Anda di halaman 1dari 15

TUGAS TERSTRUKTUR

BIOKIMIA
PEMISAHAN PROTEIN

Disusun Oleh:
AMALIA NUR KHASANAH
G1F013056

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN
JURUSAN FARMASI
PURWOKERTO
2014

KATA PENGANTAR
Puji syukur saya haturkan kepada Allah SWT, karena atas ridho-Nya
lah makalah biokimia ini dapat terselesaikan. Shalawat dan salam semoga
tetap tercurahkan kepada Rasulullah Muhammad SAW. Serta para pihak
yang telah membantu penyusunan makalah ini. Adapun tujuan dalam
penyusunan makalah ini agar dapat menjadi rujukan untuk mempelajari
tentang Pemisahan Senyawa Protein. Dalam penulisan makalah ini
penulis mencoba semaksimal mungkin dalam penyusunannya. Namun
tidak ada gading yang tak retak, begitupun dengan makalah ini, oleh sebab
itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran dari pembaca guna
memperbaiki makalah sederhana ini. Semoga makalah ini dapat
menambah ilmu pengetahuan,wawasan mengenai materi biokimia.
Purwokerto, 24 Oktober 2014
Penyusun,

Amalia Nur Khasanah


G1F013056

BAB I
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang
paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi
yang merupakanpolimer dari monomer-monomer asam amino yang
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein
mengandung karbon, hidrogen, oksigen,nitrogen dan kadang kala sulfur
serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel
makhluk hidup dan virus.
Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis
protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti
misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein
terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali
dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan
juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein
berperan sebagai sumber asam amino bagiorganisme yang tidak mampu
membentuk asam amino tersebut (heterotrof).
Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain
polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama
makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang
paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jns Jakob
Berzelius pada tahun 1838.
B. RUMUSAN MASALAH
Adapun rumusan masalah dalam makalah ini adalah apa saja
cara/teknik yang dapat digunakan untuk memisahkan protein.
C. TUJUAN
Adapun tujuan pembuatan makalah ini adalah untuk mengetahui
cara/teknik pemisahan protein yang baik dan benar.

BAB II
ISI
A. CARA/TEKNIK PEMISAHAN PROTEIN
Berikut ini adalah beberapa cara yang biasa dgunakan untuk
melakukan pemisahan terhadap senyawa protein.
1. Dialisis
Dialisis adalah proses perpindahan molekul terlarut dari suatu
campuran

larutan

yang

terjadi

akibat difusi pada membran semi-

permeabel. Molekul terlarut yang berukuran lebih kecil dari pori-pori


membran tersebut dapat keluar, sedangkan molekul lainnya yang lebih
besar akan tertahan di dalam kantung membran. Selulosa adalah salah satu
jenis materi penyusun membran dialisis yang cukup umum dipakai karena
bersifat inert untuk berbagai jenis senyawa atau molekul yang akan
dipisahkan. Laju difusi ditentukan oleh beberapa kondisi(Whang, 1990):

Konsentrasi molekul pelarut yang akan keluar dari kantung dialisis. Jika
konsentrasi molekul terlarut di lingkungan lebih kecil dibandingkan
dengan yang ada di dalam kantung dialisis maka laju difusi akan semakin
cepat.

Luas permukaan kantung dialisis. Semakin luas permukaan membran yang


digunakan maka laju difusi akan semakin cepat.

Volume pelarut. Jika rasio luas permukaan membran dengan volume


pelarut besar maka laju difusi akan berlangsung dengan cepat karena
molekul terlarut dapat berdifusi dalam jarak yang dekat.

Metode

dialisis

banyak

digunakan

dalam

pemurnian protein (terutama enzim). Dalam proses ini, dialisis digunakan


untuk menghilangkan molekul garam, sepertiamonium sulfat, sebelum
dilanjutkan dalam proses pemurnian berikutnya ataupun pada tahap akhir
pemurnian.

