Journal Reading

Pencegahan Herpes
SimplexVirus diinduksi
Stroma Keratitis oleh
Glycoprotein B-Spesifik
Antibodi Monoklonal
Theresia Apsari Dewi
122 0211 093
FK UPNVJ

ABSTRAK
Meningkatnya insiden asiklovir (ACV) dan strain resisten
pada pasien dengan kornea HSV-1 infeksi yang
menyebabkan herpes stroma Keratitis (HSK) merupakan
masalah kesehatan utama di negara-negara industri dan
sering mengakibatkan kebutaan.
Untuk mengatasi kendala ini, kami sebelumnya telah
mengembangkan antibodi monoklonal HSV-gB-spesifik (mAb
2c) yang terbukti sangat protektif di imunodefisiensi NOD /
SCID-tikus terhadap infeksi genital.
Dalam penelitian ini, kami menguji efektivitas mAb 2c
dalam mencegah penyakit immunopathological HSK dalam
model mouse / c HSK BALB.
Oleh karena itu, tikus diinokulasi dengan HSV-1 regangan
KOS pada kornea diskarifikasi untuk menginduksi HSK dan
kemudian baik secara sistemik atau topikal diperlakukan
dengan mAb 2c.
Pengobatan sistemik dilakukan dengan pemberian intravena
mAb 2c 24 jam sebelum infeksi (pre-exposure prophylaxis)
atau 24, 40, dan 56 jam setelah infeksi (post-exposure
imunoterapi).

ABSTRAK
Pengobatan topikal dilakukan oleh inokulasi berkala (5
kali per hari) dari antibodi yang mengandung tetes mata
sebagai kontrol, mulai dari 24 jam pasca infeksi.
Pengobatan antibodi sistemik nyata mengurangi viral
load pada tempat infeksi dan benar-benar melindungi
tikus dari mengembangkan HSK.
Administrasi antibodi infeksi sebelumnya atau posting
antivirus sama-sama efektif. Pengobatan topikal tidak
berpengaruh meningkatkan pada tingkat keparahan HSK.
Kesimpulannya, data kami menunjukkan bahwa mAb 2c
terbukti menjadi obat yang sangat baik untuk
pengobatan infeksi HSV kornea dan untuk pencegahan
HSK dan kebutaan.
Selain itu, rekan manusiawi (mAb hu2c) sama-sama
efektif dalam melindungi tikus dari HSV-induced HSK jika
dibandingkan dengan antibodi tikus tua.
Hasil ini menjamin pembangunan masa depan antibodi
ini sebagai pendekatan baru untuk pengobatan kornea
HSV-infeksi pada manusia.

INTRODUKSI

INTRODUKSI
Okular Herpes Simplex Virus tipe 1 (HSV-1) diinduksi
keratitis adalah salah satu penyebab utama kebutaan
menular di dunia industri.
Insiden global HSV + 1,5 juta, 40.000 kasus baru
gangguan penglihatan bermata parah atau kebutaan
setiap tahun
HSV-1 infeksi kornea sering mengakibatkan penyakit mulai
dari radang epitel ringan sampai ulserasi kronis kornea
yang dimediasi system imun, seperti keratitis stroma
nekrotik berat, juga disebut herpes stroma Keratitis (HSK)
infeksi primer kornea virus bereplikasi di epitel kornea
bermigrasi ke ganglion trigeminal
Kedua, penyebaran sel-sel dan transportasi aksonal
intraseluler adalah mekanisme kunci dari HSV untuk
memfasilitasi penyebaran virus secara cepat dan
melarikan diri dari host sistem pertahanan imun seluler
dan humoral

INTRODUKSI
HSV terjadinya laten
Reactivasi berkala virus laten dan transmisi
dari ganglia trigeminal ke menyebar
pinggiran melalui sel ke sel infeksi
berulang dari kornea berhubungan dengan
lesi inflamasi dimediasi sel T yang parah
HSK
Saat ini, pengobatan sistemik atau topikal
dengan acyclovir (ACV) berhasil digunakan
untuk menekan replikasi virus pada pasien
dengan berulang herpes reaktivasi.
Selain itu, kortikosteroid digunakan untuk
menekan respon kekebalan pada kornea
untuk menghindari jaringan parut kornea.

INTRODUKSI
Studi terbaru menunjukkan bahwa kejadian
resistensi asiklovir HSV-1 strain telah secara
dramatis meningkat menjadi sekitar 6,4%
pada pasien imunokompeten dengan HSK
Karena beberapa efek samping yang serius
penggunaan gansiklovir (GCV) atau foscarnet
(FOS) terbatas
Selanjutnya, resistensi silang terhadap GCV,
FOS atau sidofovir (CDV) semakin terlihat
Oleh karena itu penting untuk
mengembangkan seri, ditoleransi pilihan
pengobatan untuk pasien dengan asiklovir
berulang atau resisten silang HSV-1 infeksi
kornea.

