Sarah Nurainina

Faridah Tsuraya

1512 100 017

1512 100 051

Resume Journal berjudul Isolation of Heterotrophc Thiosulfate-Oxidizing Bacteria and Their Role
in a Conservation Tidal Flat in the Ariake Sea, Japan
Pendahuluan
Laut Ariake adalah laut semi tertutup yang mempunyai sedikit kontak dengan lautan terbuka
untuk pergantian dan demikian rentan untuk pergantian lingkungan. Penurunan substansi populasi
keberadaan bentik yang disebabkan emisi sulfida telah dilaporkan. Sulfide secara normal terpancar dari
bagian anoxic dari tidal flat dekat bagian permukaan dari sedimen lumpur. campuran yang dikeluarkan
oleh SRB (sulfate reducing bacteria) seperti buangan produk metabolic dari respirasi anaerobik dengan
campuran organik dengan sulfate yang disuplai oleh air laut selama pasang tinggi. Jumlah sedikit dari
sulfide bereaksi dengan keberadaan metal dan ditempatkan di sedimen, ketika jumlah besarnya diremove
oleh oksidasi biologi. Sulfide dioksidasi untuk elemen sulfur atau sulfate oleh bermacam sulfur oksidasi
bacteria (SOB) yang hidup di pasang surut flat. Bacteria adalah organisme kunci yang merespon untuk
oksidasi campuran sulfur inorganik. Informasi awal tentang bakteria yang mendiami tidal flat telah
dilaporkan. Mereka mensurvei keberagaman dan kelimpahan populasi bakteria dari GENE 16S Rrna.
Tujuan dari penelitiaan, mereka mengisolasi SOB heterotrof dari Tidal flat Midorikawa dan meneliti
hubungan di oksidasi thiosulfate dan sulfide. Thiosulfate digunakan untuk mengisolasi mengenai
stabilitas dan kelimpahan di tidal flat. Aturan SOB heterotrof di siklus sulfur akan didiskusikan.
Material dan Methods
Deskripsi tempat Sampling
Tidal flat midorikawa adalah bagian dari estuari midorikawa yang berlokasi di bagian barat prefecture
kumamoto, pulau kyushu jepang. Di estuary, air tawar dari sungai midorikawa bertemu air laut dari laut
semi tertutup Ariake. Selama pasang rendah, lumpur menjadi terekspos dan beberapa burung migrasi
pencari makan dan beberapa hewan seperti mudskippers dan kepiting dapat diamati.
Sampling dan prosedur isolasi
Sedimen atas 2 cm yang disampel, dimasukkan 50 mL polypropylene falcon conical tube (BD Bioscience
Durham, NC USA) selama pasang rendah di Juni 2013. Tabung sampling dijaga dalam keadaan dingin
selama perjalanan ke laboratorium dan disimpan di 4 OC sebelum inokulasi. Thiosulfate mineral (TM)
liquid medium digunakan untuk kesuburan medium untuk menumbuhkan sulfur oksidasi bakteria. TM
medium disiapkan dengan (per liter) : 1 g NH 4Cl, 0,1 g CaCl2, 2H2O, 10 g NaCl, 0,5 g KH 2PO4, 2 g
K2HPO4, 0,8 g MgSO4 7H2O, 3 g Na2S2O3 5H2O didistilasi dan 2ml dari 05 % phenol red sebagai
indikator Ph. 3 Campuran pertama dikombinasi dengan 1 ml trace metal solustion dan diautoclav di
121OC untuk 20 menit dan disubsekuen campuran dan ditambah setelah disetriliasi filter melalui cellulose
acetate membrane filter. Terakhir PH medium disesuaikan menjadi 7.3. sampel sedimen 3 g ditansfer ke
100 ml TM medium di 300 mL botol kerucut. Botol inokulasi diisi dengan kapas steril dan diinkubasi
aerob di 30OC pada rotary shaker pada 120 rpm. Inkubasi berakhir ketika Ph kultur liquid memulai untuk
di bawah 7. Kultur liquid lalu diperlakukan ke serial dilution sebelumnya untuk disebarkan ke TM
medium plate yang berisi 1,5% agar dan 0.02% ekstrak yeast. Piring Inokulasi diinkubasi di 30 OC untuk
7 hari di bawah kondisi aerob. Morfologi koloni jelas dipilih dan distreak ke TM piring medium dan
diinkubasi di bawah kondisi yang sama.