Dialisis

juga

banyak

digunakan

dalam

proses

pencucian darah pada pasien penderita gagal ginjal. Untuk kasus ini,
peranan

ginjal

untuk

menghilangkan

senyawa

beracun,

garam

dan air berlebih digantikan dengan sistem buatan. Hemodialisis adalah


metode pencucian darah dengan menggunakan mesin, sedangkan dialisis
peritoneal

menggunakan

membran

peritoneal

yang

berlokasi

di

daerah perut untuk menggantikan peranan ginjal (Clive, 2002)

2. Elektroforesis
Elektroforesis

Protein

adalah

teknik

pemisahan

protein

berdasarkan ukurannya dan memperlihatkan hasilnya. Akan tetapi protein


jauh lebih beragam dalam ukuran dan strukturnya, karena itu tekniknya
jauh lebih rumit.

Pada dasarnya alat elektroforesis terdiri atas 2 bagian utama yaitu


bagian electric transformer yang mengubah arus AC ke DC dan bagian
tanki elektroforesis yang berisi flat bed, slab, column, dan selang.

Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada


elektroforesis protein :
1. Densitas muatan molekul - berbeda diantara pH media dan pl molekul.
2. Pengaruh buffer
3. Bentuk dan ukuran molekul.
4. Media pendukung
Metode Yang Digunakan:
Polyacrilamide Gel Elektroforesis (PAGE)
Sistem yang digunakan dalam PAGE
-

Flat Bed

Rod atau Column

Vertical Slab

Capillary

Faktor yang mempengaruhi resolusi


Berikut adalah factor-faktor yang mempengaruhi resolusi
(Khopkar,1990):
1. Konsentrasi Gel Poliakrilamid
-

Konsentrasi monomer - proporsional terhadap porositas gel akhir

Persentase Cross-linker pada Monomer - mempunyai pengaruh

pada porositas gel akhir


-

kimia alam untuk Cross-linker - dapat mempengaruhi porositas dan

penangan selanjutnya pada gel akhir


-

Kemurnian monomer - sering terkontaminasi dengan asam akrilat

yang menyebakan efek elektroendosmosis pada gel final.

2. Buffer
-

pH

Penggunaan sistem buffer kontnyu atau diskontinyu

Komposisi buffer

Inklusi agen disosiasi : Urea, detergen non ionic, Sodium Dodecyl

Sulphate (SDS).

Untuk

mempelajari

protein,

kita

perlu

mengurutkan

dan

memvisualisasikannya. Salah satu cara paling umum untuk melakukannya


dikenal dengan SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis).
Tidak seperti DNA, protein yang diisolasi ini tidak akan memiliki muatan
negatif yang sama. Karena itu perlu untuk melindungi semua protein
dengan sesuatu untuk memberikan muatan negatif, yang memungkinkan
mereka

bergerak

menuju

ujung

positif

arus

listrik.

Untuk memisahkan protein secara akurat berdasarkan ukurannya, akan


sangat penting jika kita mendenaturasi protein sebelum mengisikannya
dalam gel. Untuk melakukan hal ini, kita akan menggunakan loading
buffer dengan 2 bahan penting, SDS dan DTT (ditiotreitol). DTT adalah
agen pereduksi yang kuat yang memutus ikatan disulfida. Selain itu untuk
mempergunakan 2 agen kimia untuk mendenaturasi protein, kita juga
harus memanaskan beberapa sampel hingga 95oC untuk membantu
mendenaturasi protein secara sempurna, menghasilkan molekul linier yang
akan bermigrasi berdasarkan bobot molekulnya.

Struktur Protein

Di dalam sel, protein berada dalam bentuk 3 dimensional. Struktur


primer protein merupakan sekuen sederhana dari asam amino. Asam
amino ini dapat membentuk struktur umum seperti alpha heliks, akibat
ikatan hidrogen. Struktur protein juga dapat lebih lanjut terpengaruhi oleh
interaksi elektrostatik dan hidrofobik, sekaligus juga gaya yang lebih kuat
seperti ikatan kovalen disulfide, ini dikenal dengan sebutan struktur tersier
protein (Soebagio, 2004).