INTRODUKSI
Penelitian sebelumnya : monoklonal antibodi
mAb 2c dikembangkan sebagai senyawa
yang sangat ampuh untuk netralisasi obat
resistensi Herpes Simplex Virus
Antibodi ini mengakui epitop umum pada
glikoprotein B dari HSV-1 dan HSV-2 dan
terlihat lebih dari biasanya khasiat antivirus
tinggi in vitro dan pada tikus sangat
imunodefisiensi NOD / SCID
Urutan epitope dikenali oleh mAb 2c sangat
dibiakan di isolasi HSV-1 dan HSV-2 dan
terbukti menjadi penting untuk virulensi dan
kebugaran virus

INTRODUKSI
Berbeda dengan sebagian besar antibodi
manusia yang dihasilkan selama infeksi HSV
atau disebabkan oleh vaksinasi dengan vaksin
protein rekombinan, antibodi ini tidak hanya
menetralisir virus yang beredar, tetapi juga
menghambat HSV penyebaran transmisi oleh
sel ke sel
Mekanisme ini dikenal menjadi penting selama
pembentukan laten dan juga selama reaktivasi
Karena sifat unik dari mAb 2c, kami
merancang derivate mAb hu2c manusia untuk
pengobatan infeksi HSV resisten terhadap obat
antivirus standar

INTRODUKSI
Baik antibody manusia dan antibodi mencit
memperlihatkan sifat yangsama mengikat dan mampu
menetralisir berbagai klinis isolat resisten terhadap
ACV, FOS atau CDV.
In vivo, mAb hu2c juga mencegah NOD / tikus SCID
terhadap mematikan infeksi HSV-1 dengan multidrug
resisten isolat klinis
Berdasarkan data-data yang menjanjikan, kami
menyimpulkan bahwa antibodi ini harus menjadi
pilihan perawatan yang tepat untuk infeksi kornea
berat HSV-1 menginduksi HSK.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji
kapasitas netralisasi dari antibodi monoklonal HSV-gBspesifik terhadap mata-patogen HSV-1 galur KOS dan
isolat klinis ACV resisten in vitro dan kemanjurannya
dalam pencegahan HSK di imunokompeten pada
mencit BALB model / c.

Bahan dan Metode

Pernyataan Etika
Hewan percobaan yang dipakai sesuai dengan
peraturan ketat Masyarakat Jerman untuk
Laboratorium Ilmu Hewan(GV-SOLAS) danUU
Kesehatan Eropa dari Federasi Laboratorium Hewan
Asosiasi Ilmu(FELASA).
Protokolini disetujui oleh Badan Westphalia Negara
Rhine Alam, Lingkungan Hidup danPerlindungan
Konsumen (LANUV) (Izin nomor: G1194-1111).
Persiapan neuron sensorik mencit dilakukan sesuai
dengan Undang-UndangJerman Animal Welfare.
Semuaupaya dilakukanuntuk meminimalkan
penderitaan. Untukimunofluoresensi percobaan
mikroskop(lihat di bawah), kami
menggunakanserummanusiayang sehat, HSV-1
seronegatifvolunteers.
Writteninformed consent dari donor darah diperoleh.
Izin diberikan oleh Lembaga Review Boarddari
Hannover Medical School(persetujuan nomor893).

Hewan
Mencit BALB/c betina, 8 minggu usia, yang
dibeli dari Charles River Laboratories
(Charles River Laboratories, Sulzfeld, Jerman)
dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen.
Semua in vivo percobaan dilakukan sesuai
dengan persyaratan hukumJerman dengan
persetujuan fasilitas hewan University
Hospital Essen.
Untuk mengisolasi neuronprimer, tikus
C57BL/6JhanZtm dibiakkandan dipelihara di
Fasilitas Hewan Laboratorium Hannover
Medical School.

Sel
Sel Vero yang dikultur di Dulbecco's Modified
Eagle Medium yang mengandung 10% (v / v)
serum janin anak sapi, 100 U / ml penisilin
dan 0,1 mg / ml streptomisin
BHK-21 sel dikultur in minimum Essential
Medium ditambah dengan 10% FCS (v / v) ,
100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml
streptomisin
Sel epitel C127I dikultur dalam DMEM (Life
Technologies Gibco) yang mengandung 10%
(v / v) FCS (PAA, Saarbrcken, Jerman), 100
U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin.