Karakterisasi oksidasi thiosulfate

Tabung gelas diisi dengan 2 layer agar medium dan masing-masing 10 ml. Layer bawah diisi 1% agar
dan 400 ul 10% Na2S ketika atasnya berisi TM medium dengan 0,05% agar, 0,1 % NaHCO3 dan 0,02%
ekstrak yeast. Thiosulfate dihilangkan dari medium meninggalkan sulfide yang menyediakan satu-satunya
sumber energi. Na2S solution ditambahkan di tabung sebelum agar di bawahnya tercampur. Ketika agar
bawah diubah ke solid, 0.5 ml cell suspensi di 1% garam solution ditransfer ke situ. Lalu terkover oleh
medium agar layer atas. Tabung inokulasi diinkubasi aerob di 30 Oc. Eksperimen direplikasi 2 kali dan
sebagai kontrol, inkulasi medium tanpa Na2S dan steril medium dengan Na2S disipakan.
Amplifikasi PCR partial gen 16 S Rrna
Single koloni isolasi terpurifikasi diambil dari medium agar menggunakan steril toothpick dan ditransfer
langsung ke PCR reaction mixture sebagai template. Bakteri umum primernya 27F
(5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) dan 518R (5-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3) dan amplitaq
gold digunakan untuk amplifikasi bagian 16S gen rRna. PCR ditunjukkan dengan T Gradien Biometra
Thermocycler di bawah mengikuti kondisi. Initial denaturasi pada 95 OC untuk 5 menit diikuti oleh siklus
25 denaturasi pada 95oc untuk 1 menit didinginkan pada 50 oc untuk 1 menit dan ekstensi pada 72 Oc untuk
2 menit. Untuk menkonfirm bahwa ukurannya benar, PCR reaksi mensubyek ke elektroforesis pada 1,5%
agarosa gels di 1x TAE buffer, gels menodai dengan ethibium bromide dan reaksi produksidivisualissi
oleh illuminasi dengan sinar ultraviolet pada 302 nm. PCR produk menkonfirm menjadi ukuran yang
benar dengan purifikasi enguunakan UltraClean PCR Clean Up Kit.
Analisis Sequence
Purifikasi produk PCR bagian GEN 16S Rrna dikirim ke TaKaRa company menjadi tersequence
menggunakan Big Dye terminasi v3.1 Cycle Sequencing Kit pada ABI 3730xl DNA analizer. Didapatkan
sequenced yang diupload dan dikomper menjadi getbank database menggunakan web based BLAST
analysis tools di Nasional Center for Biotechnology informasi untuk dianalisis fiologenetik afiliasi dan
identitas kekerabatannya.
Estimasi kelimpahan heterotrof thiosulfate-oxidizers di lingkungan
Satu gram sampel sedimen telah diperlakukan untuk serial dilution di tabung glass yang berisi 9 ml 1%
solution garam. Rangkaian termasuk delapan 10-lipatan langkah dilusion. Dari masing-masing ini, 1 ml
suspensi diransfer menjadi 40 ml TM liquid medium di 100 ml botol conical yang berisi 0,1 % Na
pyruvate sebagai sumber karbon dan 0,02 % ekstrak yeast. Medium disiapkan duplikate dan diinkubasi
aerob pada 30Oc. Aktivitas thiosulafe oxidizers dideteksi pada tidak terwarnainya indikator PH.

