PENDAHULUAN

Asam

nukleat

adalah

polinukleotida

yang

merupakan

polimer

mononukleotida dan terdiri atas dua golongan, yaitu asam deoksiribonukleat

(DNA) dan asam ribonukleat (RNA) (Wirahadikusumah 1985). DNA merupakan
tempat penyimpanan informasi genetik yang bertanggung jawab atas pewarisan
informasi genetik dari suatu generasi ke generasi berikutnya (Lehninger 1982).
DNA terutama ditemui pada inti sel yang mengemban kode genetik dan dapat
memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru
untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu
sel mengerahkan sintesis molekul RNA. Berdasarkan fungsi biologinya,
dibedakan tiga macam RNA, yaitu mRNA sebagai penyampai pesan, rRNA
sebagai tempat molekul protein disintesis, dan tRNA sebagai pengangkut asam
amino dari satu lokasi ke rRNA untuk disintesis menjadi molekul protein (Hawab
2003). Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang dilakukan untuk
mendapatkan sumber DNA yang umumnya dilakukan untuk rekayasa genetika
yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein dan RNA. Kualitas hasil
isolasi DNA kromosom dapat terukur melalui keutuhan (tidak terfragmentasi) dan
kemurnian
Prinsip spektrofotometer UV/VIS didasarkan pada hukum Lambert Beer
yang mana apabila seberkas sinar dengan intensitas tertentu melalui suatu materi
maka sejumlah sinar akan diabsorpsi dan sebagian lain diteruskan. Banyaknya
sinar yang diabsorpsi oleh suatu senyawa tergantung dari konsentrasi senyawa
tersebut dalam sampel dan panjang jalan cahaya yang melalui contoh. Pengukuran
contoh pada daerah ultraviolet jika senyawa dalam sampel memiliki panjang
gelombang antara 180 nm sampai 400 nm sedangkan pengukuran sampel pada
daerah cahaya tampak jika senyawa dalam contoh memiliki panjang gelombang
antara 400 nm sampai 700 nm (Khopkar 1990).
Sentrifugasi merupakan metode yang digunakan untuk mencapai
sedimentasi dimana partikel yang ada pada sampel dipisahkan dari fluida oleh
gaya sentrifugasi berdasarkan berat jenis masing-masing partikel. Percobaan

dilakukan bertujuan untuk mengidentifikasi sifat dan struktur DNA kromosom

melalui proses isolasi DNA dari tanaman yaitu umbi bawang merah.
METODE PERCOBAAN
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan di antaranya pipet tetes, sentifusa, mortar, pestle, water
bath, tabung eppendorf, gelas beaker, corong, tabung reaksi, vortex, neraca, kuvet,
dan spektrofotometer UV/VIS.
Bahan-bahan yang digunakan di antaranya umbi bawang merah, larutan
lisis, NaCl, SDS 10%, etanol, es, kertas saring, dan akuades.
Prosedur
Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan cara sebanyak 25 gram umbi
bawang merah ditimbang. Kemudian umbi bawang merah dipotong melintang dan
dihaluskan dengan 1,5 gram garam menggunakan mortar. Umbi bawang yang
telah halus ditambahkan 40 mL larutan lisis. Campuran dipindahkan ke dalam
gelas piala, ditambahkan 5 mL larutan SDS 10%, serta dihomogenkan. Kemudian
campuran diinkubasi dalam water bath pada suhu 60 C selama 20 menit dan
diaduk sesekali. Hasil inkubasi disaring ke dalam gelas piala yang ditempatkan di
atas es, sehingga larutan tersebut menjadi dingin. Setelah dingin, ke dalam larutan
ditambahkan 0,5 gram garam, diaduk secara sempurna, dibiarkan selama 15
menit, dan diaduk sesekali. Larutan dibiarkan selama 5 menit dan lapisan atas
diambil dengan menggunakan pipet mikro serta dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf. Tabung ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2
sampai 5 menit. DNA kromosom diambil dengan pipet mikro secara hati-hati.
DNA kromosom ditempatkan pada tabung sentrifusa dan ke dalam tabung
sentrifusa ditambahkan etanol 10 mL. Tabung disentrifugasi selama 2 menit
dengan kecepatan 13.000 rpm. Larutan etanol dibuang pada lapisan atas secara
hati-hati tanpa merusak pelet dan sebanyak 1 mL etanol ditambahkan ke pelet
DNA kromosom. DNA kromosom diresuspensi dengan cara divortex selama 1
menit dan disentrifugasi kembali selama 2 menit. Etanol pada lapisan atas dibuang
dan ditambahkan 1 mL akuades ke dalam DNA kromosom. Larutan DNA

kromosom diencerkan sebanyak 70 kali dengan akuades dan diukur absorbansinya

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Data Pengamatan
Berikut ini hasil yang diperoleh dari percobaan yang telah dilakukan pada
isolasi DNA kromosom pada umbi bawang merah.
Tabel 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang merah
Larutan
Blanko
Sampel