 Budaya utama akar dorsal ganglion

(DRG) neuron disiapkan seperti yang
dijelaskan sebelumnya
Neuron tersebut terinfeksi dalam
perjalanan manusia dan murine HSV-1
infeksi
Secara singkat, dewasa C57BL / 6J tikus
dikorbankan, DRG dari serviks, tingkat
toraks dan lumbal hewan yang dibedah
dan dikumpulkan dalam 1x Hank
Seimbang Salt Solution (HBSS,
mengandung 5 mMHEPES, 10 MMDGlukosa, pH 7,4)

 Ganglia pertama kali dicerna selama 20

menit pada 37 C dengan 20 mg / ml
papain (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Jerman) di
papain solusi aktivasi (0,4 mg / ml L-sistein,
0,5 mMEDTA, 1,5 mMCaCl2 2H2O, pH 7,4)
diikuti oleh pencernaan dengan 10 mg / ml
kolagenase IV (Invitrogen) dan 12 mg / ml
dispase II (Sigma-Aldrich) di 1xHBSS.
Ganglia yang pellet dan diresuspensi dalam 1 ml
1xHBSS dan triturated menggunakan pipet
Pasteur dengan ujung menyempit.
Neuron-suspensi itu berputar selama 8 menit
pada 381 g melalui bantal yang terdiri dari
20% (v / v) Percoll di media CO2-independen
(Life Technologies Gibco) yang mengandung 10
MMD-glukosa, 5 mMHEPES, 10% FCS, 100 U / ml
penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin.

 Setelah menghapus supernatan, pelet sel

resuspended dalam 2 ml CO2-independen
menengah dan akhirnya disentrifugasi
selama 2 menit pada 1000 g.
The pelet diresuspensi dalam medium F12 campuran nutrisi Ham mengandung
10% FCS, 50 ng / ml 2,5 S NGF (Promega
Corporation, Fitchburg, WI, AS), 100 U / ml
penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin
dan unggulan ke slip penutup dilapisi
dengan 0,01% (b / v) dalam H2Opoli-Llisin (150,000-300,000 gmol-1SigmaAldrich) dan laminin mencit alami(0,8
gpercoverslip,Invitrogen) dalam 24piring.

 Neuron yang ditanam pada 37Cdan5%

CO2 dalam inkubator dilembabkan dan
sedangberubah dua kali perminggu.
Obatantimitosis 1--Darabinofuranosylcytosine (Sigma-Aldrich)
ditambahkan kekonsentrasi akhir 2Mto
menekan proliferasi membagi, sel-selnonsaraf dan dicuci sebelum infeksi.
Setelah satu minggu budidaya, neuron
yang digunakan untuk melakukan
eksperimen.

VIRUS
Strain patogen mata HSV-1 strain KOS dan isolat ACV resisten
yang disebarkan pada sel Vero dan disimpan pada -80 C.
Untuk pemeriksaan virus titer supernatan sel atau organ yang
homogenizates dititrasi pada sel Vero seperti yang dijelaskan
sebelumnya
Tiga isolat klinis dengan resistensi terhadap ACV [10] yang
baik yang disediakan oleh GeorgesM.GM Verjans (Departemen
Virologi, Erasmus Medical Centre, Rotterdam, Belanda).
Reporter virus HSV-1 (17 +) LoxpMCMVmCherry, HSV-1 pendek (17
+) Lox-Che, telah diturunkan dari HSV-1 (17 +) Lox- pMCMVGFP
Gen GFP dari HSV-1 (17 +) Lox-GFP telah mengganti dengan
gen untuk monomer Cherry (R. Budida, A. Pohlmann, B. Sodeik,
dan G. Behrens, yang akan diterbitkan di tempat lain); kedua
strain mengekspresikan protein fluorescent GFP atau mCherry
sebagai penanda pengganti dapat digunakan untuk memantau
HSV-1 ekspresi gen virus awal.
HSV-1 (17 +) Lox-Che itu disebarkan menggunakan BHK-21 sel
dan dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya
Titer ditentukan oleh tes plak, genom untuk membentuk plak
unit (PFU) rasio ditentukan dengan real time PCR

Antibodi
Antibodi monoklonal mAb 2c dan mAb
hu2c dimurnikan dari hibridoma bebas
serum atau supernatan SP2 / 0 sel
dengan protein kromatografi A seperti
yang dijelaskan sebelumnya
Purity telah dikonfirmasi oleh FPLC? 95%.
Konsentrasi diukur dengan NanoDrop
2000 spektrometer

Netralisasi Assay
Kapasitas netralisasi dari mAb2c ditentukan
pada sel Vero oleh end point pengenceran
seperti yang dijelaskan sebelumnya
Secara singkat, pengenceran serial antibodi
diinkubasi dengan 100 TCID 50 dari HSV-1 KOS
atau isolat klinis resistenACVselama 1 jam
pada37Cdalam medium kultur sel
Virus antibodi inokulum diaplikasikan mono
layers sel Vero tumbuh baik di96piring, dan
efek sitopatik(CPE) yangtercipta setelah48jam
inkubasipada 37C
Konsentrasi antibodiyang diperlukan untuk
penghambatan lengkap virus yang disebabkan
CPE ditentukan sebagai titer netralisasi