Hasil
Dari hasil uji isolasi pengoksidasi thiosulfate, setelah 7 hari masa inkubasi koloni bakteri tumbuh
pada semua agar plate hingga pengenceran 10-5. Masa inkubasi yang lebih lama dapat membuat koloni
menjadi lebih tebal dan lebih luas namun tidak merubah jumlah mereka. Koloni yang mampu terpisah
dengan baik hanya ditemukan pada plat agar pada pengenceran 10 -3 dan 10-5. Dari semua plat, koloni
diinokulasikan lagi pada fresh agar plate dengan komposisi yang sama dan didapatkan 25 koloni yang
dapat hidup. Mayoritas koloni mengubah warna medium menjadi kuning dan beberapa yang lain berubah
menjadi warna merah muda. Selanjutnya 5 strain yang representative yaitu MKH02, MKH04 dan
MKH20 sebagai bakteri produksi asam dan MKH16 & MKH41 sebagai bakteri produksi basa
dikarakterisasi.

Kelima isolat yang ditemukan selanjutnya dikarakterisasi dengan diuji responnya terhadap tiga
kondisi medium yang berbeda. Hasilnya, kelima isolate tersebut merespon tiga kondisi medium secara
berbeda-beda. Isolat MKH02 dan MKH20 dapat tumbuh di medium mixotrofik dan heterotrofik namun
tidak tumbuh pada medium autotrofik. Sedangkan isolat MKH04 yang mampu memfiksasi karbon
anorganik dan mampu tumbuh pada seluruh kondisi karena sifatnya yang merupakan fakultatif
litoautotrof. Sebaliknya, isolat MKH16 & MKH41 menaikkan pH medium selama pertumbuhan mixotrof
dan idak dapat tumbuh pada medium yang kekurangan karbon organik. Kedua isolat mengubah pH dari
medium mixotrof dalam waktu yang relative cepat (<12 jam) sementara isolat lain membutuhkan waktu
3-8 hari untuk menunjukkan adanya pertumbuhan dan menurunkan pH medium.
Setelah itu kelima isolat juga dikarakterisasi kemampuan dalam mengoksidasi sulfida. Sulfida
(S ) yang tersuplai pada bagian bawah agar sudah terdifusi ke seluruh bagian agar dalam 2 hari. Proses
difusi dapat diketahui dari pergantian warna pH indicator menjadi merah muda. Larutan Na 2S memberi
pH basa dari reaksi antara ion S 2- dengan H+ dan meninggalkan OH-. Lapisan tpis berwarna putih teramati
beberapa millimeter di bawah permukaan atas agar pada semua isolat. Setelah 10 hari masa inkubasi,
lapisan pada tabung yang diinokulasikan dengan isolat MKH41 menjadi semakin tebal dibanding dengan
pada tabung lain. Setelah itu lapisan tersebut disubkulturkan pada medium agar dengan komposisi yang
sama. Masa inkubasi yang semakin lama akan membuat lapisan tersebut menghilang, namun pada isolat
MKH41 justru lapisannya semakin tebal. Lapisan tersebut tidak tampak pada semua isolat dalam medium
kontrol yang tidak ditambahkan Na2S.
2-

Kelimpahan heterotrophic thiosulfate oxidizer pada alam

Pada analisa sebelumnya, kelima isolat mampu tumbuh dalam pengaruh dari adanya thiosulfat
dan piruvat and mengubah warna medium selama pertumbuhannya. Dari karakteristik yang telah
disebutkan, dapat ditentukan jumlah populasi heterotrophic thiosulfate oxidizer yang ada pada sedimen
tidal flat. Perubahan warna dan kekeruhan terjadi pada semua medium cair dengan pengenceran hingga
10-7 setelah masa inkubasi selama 2 minggu. Pada ke-semua pengenceran, perubahan pH teramati pada
hari 1-2 masa inkubasi dan semuanya berubah menjadi basa.
Analisis homology
Pencarian homology gen 16s rRNA menunjukkan bahwa isolat terdistribusi menjadi 3 kelas
berbeda, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria dan Bacili. Mayoritas isolat secara filogenetik
berhubungan dengan strain mikroorganisme laut yang telah diisolasi dari daerah sekitar Jepang.