3. Kromatografi Penukar Ion


Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian
senyawa spesifik di dalam larutan campuran. Prinsip utama dalam metode
ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara molekul
spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolomkromatografi. Metode
ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson
pada tahun 1850.
Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion,
yaitu (Syehla, 1985):

Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang


diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan
bermuatan

negatif.

matriks dekstran yang


CH2SO3-

dan

Kolom

yang

digunakan

mengandung

-O-CH2COO-). Larutan

biasanya

berupa

gugus karboksil (-CH2-CH2penyangga (buffer)

yang

digunakan dalam sistem ini adalah asam sitrat, asam laktat, asam
asetat, asam malonat, buffer MES dan fosfat.

kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan


bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan
positif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang
mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan N+(CH3)3. Larutan

penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil


piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin (Syehla, 1985).

Metode

ini

banyak

digunakan

dalam

memisahkan

molekulprotein (terutama enzim). Molekul lain yang umumnya dapat


dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara
lain senyawa alkohol, alkaloid, asam amino, dan nikotin.
Suatu resin penukar ion yang ingin direaksikan dalam suatu sistem
dapat dilakukan dengan memasukkan gugus-gugus dari suatu resin yang
terionkan kedalam suatu matriks polimer organik, yang paling lazim
diantaranya ialah polisterina hubungan silang yang diatas diperikan
sebagai absorben. Produk tersedia dengan berbagai derajat hubungan
silang. Suatu resin umum yang lazim ialah resin 8% terhubung silang
yang berarti kandungan divenilbenzenanya 8 %. Resin-resin itu dihasilkan
dalam bentuk manik-manik bulat, biasanya dengan 0,1-0,5 mm, meskipun
ukuranukuran lain juga tersedia (Svehla, 1985).
Resin pertukaran ion merupakan bahan sintetik yang berasal dari
aneka ragam bahan, alamiah maupun sintetik, organik maupun anorganik,
memperagakan perilaku pertukaran ion dalam analisis laboratorium
dimana keseragaman dipentingkan dengan jalan penukaran dari suatu ion.
Pertukaran ion bersifat stokiometri, yakni satu H+ diganti oleh suatu Na+.
Pertukaran ion adalah suatu proses kesetimbangan dan jarang berlangsung
lengkap, namun tak peduli sejauh mana proses itu terjadi, stokiometrinya

bersifat eksak dalam arti satu muatan positif meninggalkan resin untuk tiap
satu muatan yang masuk. Ion dapat ditukar yakni ion yang tidak terikat
pada matriks polimer disebut ion lawan (Counterion) (Underwood, 2001).
Resin dapat digunakan dalam suatu analisis jika resin itu harus
cukup terangkai silang, sehingga keterlarutan yang dapat diabaikan, resin
itu cukup hidrofilik untuk memungkinkan difusi ion-ion melalui
strukturnya dengan laju yang terukur dan berguna. Selain itu, resin juga
harus menggunakan cukup banyak gugus penukar ion yang dapat dicapai
dan harus stabil kimiawi dan resin yang sedang mengembang, harus lebih
besar rapatannya daripada air (Harjadi, 1993).
Dalam suatu proses subtituen polar dapat memberikan afinitas
yang tinggi bagi air. Apabila disuspensikan dalam air partikel resin itu
akan membengkak karena menyerap air, yang derajat pembengkakannya
dibatasi olah jauhnya hubungan silang. Sekitar satu gugus asam sulfonat
percincin aromatik kebanyakan dalam posisi para sulfonasi secara
dramatis mengubah karakter polimer itu. Asam-asam arisulfonat adalah
asam kuat. Jadi gugus-gugus ini akan terikat bila air menembusi manik
resin itu.
R SO3H