Inhibisi penyebaran sel ke

sel
Efektivitas mAb 2c untuk menghambat transmisi sel ke
sel dari strain patogen mata HSV-1 KOS dianalisis
dengan imunofluoresensi seperti yang dijelaskan
sebelumnya
Secara singkat, monolayers konfluen sel Vero, tumbuh
di 24-baik piring kultur jaringan, terinfeksi 100 TCID50
dari HSV-1 KOS. Setelah 4 jam adsorpsi pada 37 C
inokulum virus telah dihapus.
Sel diinkubasi selama 48 jam dalam DMEM yang
mengandung 2% FCS di hadapan 500 nM (75 g / ml)
mAb 2c, dikumpulkan sera manusia (1:40 diencerkan
dalam medium) yang berasal dari donor dengan titer
tinggi imunoglobulin anti HSV (penetral titer 1: 256
total netralisasi 100 TCID50 dari HSV-1 KOS), atau
media saja
Konsentrasi antibodi dalam supernatant sel mewakili
konsentrasi berlebih diperlukan untuk netralisasi
lengkap virus yang dikeluarkan. Pembentukan plak
terdeteksi oleh imunofluoresensi

 HSV-1 sel yang terinfeksi diwarnai dengan

anti-HSV-1/2-gD-antibodi tikus (Acris
Antibodi, San Diego, CA, USA) dan Alexa
Fluor 488 kambing anti IgG antibodi
sekunder spesifik (Invitrogen)
Baik antibodi Manusia atau antibodi
mencit diwarnai dengan Cy3 kambing
terkonjugasi anti IgG tikus atau antibodi
sekunder IgG kambing anti manusia
(Invitrogen), masing-masing
Gambar imunofluoresensi diperoleh
dengan fluoresensi mikroskop Zeiss
Pengamat Z1 (Carl Zeiss, Oberkochen,
Jerman) pada pembesaran 100 kali lipat.

Analisis penyebaran sel

epitel
ke
neuron
dan
Sel C127Inaif ditransfeksikan dengan GFP
mengekspresikan
plasmid
pEGFP-N1 (Invitrogen) untuk
neuron
ke
epitel
identifikasi. Transfeksi dilakukan dengan reagen

GeneJuice sesuai dengan protokol produsen (Merck

Millipore, Darmstadt, Jerman).
Sel terbalik transfected dan diinkubasi selama 24 jam
sebelum digunakan.
Untuk menguji pengaruh antibodi yang berbeda pada
HSV-1 transmisi sel neuron-to-epitel, neuron DRG
terinfeksi 2.5x107 PFU / ml HSV-1 (17 +) Lox-Che. Pada
24 jam pasca infeksi, sel C127I transfected yang terpisah
dengan accutase (GE Healthcare Eropa, Freiburg, Jerman)
dan dicampur dengan antibodi hu2c, 2c atau dengan IgG
manusia dikumpulkan (Anti-HSV-positif; Sigma-Aldrich) di
75 g / ml atau pura-pura diobati.
Campuran sel-antibodi seperti kemudian diunggulkan di
atas neuron DRG yang terinfeksi.

 Untuk menguji dampak dari mAbs 2c dan hu2c pada

epitel sel-to-neuron menyebar, sel C127I terinfeksi
dengan 7,5 106PFU / ml selama 15 jam.
Sel-sel kemudian terpisah dengan accutase, dicampur
dengan antibodi yang ditunjukkan seperti dijelaskan di
atas, dan unggulan di atas neuron DRG naif.
Sel-sel cocultured yang tetap pada titik waktu yang
ditunjukkan dengan PHEMO-fix (68 mM PIPA, 25 mM
HEPES, 15 mM EGTA, 3 mMMgCl2, 10% (v / v) DMSO,
3,7% (b / v) paraformaldehyde (PFA) , 0,05% (v / v)
glutaraldehid, 0,5% (v / v) Triton X-100, pH 6,9) pada
suhu kamar selama 10 menit, dan kemudian dicuci
selama dua kali 5 menit dengan PHEMO-buffer (68 mM
PIPA, 25 mM HEPES, 15 mMEGTA, 3 mM MgCl2, 10% (v /
v) DMSO, pH 6,9) selama 5 menit pada 37 C [26, 27].
Fiksatif sisa dipadamkan dengan 50 mMNH4Cl di PBS.
Situs mengikat tidak spesifik dan Fc-reseptor dari GE
kompleks / GI dari HSV-1 [28] dilucuti oleh inkubasi
dengan memblokir reagen yang mengandung 5% (w /
v) BSA dan 10% (v / v) manusia HSV-1 seronegatif
serum di PBS selama 30 menit.

 Antibodi diencerkan dalam menghalangi

reagen dan diinkubasi dengan sel dalam
ruang dilembabkan selama 30 sampai 60
menit.
Antibodi monoklonal yang ditujukan terhadap
-tubulin-III (mab5564 mouse, Merck Millipore,
Darmstadt, Jerman) digunakan untuk
mengidentifikasi neuron.
Antibodi sekunder untuk mikroskopi
imunofluoresensi terhadap tikus yang
konjugasi Alexa Fluor (Life Technologies
Gibco). Akhirnya, sampel tertanam dalam
pemasangan menengah (6 g gliserol, 2.6
gMowiol 40-88, 6 ml H2O, 12 ml 0.2MTris, pH
8,5) yang mengandung 0,1 g / ml DABCO
(1,4-Diazabicyclo [2, 2, 2] oktan).

