, respon netralisasi
hanya lemah yang terdeteksi dalam vaksin manusia. Sebagian besar antibodi manusia gDspesifik tidak efisien bersaing dengan epitop gD terlihat sangat oleh antibodi monoklonal berasal
dari mencit[48]. Hasil ini menunjukkan bahwa mencit mampu meningkat respon antibodi lebih
kuat terhadap HSV dari manusia. Terhadap latar belakang ini, evaluasi antibodi netralisasi tikus
ampuh untuk penggunaan klinis masa depan tampaknya merupakan strategi yang menjanjikan
untuk memerangi infeksi HSVparah.
Karena kebutuhan klinis bertahan untuk mengatasi resistan terhadap obat HSV-infeksi, kami
baru-baru memanusiakan para gB spesifik antibodi monoklonal mAb 2c yang mampu
menetralkan ACV dan isolat resisten multi-dari sumsum tulang pasien transplantasi in vitro dan
dalam NOD sangat imunosupresi / model tikus SCID [11]. The manusiawi mAb antibodi hu2c
dan antibodi tikus orangtua keduanya mengakui epitop yang sama yang sangat kekal antara
HSV-1 dan HSV-2 dan penting untuk kebugaran virus. Mutasi dalam kedua subdomain epitop
mengakibatkan kerugian dramatis infektivitas [13]. Kedua antibodi menunjukkan sifat penetral

24

sama terhadap HSV-1 dan HSV-2, secara independen dari pelengkap atau fungsi efektor sel
antibodi-bergantung[15].
Dalam penelitian ini kami pertama kali meneliti khasiat antivirus dari 2c mencit mAb dalam
pencegahan kornea HSV-infeksi dalam model mencit mapan HSK. Selanjutnya kami fokus pada
dampak pengobatan antibodi pada tingkat respon imun terhadap HSV yang berhubungan dengan
keparahan disease.With hormat kornea untuk aplikasi klinis masa depan, kami akhirnya
melakukan investigasi apakah varian mAb hu2cmanusia mencegah HSK sebanding dengan
antibodi tikus tua.

Pencatatan antibodi sistemik menghasilkan perlindungan total tikus dari HSV-1 KOS diinduksi
tanda-tanda seperti blepharitis, cacat epitel atau HSK setelah profilaksis atau pascapaparan
pengobatan. Namun, administrasi antibodi sistemik tampaknya penting untuk pencegahan efektif
25

HSK, karena aplikasi topikal berulang mAb 2c tidak efektif. Kelompok-kelompok lain juga telah
melaporkan kegagalan pengobatan antibodi topikal dalam pencegahan HSK [43]. Mekanisme di
balik temuan ini masih kontroversial. Hal ini umumnya percaya bahwa antibodi melindungi
dengan menetralkan virus ekstraseluler, menghambat penularan virus langsung antara sel yang
berdekatan atau dengan mediasi lisis sel yang terinfeksi virus [43]. Untuk mengerahkan
netralisasi virus, antibodi harus mencapai jaringan kornea terinfeksi. Sistemik antibodi
diterapkan ditemukan untuk masuk ke jaringan kornea oleh difusi IgG plasma dari pembuluh
darah perifer dan pameran menetralkan aktivitas [49, 50]. Sebaliknya, pemberian topikal antibodi
tidak efektif, kemungkinan besar karena antibodi IgG dengan berat molekul 149 kDa memiliki
kapasitas terbatas untuk menembus kornea normal dan dengan demikian gagal untuk
menetralkan virus [50, 51]. Namun, rute topikal administrasi kurang invasif dan mungkin lebih
baik ditoleransi bila dibandingkan dengan aplikasi sistemik. Antibodi Fab fragmen (50 kDa) atau
fragmen rantai tunggal (26 kDa) kurang konstan-daerah domain dari seluruh antibodi yang relatif
kecil dan mampu menembus kornea [52]. Baru-baru ini, sebuah fragmen antibodi Fab (AC-8)
khusus untuk HSV glikoprotein D telah digunakan secara topikal untuk mencegah HSK.
Sebenarnya, pengobatan dengan AC-8 sedang mengurangi nilai penyakit mata, tapi tidak efektif
sebagai terapi standar dengan trifluorthymidine [41]. Namun demikian, Fab fragmen berasal dari
mAb 2c IgG hampir tidak efektif dalam virus netralisasi, karena bivalensi adalah penting untuk
fungsi yang tepat [11]. Oleh karena itu, penelitian selanjutnya dengan mAb rekombinan turunan
2c jelas diperlukan untuk mengembangkan konstruksi antibodi yang sesuai untuk aplikasi
topikal.