R- SO3- H+

Namun berlawanan dengan elektrolit basa, anion itu melekat secara


permanen pada matriks polimernya. Anion itu tak dapat berimigrasi
kedalam fase air didalam pori resin itu, juga tak dapat lolos kelarutan luar.
Pengikatan ion ini selanjutnya membatasi mobilitas kationnya, H +.
Kenetralan listrik dipertahankan didalam resin dan H+ tidak akan
meninggalkan fase resin kecuali bila digantikan oleh suatu kation lain.
Pergantian inilah yang disebut proses pertukaran ion (Underwood, 2001).
Prinsip-prinsip dasar dari pertukaran ion telah banyak menetapkan
penelitian-penelitian dalam sistem air, serta menghasilkan penetapanpenetapan yang berguna. Namun lingkup dari pertukaran ion telah
diperluas selama sekitar dekade terakhir ini, dengan menggunakan baik
sistem pelarut organik, maupun sistem pelarut campuran air-organik.
Pelarut-pelarut organik yang umum digunakan adalah senyawaan-

senyawaan akso dari tipe alkohol, keton dan karboksilat yang umumnya
mempunyai tetapan dielektrik dibawah 40 (Svehla, 1985).
Di tahun 1935, Adam dan Holmes membuat resin sintesin pertama
dengan hasil kondensasi asam sulfonat fenol dengan formaldehid. Semua
resin-resin ini memiliki gugusan reaktif -OH, -COOH, -HSO3, sebagai
pusat-pusat pertukaran. Gugusan fungsional asam (atau basa) suatu resin
penukar ditempati oleh ion-ion dengan muatan berlawanan. Ion yang labil
adalah H+ pada penukar kation. Resin dengan gugusan sulfonat atau amina
kuartener adalah terionisasi kuat, tidak larut dan sangat reaktif. Resin-resin
demikian disebut resin penukar kuat, sedangkan gugusan ion yang
terionisasi secara parsial seperti > COOH, -OH, dan NH 2 dikenal sebagai
resin penukar yang lemah (Khopkar, 1990).
Semua penukar ion yang bernilai dalam analisis, memilih beberapa
kesamaan sifat: mereka hampir-hampir tak dapat larut dalam air dan
pelarut organik, dan mengandung ionion katif dan ion-ion lawan yang
akan bertukar secara reversibel dengan ion-ion lain dalam larutan yang
mengelilinginya tanpa terjadi perubahan-perubahan fisika yang berarti
dalam bahan tersebut.penukaran ion bersifat kompleks dan sesungguhnya
adalah polimerik. Polimer ini membawa suatu muatan listrik yang tepat
dinetralkan oleh muatan-muatan pada ion-ion lawannya (ion aktif). Ion-ion
aktif ini beruapa kation-kation dalam penukar kation, dan berupa anionanion dalam penukar anion (Bassett, 1994).
Larutan yang melalui kolom disebut influent, sedangkan larutan
yang keluar kolom disebut effluent. Proses pertukarannya adalah serapan
dan proses pengeluaran ion adalah desorpsi atau elusi. Mengembalikan
resin yang sudah terpakai kebentuk semula disebut regenerasi sedangkan
proses pengeluaran ion dari kolom dengan reagent yang sesuai disebut
elusi dan pereaksinya disebut eluent. Yang disebut dengan kapasitas
pertukaran total adalah jumlah gugusan-gugusan yang dapat dipertukarkan
di dalam kolom, dinyatakan dalam miliekivalen. Kapasitas penerobosan
(break through capacity) didefinisikan sebagai banyaknya ion yang dapat

diambil oleh kolom pada kondisi pemisahan; dapat juga dikatakan sebagai
banyaknya miliekivalen ion yang dapat ditahan dalam kolom tanpa ada
kebocoran yang dapat teramati. Kapasitan penerobosan lebih kecil dari
kapasitas total pertukaran kolom dan tidak tergantung terhadap sejumlah
variabel, seperti tipe resin, afinitas penukaran ion, komposisi larutan,
ukuran partikel, dan laju aliran (Khopkar, 1990).
4. Filtrasi Gel
Kromatografi eksklusi gel merupakan jenis kromatografi eksklusi
dimana fasediamnya yang berperan sebagaipenyaring molekul terbuat dari
gelpolimer yang berikatan silang danberpori heterogen.Kromatografi
eksklusi gel dibagi menjadi dua yaitu kromatografi filtrasi gel
dankromatografi permeasi gel (Khopkar,1990).
Macam-macam gel (Khopkar,1990):
Sephadex
Digunakan untuk pemisahan protein
Terbuat dari polisakarida yangmengandung gugus hidroksil sehingga
gelbersifat polar.
Biogel
Terdiri dari poliakril amida
Tidak larut dalam air dan pelarut organikumumnya
Stiragel
Untuk memisahkan larutan tak berair
Tidak dapat digunakan dengan air, asetonatau kloroform.
Mekanisme Pemisahan (Khopkar,1990):