 Sampel dianalisis dengan mikroskop Zeiss

Axiovert 200M dilengkapi dengan unit laser
scanning LSM 510Meta confocal dengan argon
(Argon2, 488 nm) dan helium-neon (HeNe1, 543
nm, HeNe1, 633 nm) laser menggunakan 63x
minyak rencana-apochromatic Tujuan -immersion
dengan aperture numerik dari 1,4.
Gambar diperoleh dengan Browser Zeiss
LSMImage (versi 4.2.0.121), dianalisis dengan
ImageJ (Versi 1,45 h, Wayne Rasband, National
Institute of Health, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/)
dan diproses dengan Adobe Photoshop CS4 (Versi
11.0, Adobe Systems Inc, San Jose, CA, USA).
Sebuah area melingkar dari 85 m2 ditempatkan
ke pusat neuron, seperti yang diidentifikasi oleh
-tubulin-III-label atau sel C127I transfected,
seperti yang diidentifikasi oleh ekspresi GFP

Infeksi kornea pada tikus

dan
studi
desain
Tikus dibius dengan injeksi intraperitoneal ketamin hidroklorida (2 mg) dan

mepivacaine hidroklorida (400 ng).

Epitel mata kanan menggaruk delapan kali dalam pola silang dan diinokulasi
dengan 1 105PFU dariHSV-1 KOS di media 5l
Tikus yang terinfeksi baik sistemik atau topikal diperlakukan
denganantibodimAb 2c mencit.
Pengobatan topikal dilakukan oleh inokulasi berkala (5 kali per hari) dari mata
yang terinfeksi dengan 5 l (28,5 g) solusi antibodi (tetes mata) mulai 24 jam
post infeksi (pi) sampai 7 p.i hari ini.
Pengobatan sistemik dilakukan oleh intravena 300 g mAb 2c atau mAb hu2c 24
jam sebelum infeksi untuk profilaksis pra pajanan, atau 24, 40, dan 56 jam
setelah infeksi pasca pajanan untuk imunoterapi.
Perjalanan penyakit yang ditandai dengan penentuan tingkat keparahan
penyakit (skor klinis blepharitis, cacat epitel dan HSK) dengan mikroskop
operasi (Zeiss, Oberkochen, Jerman), masing-masing pada skala 0 sampai 4,
yang konsisten dengan peradangan dari kelopak mata, efek cytopathic dari
sel-sel epitel kornea atau opak kornea dengan neovaskularisasi, edema dan
nekrosis
Viral load mata terinfeksi diukur pada hari ke 5 pasca infeksi dengan uji
standar plak (N = 6 dalam setiap kelompok)
Sel-sel inflamasi di kornea dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya J
umlah sel total dalam limpa dan kelenjar getah bening dihitung setelah
homogenisasi organ dengan saringan sel 70 m (BD Biosciences, Franklin Lakes,
NJ, USA).

Kuantifikasi Sitokin
dengan
Pengeringan ELISA
kelenjar getah bening(DLN) dan
limpa dari mencit yang terinfeksi HSV-1 KOS
yang menerimasalah satu pengobatan antibodi
atau PBS dikumpulkan pada hari ke-14 setelah
infeksi
Setelah organ-organ yang terhomogenisasi dan
5106 sel dikultur tiga ulangan di hadapan
2107 PFUUV-tidak aktif HSV-1 KOS atau media
saja
Setelah24jam, jumlah IL-2 daninterferon(IFN) di
supernatan sel yang dihitung dengan ELISA
(OptEIA, PharMingen, Hamburg, Jerman) seperti
yang dijelaskan sebelumnya

Floriferasi assay

Antigen dan mitogen diinduksi proliferasi dari splenosit atau sel

pengeringan kelenjar getah bening dinilai melalui aliran cytometry
assay berdasarkan seperti yang dijelaskan sebelumnya
Secara singkat, limfosit terwarnai dengan eFluor 670 (eBioscience,
Frankfurt am Main, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik.
1 105sel / baik dikultur dalam 96 cawan yang bawahnya bulat
dengan media, UV-HSV-1 (2 107 PFU / ml sebelum UV-inaktivasi)
atau Concanavalin A (Biochrom, Berlin, Jerman).
Karena pembelahan sel, sel-sel kehilangan setengah dari
fluoresensi dengan masing-masingpembelahan sel.
Setelah 4 hari, sel-sel permukaan bernoda sesuai instruksi pabrik
(eBioscience) menggunakan antibodi monoklonal berikut: tikustikus anti-CD4-PE, rat-anti-mouse CD8-FITC, tikus IgG2a kontrol k
isotipe FITC, dan tikus IgG2b K Kontrol isotipe PE.
Untuk membedakan antara sel-sel yang layak dan tidak layak, sel
diwarnai dengan 7-AAD menurut instruksi pabrik (BD, Heidelberg,
Jerman). Proliferasi dinilai melalui aliran cytometry (FACSCalibur,
BD).
Setidaknya 2.000 layak 7-AAD negatif (BD) CD4 + (eBioscience,
Jerman) dan 1000 CD8 + (eBioscience) dimasukkan untuk analisis.
Data aliran-cytometric dianalisis melalui Cytomation Summit
Offline V3.1. software (Dako, Hamburg, Jerman).