26

HSK telah terbukti memiliki asal immunopathological inflamasi [53]. Mekanisme yang tepat
dimana antibodi monoklonal spesifik untuk HSV glikoprotein memberi efek protektif pada
pengembangan HSK masih belum diketahui. Beberapa pengamatan menunjukkan bahwa
antibodi mencegah penyakit kornea lebih efektif bila dibandingkan dengan antibodi non
neutralizing [7]. Sebaliknya, penetral antibodi spesifik untuk glikoprotein D yang efektif
mencegah HSK tidak berdampak signifikan pada beban virus di mata [43]. Antibodi diselidiki
dalam penelitian ini secara efektif dinetralkan HSV-1 di mata. Hasil ini menunjukkan bahwa
netralisasivirus sebenarnya bukan satu-satunya mekanisme yang terlibat dalam pencegahan
penyakit kornea. Namun, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa antibodi HSVspesifik dapat melindungi terhadap HSK dengan menghambat produksi kemokin diyakini untuk
meminisiasi inflamasirespon imun terhadap HSV [45]. Sesuai dengan temuan ini, keterbatasan
sel infiltrasi ke kornea, pengurangan jumlah total sel dalam pengeringan,kelenjar getah bening
mengurangi respon sel CD4 + T dan tingkat antibodi berkurang secara signifikan dalam cairan
air mata dan sera tikus diobatisecara sistemik menunjukkan bahwa mAb 2c juga dapat
melindungi dari HSK oleh penurunan yang signifikan dari respon imun. Kemungkinan besar,
bertanggungjawab berkurangnyakekebalan merupakan konsekuensi dari netralisasivirus oleh
mAb 2c. Khususnya, T-sel yang bertanggungjawabpada infeksiHSV-1 memainkan peran penting
dalam inisiasi kerusakan jaringan dalam kornea. Neutrophiles dan monosit juga menyusup
kornea dan terlibat dalam patogenisitas [30, 45]. Ada bukti substansial bahwa T limfosit-tipe 1
(Th1) terutama mensekresi interleukin 2 (IL-2) dan interferon (IFN) - bersifat patogen dalam
evolusi penyakit kornea, karena netralisasi IL-2 dan IFN- hasil dari remisi pada HSK [36-38,
54]. Sebaliknya, Th2 sitokin terkait IL-4 dan IL-10 menekan perkembangan HSK [22].
Hal ini umumnya diterima bahwa pengembangan dan perkembangan HSK sangat tergantung
pada frekuensi HSV reaktivasi [55, 56]. Antibodi menghambat penyebaran saraf melalui
transmisi sel ke sel secara signifikan dapat mengurangi frekuensi reaktivasi dan dengandemikian
memiliki dampak berkelanjutan pada munculnya HSK [56]. Meskipun mekanisme secara tepat
dari transportasi DNA virus atau melepaskan dari akson masih belum diketahui, beberapa
pengamatan juga menunjukkan bahwa antibodi bisa langsung mengganggu aksonal HSV-1
menyebar in vitro ke in vivo [57, 58]. Dalam penelitian ini kami menunjukkan bahwa mAb 2c
dan kedua bagian manusia, baik yang mampu mengganggu transmisi sel ke sel antara sel-sel
epitel dan neuron. Selain itu, kami menemukan bahwa pengobatanmAb 2c sistemik terbatas
27

pembentukan laten ke ganglion trigeminal ipsilateral, menunjukkan bahwa penyebaransaraf

sepanjang

serabut

saraf

ke

ganglion

kontralateral

terputus.

Akhirnya, pengobatan sistemik dengan antibodi mAbhu2c manusiadimediasi perlindungan yang

sama dari pengembangan HSK jika dibandingkan dengan antibodi mencit. Hal ini berkorelasi
dengan hasil dari studi sebelumnya di mana kedua antibodi menunjukkan aktivitas antiviral yang
sama di bawah kondisi imunosupresi [11, 15].
Kesimpulannya, kami telah menunjukkan bahwa antibodi monoklonal mAb2 cefektif
menetralkan isolat ACV resisten daripasien dengan sering infeksi berulang korneain vitro, dan
mencegah perkembangan HSK pada tikus. Selain itu,varian mAbhu2c manusia mencegah
perkembangan HSK dengan khasiat yang sama bila dibandingkan dengan antibodi orangtua.
Fitur-fitur ini menjamin perkembangan klinis antibodi ini untuk pengobatan dan pencegahan,
infeksi kornea yang resistan terhadap obat yang parah pada pasien.

28