Suatu kolom yang telah diisi dengan gel yang beperan sebagai fase
diam, dialirifase gerak yang membawa molekul-molekul yang akan
dipisahkan. Molekul- molekul yang berukuran lebih besar dari pori- pori
terbesar gel akan keluar kolom dengan mudah melalui celah- celah
diantara partikel individual gel.Molekul- molekul yang berukuran sama
atau lebih kecil daripada pori- pori terbesar gel akan masuk ke dalam
jaringan yang terbuka di dalamgel.Molekul- molekul tersebut akan
tertahan padaberbagai tingkatan dan akan terelusi menurut penurunan
berat molekulnya.Molekul- molekul yang berukuran besar umumnya juga
memiliki berat molekul yang besar dan molekul- molekul yang berukuran
kecil umumnya juga memiliki berat molekul yang kecil.
Penggunaan KEG
Analisis campuran molekul dengan beratmolekul yang berbeda seperti
pemisahanrafinosa, maltosa dan glukosa.
Pengeluaran garam (desalting).
Pemisahan asam- asam nukleat darinukleotida.
Pemisahan polisakarida gula dan protein darisenyawa- senyawa berbobot
molekul rendah.
Kekurangan dan Kelebihan KEG (Hendyana, 2006) :
Kromatografi eksklusi gel memiliki beberapa keuntungan dalam
penggunaannya:
1. pita-pita sempit.
2.waktu pemisahan pendek.
3.waktu pemisahan mudah diramalkan.
4.Harga Tr sesuai dengan ukuran cuplikan.
5.tidak terjadi kehilangan cuplikan atau reaksiselama pemisahan.
6.hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasikolom.
Kromatografi ekslusi gel juga memiliki kelemahan:
1. kapasitas terbatas
2.tidak dapat digunakan untuk cuplikanyang mempunyai ukuran hampir
sama.
3.prinsip pemisahan tidak sepertikromatografi lain.

BAB III
PENUTUP
A. KESIMPULAN
Pemisahan senyawa protein dapat dilakukan dengan beberapa cara,
yaitu:
Dialisis
campuran

(proses

perpindahan molekul terlarut


larutan

dari

yang

suatu
terjadi

akibat difusi pada membran semi-permeabel. ).


Elektroforesis (teknik pemisahan protein

ukurannya.).
Kromatografi Penukar Ion (teknik pemurnian senyawa spesifik

di dalam larutan campuran.).


Filtrasi Gel ( jenis kromatografi eksklusi dimana fase diamnya

berdasarkan

yang berperan sebagai penyaring molekul terbuat dari gel


polimer yang berikatan silang dan berpori heterogen.).

B. DAFTAR PUSTAKA
Basset, J. 1994. Buku Ajar Vogel : Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik .Jakarta: EGC Buku Kedokteran
Clive Dennison (2002). A Guide to Protein Isolation. ISBN 0-792-357515.
Harjadi, W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar.Jakarta: Erlangga
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan: PTRemaja Rosdakarya
Offset.
Khopkar, S.M. 2008.Konsep Dasar Kimia Analitik . Jakarta: UI-Press.
Soebagio,dkk. 2004.Kimia Analitik II . Malang:UNM.
Syehla. G.1985. Bukuteks analisis anorganik kualitatig makkro dan semi
mikro,diterjemahkan oleh Dr.A hadjanan pudjaatmana, edisi ke ima
jilid dua.Jakarta: PTkalian media pustaka.
Underwood, A.L. 1988. Analisa Kimia Kuantitatif

Edisi

Ke

Empat.Jakarta:Erlangga
Whang JE, Kim YM. 1990. Purification and characterization of methanol
dehydrogenase

from Methylobacterim sp.

Biochem J 23(2):190-197.

strain

SY1. Korean