Trigeminal ganglia
Untuk deteksiassay
virus laten, ganglia
Reaktivasi

trigeminal (TG) yang ditanamkan pada

hari ke-14 setelah infeksi dan ditanam
dengan mono layers sel Vero selama tiga
minggu seperti yang dijelaskan
sebelumnya
Untuk mendeteksi efek cytopathic kultur
diperiksa pada interval harian.

Kuantifikasi DNA
HSV-1 genom yang diukur dengan real-time PCR
seperti yang dijelaskan sebelumnya
Secara singkat, DNA dimurnikan dari ganglia
trigeminal dari HSV-1 KOS tikus yang terinfeksi
menggunakan magna Pure LC sistem ekstraksi
asam nukleat otomatis (Roche, Penzberg,Jerman)
sesuai dengan instruksi pabrik.
Jumlah DNA virus kemudian dihitung dengan realtime PCR (LightCycler; Roche) menggunakan
Artus HSV-1/2 LC PCR Kit (Qiagen, Hilden, Jerman).
Batas deteksi analisis untuk HSV-1-DNA diisolasi
dari ganglia trigeminal bertekad untuk menjadi
200 eksemplar / ganglion menurut protokol
pabrik.

Pewarnaan Histologi
Untuk analisismikroskop cahaya, mata
difiksasi(64% isopropanol, 3,7%
formaldehida, 2,5% asam asetat),
dikeringkan dengan isopropanol, dan
ditanam dalam parafin seperti yang
dijelaskan sebelumnya
Bagian lima mikro meter kemudian
diwarnai dengan hematoxylin-eosin
dandianalisis dengan mikroskop cahaya

Deteksi antibody HSVspecifik pada sera and

cairan
mata
Sera (60air
l) dan
cairan air mata (10 l
cairan yang berasal dari mata dibilas
dengan PBS) dari HSV-1 KOS mencit yang
terinfeksi yang dipanen pada hari ke-14
pasca infeksi dan diperiksa untuk
pengikatan terhadap HSV-1 sel yang
terinfeksi Vero oleh aliran cytometry
seperti yang dijelaskan sebelumnya [11].
Data dianalisis dengan menggunakan
Flowjo versi 7.2.5 (Pohon Bintang Inc,
Ashland, OR, USA)

Deteksi sistemik diberikan

antibodi manusia di HSV-1
KOS
Untuk menyelidiki
apakah
antibodi
sistemik diterapkan
kornea
yang
terinfeksi
dapat mencapai kornea terinfeksi, kami memeriksa

bagian jaringan kornea dari HSV-1 KOS tikus yang

terinfeksi setelah injeksi intravena mAb hu2c oleh
imunofluoresensi.
Oleh karena itu, tikus korneanya terinfeksi seperti
dijelaskan di atas dan dosis tunggal 300 g mAb hu2c
antibodimanusia itu disuntikkan intravena 48 jam
pasca infeksi.
Tikus kontrol menerima PBS. Enam jam kemudian mata
telah dihilangkan dan dibekukan dalam nitrogen cair.
Mata beku yang tertanam dalam media jaringan-Tek
O.C.T. (Sakura, Alphen aan den Rijn, Nederlands) dan
dipotong (7 m) dengan Frigocut 2800 mikrotom
(Reichert-Jung, Nussloch, Jerman).

 Bagian beku dikeringkan selama 30 menit,

tetap dengan didinginkan aseton selama 10
menit dan diinkubasi dengan mencegah
penyangga (10% FCS di PBS) selama 15
menit.
Selanjutnya, bagian kornea yang terwarnai
secara bersamaan untuk HSV-1 infeksi dan
terikat mAb hu2c dengan poliklonal anti-HSV 1
FITC antibodi kambing terkonjugasi (Bethyl
laboratorium, Montgomery, USA) dan antibodi
sekunder IgG kambing Cy3-terkonjugasi antimanusia(Invitrogen, Darmstadt, Jerman).
Inti diwarnai dengan Hoechst (Hoechst 33342,
1 g / ml; Sigma, St. Louis, MO) selama 5 menit
sesuai dengan protokol pabrik.
Gambar imunofluoresensi diperoleh dengan
fluoresensi mikroskop Zeiss Observer Z1
dengan perbesaran 200 kali lipat