Contoh

Keterangan

A260
0,000
-0,2041

A280
0,000
-0,2192

[DNA]
(g/mL)

Rasio
A260:A280

-193,895

0,9311

: [DNA]: A260 x 50 g/mL x faktor pengenceran

: -0,2041 A x 50 g/mL x 19
: -193,895 g/mL
50: larutan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 g untai
ganda DNA/mL
19: Faktor Pengenceran

Pembahasan
Beberapa perbedaan DNA dengan RNA di antaranya 1) bagian pentosa
RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah deokiribosa, 2)
bentuk molekul DNA adalah heliks ganda, sedangkan RNA berupa rantai tunggal
yang terlipat sehingga menyerupai rantai ganda, 3) RNA mengandung basa
adenin, guanin, dan sitosin seperti DNA, tetapi tidak mengandung timin dan
sebagai gantinya RNA mengandung urasil, 4) jumlah guanin dalam molekul RNA
tidak perlu sama dengan sitosin, demikian pula jumlah adenin tidak harus sama
dengan urasil (Poedjiadi 1994).
Molekul DNA harus memenuhi kriteria di antaranya adalah memiliki
kestabilan, mampu bereplikasi, dan dapat bermutasi sehingga struktur dari DNA
akan menentukan fungsinya Molekul DNA pada semua macam sel terdiri atas
unit-unit keempat mononukleotida utama, d-AMP, d-GMP, d-TPM, dan d-CMP
yang dihubungkan dalam suatu variasi deretan oleh ikatan fosfodiester yang
ditunjukkan oleh gambar 1 sebagai berikut.

Basa 1

CH2 O
H

HO

O HO
O

HO

H2C

Basa 2

H2C

H
H

HO

Basa 1

CH2 O

H
H

H
O

Basa 2

HO

H
O

OH

CH2

DNA

CH2

Basa 3

H
O

Basa 3

H
H

OH

RNA

Gambar 1 Struktur polinukleotida pada DNA (a) dan RNA (b); ikatan fosfodiester
menghubungkan hidroksil -3 pada nukleotida yang satu dengan gugus hidroksil -5 pada
nukleotida yang berikutnya (Wirahadikusumah 1985)

Prinsip isolasi DNA kromosom ialah memisahkan DNA kromosom atau

DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman,
kultur mikroorganise, atau sel manusia. Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah
perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel pada bawang merah.
Isolasi DNA kromosom pada percobaan menggunakan umbi bawang merah
karena bawang merah memiliki sedikit pati, sehingga DNA akan terlihat lebih
jelas. Perusakan sel tersebut dapat dilakukan dengan cara mekanik yaitu diblender
atau dapat juga menggunakan bahan kimia untuk mendegradasi dan melarutkan
komponen dinding sel.
DNA akan terpisah menjadi suatu larutan dan dapat dimurnikan
(dipurifikasi) melalui dua cara yang umum dilakukan yaitu sentrifugasi dan
ekstraksi kimia. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan yang tinggi sehingga
komponen yang berukuran lebih besar atau lebih berat akan mengendap
membentuk sedimen pada bagian bawah tabung. DNA dan komponen lain yang
berukuran lebih besar akan mengendap pada bagian bawah dan hasil kontaminan
dari perusakan dinding sel berada pada bagian suspensi. DNA tersebut kemudian
dilarutkan kembali dengan kondisi yang masih bercampur dengan protein dan