Discussion
Karakteristik isolat pada oxidizing Thiosulfate dan Sulfide
Berbagai tipe metabolism ditunjukkan oleh isolat sehubungan dengan oksidasi thiosulfate. Isolat
MKH02 dan MKH20 tumbuh pada medium heterotrofik dan mixotrofik, dalam hal ini piruvat berperan
sebagai karbon utama dan sumber energi. Meskipun isolat tumbuh pada piruvat namun koloni tersebut
mampu mengoksidasi thiosulfate ketika ada thiosulfate. Penurunan pH medium terjadi dikarenakan
lepasnya asam sulfat (H2SO4) sebagai hasil dari oksidasi thiosulfate. Sebaliknya, isolat MKH04
menunjukkan pertumbuhan ketika ia mendapat suplai thiosulfate. Pertumbuhan yang pesat terjadi ketika
isolat ditumbuhkan pada medium mixotroph dan autotroph. Hal ini menunjukkan bahwa energi untuk
tumbuh didapatkan dari oksidasi thiosulfate menjadi sulfat. Isolat tersebut dapat memfiksasi karbon
anorganik untuk mendukung metabolismenya ketika tidak ditemukan kabon organic. Keberadaan piruvat

dalam medium mendukung pertumbuhan litotrof dari MKH04 pada oksidasi thiosulfate. Hal ini diketahui
dari adanya reduksi pH pada medium dimana reduksi pH lebih tampak pada medium mixotrof dibanding
dengan medium autotrophic. Pada produsen sulfat, oksidasi thiosulfate umumnya dikatalisis oleh sistem
enzim Sox dan enzim tersebut diketahui terdapat pada Alphaproteobacteria dan Gammaproteobacteria.
Enzim soxB diuji keberadaannya pada isolat MKH02, MKH04 dan MKH20 dengan menggunakan
deteksi berbasis PCR. Masing-masing dari isolat menunjukkan amplifikasi sepanjang 260bp dari gen
soxB. Amplifikasi positif dapat menentukan kehadiran dari enzim Sox pada isolat. Pada studi ini, mikroba
penghasil asam menggunakan enzim Sox dalam mengoksidasi thiosulfate.
Isolat MKH16 tidak menunjukkan adanya pertumbuhan pada kondisi heterotroph dan litoautotrof,
namun isolat mampu tumbuh dengan sangat baik pada medium mixotrof. Keberadaan dari karbon organic
dan thiosulfate sangat penting bagi pertumbuhan isolat tersebut. Isolat MKH16 menunjukkan jalur
metabolism yang berbeda dalam mengoksidasi thiosulfate yaitu dengan melepaskan senyawa basa. Pada
penghasil basa, tetrathionate sama seperti OH - , dilepaskan sebagai produk utama dari oksidasi thiosulfate
yang dikatalisis oleh tetrathionate synthase. Kenaikan pH selama pertumbuhan isolat MKH41
ditunjukkan pada ketiga kondisi. Namun hanya pada kondisi autotroph saja kekeruhannya tidak
terdeteksi. Pertumbuhan isolat bergantung dari ketersediaan karbon organik meskipun oksidasi thiosulfate
juga tampak pada medium autotrofik. Jalur yang digunakan untuk oksidasi thiosulfate hampir sama
dengan jalur MKH16 yaitu dengan produksi tetrathionate sebagai produk akhir. Pada penghasil
tetrathionat, oksidasi thiosulfate bukanlah reaksi konsumsi energy namun justru pengeluaran dua electron
pada setiap pembentukan tetrathionat. Peningkatan pH pada medium autotrofik dimungkinkan sebagai
hasil dari oksidasi thiosulfate oleh sel yang diinokulasikan, namun koloni tersebut tidak dapat tumbuh
karena ketidakmampuan mereka untuk memfiksasi karbon anorganik.
Pada tes oksidasi sulfida, MKH41 adalah satu-satunya isolat yang bertahan pada suksesi
subkultur yang menyimpulkan bahwa isolat dapat mengoksidasi sulfida secara aerob. Namun isolat
diketahui bersifat heterotroph dan tidak ada karbon organic yang disuplai di medium sehingga
menimbulkan kemungkinan bahwa pertumbuhan yang terjadi didukung oleh adanya jejak dari karbon
organic yang terdapat pada agen pembentuk gel. Lapisan putih tipis yang dijumpai di bagian bawah
permukaan medium mungkin mengandung endapan dari sulfur yang merupakan produk dari reaksi kimia
antara tetrathionat dan sulfida yang ada.
Analisa Homology
Dari hasil studi, didapatkan dua kelompok isolat dalam kelas Gammaproteobacteria, MKH20 dan
MKH41. Gammaproteobacteria ditemukan sebagai kelompok utama yang membentuk lebih dari 20%
total klon pada area tidal Midorikawa. Kelas ini diketahui dari berbagai macam bakteri pengoksidasi
sulfur, baik autotroph maupun heterotroph dan umum menjadi kelompok utama di sedimen pada perairan
payau dan perairan pesisir. MKH20 dan MKH41 secara taksonomi termasuk pada genus Dyella dan
Pseudomonas. Beberapa strain Dyella telah diketahui sebagai pengoksidasi thiosulfate pada sedimen
pesisir di India dan sebagai pendegradasi PAH pada sedimen mangrove di Taiwan. Strain dari
Pseudomonas dilaporkan mampu mengoksidasi thiosulfate menjadi tetrathionate pada kondisi
heterotroph. Genus ini umumnya menempati lapisan antara sulfida-oksigen dan ada pula yang dilaporkan
terdapat pada invertebrata pesisir di Laut Jepang. Isolat MKH02 dan MKH04 terdeteksi berhubungan erat
dengan Paracoccus. Kedua isolat termasuk dalam kelompok Alphaproteobacteria yang umum ditemukan
di sedimen laut dan estuari adan diketahui sifat litotrof-nya dengan thiosulfate. Kelompok ini juga
diketahui berkontrbusi sebagai kelompok populasi bakteri yang besar setelah Gammaproteobacteria pada
area tidal Midorikawa. Sedangkan MKH16 diketahui dekat kekerabatannya dengan Bacillus yang telah