Analisa Statistik
Data dianalisis dengan menggunakan Graph
Pad Prism 5 (GraphPad PrismSoftware, LaJolla,
CA, USA). Analisis statistik dilakukan dengan
nonparametrik ANOVA(Kruskal-Wallis) da npost
hoc Dunn beberapa tes perbandingan atau
parametrik ANOVA(analisis satu arah) dan post
hocTukey's beberapa perbandingan tes.
Perbedaan antara jumlah yang terinfeksi
secara laten ganglion trigeminal dan jumlah
ganglion trigeminal menunjukkan reaktivasi
diperiksa dengan uji eksak Fisher.
Perbandingan dianggap signifikan pada P<0,05

HASIL

Netralisasi efektif HSV-1

KOS dan isolat klinis ACV
Penyebaran Sel ke sel sangat penting untuk propagasi virus
resisten
dalam kulit dan selaput lendir serta untuk transmisi
dari sel
epitel ke neuron sebelum retrograde transportasi ke
trigeminal dan ganglia akar dorsal, dan juga untuk transmisi
dari neuron ke epitel sel setelah
Oleh karena itu reaktivasi dan transportasi anterograde.
Kamimenandai khasiat antivirus dari HSV-gB spesifik 2c mAb
antibodi monoklonal terhadap HSV-1 KOS dan tiga asiklovir
isolat klinis tahan diperoleh dari pasien dengan HSK [10] .
MAb 2c sepenuhnya dinetralkan viral load yang sama 100
TCID50 dari virus diuji pada konsentrasi 7,8 nM atau 15,6 nM
(data tidak ditampilkan).
Hal ini terkait dengan efisiensi netralisasi yang mAb 2c
dipamerkan untuk obat lainnya sensitif HSV-1 strain dan
isolat resisten obat yang diperoleh dari transplantasi
sumsum tulang [11].
Seperti strain HSV lainnya, patogen matastrain HSV-1
menyebarkan oleh sel ke sel penyebaran menghindari
pertahanan kekebalan tubuh inang [5] .

 Kami karena menganalisis pengaruh mAb 2c pada

penyebaran sel ke sel dari HSV-1 KOS.
Berbeda dengan imunoglobulin manusia (Gambar.
1, baris atas), mAb 2c terbatas infeksi virus ke selsel yang terinfeksi awalnya (Gbr. 1, baris bawah).
Hasil kami menunjukkan bahwa 500 nM (75 g / ml)
dari 2c mAb cukup untuk penghambatan lengkap
dari sel ke sel menyebar. Hasil ini konsisten dengan
penelitian sebelumnya kami dengan HSV-1 F [11].
Untuk menentukan apakah mAbs 2c dan hu2c
mampu menghambat rute langsung dari transmisi
antara epitel dan neuron, baik neuron yang tidak
terinfeksi adalah co-kultur dengan sel yang
terinfeksi epitel (penyebaran sel epitel -neuron)
atau neuron yang terinfeksi adalah co-kultur
dengan sel-sel epitel yang tidak terinfeksi
(penyebaran neuron-ke-sel epitel ) dengan adanya
atau tidak adanya antibodi yang ditunjukkan atau
pooled IgG manusia sebagai kontrol.

 Untuk menguji penghambatan sel-neuron menyebar,

dipisahkan murine DRG yang dilapis dengan HSV-1 (17 +)
Lox-Che terinfeksi sel C127I yang telah diobati dengan
baik dikumpulkan manusia IgG (Gbr. 2C), mAb 2c (Gbr.
2D ), manusiawi mAb 2c (Gbr. 2E) atau yang pura-pura
diperlakukan (Gambar. 2B) sebagai kontrol.
Kuantifikasi sel ke sel penyebaran ditampilkan sebagai
total tingkat fluoresensi yang disebabkan oleh HSV-infeksi
(Gbr. 2F).
Untuk penyelidikan penghambatan sel neuron-todisebarkan oleh mAbs 2c dan hu2c setup berlawanan
digunakan (Gbr. 2G-L).
Dengan demikian, neuron DRG terinfeksi HSV-1 (17 +)
Lox-Che dan dilapis dengan GFP transfected sel C127I
yang diobati dengan antibodi yang ditunjukkan.
Sementara-HSV 1 ditularkan dari sel yang terinfeksi C127I
(panah pada Gambar. 2) ke neuron (panah pada Gambar.
2) dengan tidak adanya antibodi (Gbr. 2B) atau dengan
adanya IgG manusia dikumpulkan (Gbr. 2C) , penambahan
mAb 2c (Gambar. 2Dii) atau manusiawi mAb hu2c
(Gambar. 2Eii) sepenuhnya menghambat penyebaran selneuron seperti yang ditunjukkan oleh kurangnya neuron
primer mengekspresikan mCherry.