RNA. Filtrat bawang dibuat dengan penambahan garam dan detergen (SDS).
Proses lisis dengan menggunakan detergen, sering menggunakan SDS sebagai
tahap pelisisan membran sel untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi
lipid dan protein sehingga merusak interaksi polar pada membran sel ataupun
untuk mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi
DNA. Kemudian pada ekstrak sel tersebut dapat ditambahkan protease yang
berfungsi mendegradasi protein dan RNase yang berfungsi untuk mendegradasi
RNA, sehingga yang tinggal adalah DNA. Akan tetapi, pada percobaan protease
diganti dengan NaCl dan RNase tidak digunakan karena konsentrasi RNA juga
ditentukan. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 60 C untuk
menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian
dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.
Tujuan dikondisikannya suspensi asam nukleat di es adalah agar alkohol
dalam keadaan dingin sehingga dapat dengan cepat mengendapkan DNA
kromosom yang tampak sebagai benang-benang putih. Sampel disentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 rpm yang bertujuan untuk memisahkan endapan dari
cairan induknya yaitu etanol, sedangkan vortex dilakukan bertujuan untuk
meresuspensi pelet yang diperoleh. Larutan lisis dibuat dari 50 mM Tris-HCl pH 8
yang mengandung 50 mM EDTA. Larutan SDS 10% dibuat dari 10 mM Tris-HCl
pH 8 yang mengandung 0,1 mM EDTA. Garam membantu ujung-ujung fosfat
DNA yang bermuatan negatif saling mendekat sehingga dapat terbentuk endapan
dalam larutan alkohol dingin. DNA memiliki panjang gelombang maksimum pada
260 nm sedangkan RNA memiliki panjang gelombang maksimum pada 280 nm.
Pemilihan panjang gelombang maksimum ini bertujuan agar diperoleh konsentrasi
DNA dan RNA lebih tepat dan teliti, karena jika pengukuran tidak melalui
panjang gelombang maksimum maka akan menyebabkan kesalahan respon pada
alat cukup besar jika terjadi sedikit perubahan yang tidak diinginkan pada
pengukuran.
Berdasarkan penelitian Storms (1998), konsentrasi DNA dan RNA pada
umbi bawang merah untuk ulangan pertama masing-masing sebesar 55 g/mL dan
119 g/mL sedangkan untuk ulangan kedua masing-masing sebesar 115 g/mL
dan 40 g/mL. Hasil yang diperoleh pada pecobaan lebih kecil yaitu -193,895

dibandingkan dengan peneliatian Storms. Hal yang dapat memengaruhi perbedaan

konsentrasi ini dapat disebabkan oleh adanya perbedaan jenis umbi bawang merah
sehingga memengaruhi kadar yang terkandung di dalamnya. Selain itu, setiap
perlakuan yang diberikan pada sampel dapat memengaruhi hasil konsentrasi yang
diperoleh seperti tidak semua jaringan atau sel terlisis sehingga isinya hanya
keluar sebagian.
Kemurnian DNA diketahui dari nilai rasio absorbansi DNA pada 260 nm
dengan 280 nm (A260/A280). Nilai rasio untuk DNA untai ganda murni yaitu
1,8-2,0. Nilai rasio di bawah 1,8 menunjukkan adanya kontaminan senyawa berat
molekul besar misalnya protein. Nilai rasio di atas 2,0 menunjukkan adanya
kontaminan senyawa berat molekul kecil misalnya RNA. Nilai rasio yang
didapatkan pada percobaan sebesar 0,9311 menunjukkan adanya kontaminan
senyawa

yang memiliki berat molekul besar. Kualitas hasil isolasi DNA

kromosom dapat diukur melalui keutuhan yaitu tidak terfragmentasi dan

kemurnian yaitu bebas kontaminan yang sangat penting untuk berbagai keperluan
rekayasa genetika.
SIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan pada isolasi DNA kromosom
umbi bawang merah dapat disimpulkan bahwa konsentrasi DNA yang diperoleh
sebesar -193,895 g/mL dan rasio yang didapatkan pada percobaan sebesar
0,9311.
DAFTAR PUSTAKA
Hawab HM. 2003. Pengantar Biokimia. Malang: Bayumedia.
Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo A, penerjemah;
Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry.
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 3. Maggy Thenawijaya,
Penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.
Storms WN. 1998. Investigation of DNA extraction at the University of North
Carolina at Pembroke [tesis]. Carolina: Universitas Carolina Utara Press.
Wirahadikusumah M. 1985. Biokimia: Metabolisme Energi, Karbohidrat, dan

Lipid. Bandung: ITB Press.

Laporan Praktikum
Biokimia Umum

Hari/Tgl
Waktu
PJP
Asisten

: Senin/24 November 2014

: 11.00 - 13.00 WIB
: Puspa Julistia Puspita, S.Si,M.Sc
: 1. Nindy Lestarie, S.Si
2. Rini Kurniasih, S.Si

LIPID II
Kelompok 6
Resty Fauziah
Fahmi Fahrurozi
Putri Zara Zetira
Ardin Cahya Buana

J3L213093
J3L113045
J3L113054
J3L213085

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2014