diisolasi dari tanah pesisir yang saline dan air laut di bawah hydrothermal vents di Korea Selatan dan
Atlantik Utara. Kelompok ini menunjukkan oksidasi thiosulfate secara heterotroph.
Peran heterotrophic SOB dalam siklus sulfur

Pada siklus sulfur di area tidal Midorikawa, MKH41 dapat mengoksidasi sulfide dan thiosulfate
menjadi tetrathionate. Oksidasi thiosulfate pada penelitian ini terjadi dalam jangka waktu yang sempit dan
mungkin terjadi di sedimen. Pada penghasil basa, tingkat oksidasi thiosulfate terjadi lebih cepat dari
oksidasi sulfide. Tetrathionate yang dilepaskan ke alam bereaksi secara cepat dengan sulfide yang ada.
Rekasi kimia tersebut menghasilkan thiosulfate dan elemental sulfur (S 0). Selanjutnya thiosulfate
dioksidasi kembali menjadi tetrathionate yang menghasilkan siklus konsumsi dari sulfide dan produksi
elemental sulfur. Oksidasi sulfida terjadi di area tidal selama tetrathionate diproduksi. Penghasil
tetrathionate dimungkinkan berkompetisi dengan sulfur reducing bacteria (SRB) yang mampu mereduksi
thiosulfate menjadi sulfida. Di lain hal, thiosulfate mampu dioksidasi oleh sulfur oxidizing bacteria (SOB)
yang menghasilkan asam. Thiosulfate yang merupakan produk utama dari oksidasi sulfida di area tidal
sebagian teroksidasi menjadi sulfat. Penghasil sulfat yang heterotrof dimungkinkan mengambil bagian di
katalisis reaksi tersebut. Populasi dari heterotroph SOB di area tidal Midorikawa diestimasi mencapai 10 7
sel per gram sedimen yang mengindikasikan pentingnya peran mereka dalam siklus sulfur.