 Demikian pula, sel ke sel menyebar dari

neuron yang terinfeksi ke sel C127I ditandai
dengan ekspresi GFP benar-benar dihambat
oleh mAb 2c (Gambar. 2Jiv) atau hu2c
(Gambar. 2Kiv).
IgG manusia sebagai kontrol tidak berdampak
pada penularan virus dalam percobaan ini
(Gambar. 2Iiv).
Secara bersama-sama hasil kami menunjukkan
bahwa mAb 2c menengahi netralisasi virus
yang efektif dan penghambatan transmisi sel
ke sel mata-patogen HSV-1 strain.Selanjutnya,
mAb 2c serta manusiawi mAb antibodi hu2c
yang mampu menghambat transmisi HSV
antara sel-sel dan neuron primer.

Pencegahan penyakit
kornea pada tikus oleh
Berdasarkan sifat unik dari antibodi ini, kami meneliti
khasiat antivirus
pengobatan
mAb 2c topikal
atau
aplikasi
antibodi
sistemik

sistemik pada perjalanan penyakit tikus BALB / c yang

korneanyaterinfeksi dengan 1 105 PFU HSV-1 KOS.
Antibodi ini diterapkan topikal atau sistemik. Empat
belas hari setelah infeksi, sembilan dari sepuluh
kornea dari kelompok kontrol menunjukkan gejala HSK
dengan nekrosis parah dan ulserasi, disertai dengan
kelopak mata yang sangat bengkak dan meradang
(Gambar. 3 dan 4A).
Epitel kornea mata ini menunjukkan lesi epitel,
mencerminkan sitolisis virus pada tahap awal, dan
kerusakan jaringan dan ulserasi pada tahap akhir
penyakit (Gambar. 3 dan 4A), sedangkan refleks matablink bisa lagi induksi.

 Dengan demikian, peningkatan jumlah sel

inflamasi, terutama polimorfonuklear (PMN) dan
sel mononuklear, ditemukan di kornea sentral
(Gbr. 5). Jumlah rata-rata sel inflamasi infiltrasi
kornea sentral dalam kelompok kontrol adalah c =
238,5 / grid (Gbr. 5).
Sebaliknya, perkembangan penyakit kornea HSV
dimediasi sepenuhnya dibatalkan oleh aplikasi
antibodi sistemik bila diterapkan sebagai
profilaksis atau pengobatan pasca-paparan.
Rata-klinis blepharitis, cacat epitel dan HSK
secara signifikan (P <0,05) menurun (Gambar. 3).
Semua tikus sistemik diobati menunjukkan
kelopak mata yang normal dengan hampir tidak
ada peradangan.

 Dengan demikian, infiltrasi kornea oleh sel

inflamasi tidak diamati (c = 0 / grid;.. Gambar
4 dan Gambar 5), dan refleks mata-blink
masih utuh, mirip dengan kornea terinfeksi
(data tidak ditampilkan).
Dari catatan, aplikasi topikal dari mAb 2ctidak
efek menguntungkan pada perkembangan
penyakit kornea (Gbr. 3).
Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam
tingkat infiltrasi sel antara kelompok kontrol
(c = 238,5 / grid) dan kelompok topikal
diperlakukan (c = 137,7 / grid) ditemukan
(Gbr. 5).
Kesimpulannya, hasil ini menunjukkan sukses
mencegah penyakit kornea HSV yang
dimediasi pada aplikasi 2c mAb sistemik.
Ada juga bukti kuat bahwa antibodi dioleskan
tidak berpengaruh pada terapi.

Pengaruh pengobatan
mAb2c pada reaksi imun
Secara signifikan menurun reaksi
inflamasi
anti
HSV

dan infiltrasi sel dalam kornea tikus

sistemik diobati mengarah pada asumsi
bahwa mAb 2c juga dapat mempengaruhi
respon imun sistemik setelah infeksiHSV-1.
Untuk menyelidiki lebih lanjut ini, kami
memeriksa nomor jumlah sel dalam
pengeringan kelenjar getah bening (DLN)
dan limpa, dan HSV-1 titer antibodi spesifik
dalam serum dan cairan air mata tikus
pada hari ke-14 pasca infeksi.

 Sesuai dengan pengamatan klinis, DLNs

tikus kontrol atau tikus menerima
pengobatan topikal terilhat perkembangan
nya secara mencolok.
Total jumlah sel di DLNs yang 3,1 10 7
8,7 106 (kontrol) atau 3,5 107 9.2
106 (pengobatan topikal) masing-masing
yang secara signifikan lebih tinggi bila
dibandingkan dengan tikus diobati
sistemik (profilaksis: 1,3 1071,0 x 106;
terapi: 1,0 107 3,7 x 106) (Gambar 6A).
Perbedaan ini tidak diamati dalam limpa
tikus dari kelompok yang berbeda
(Gambar. 6B).

 Secara signifikan titer antibodi rendah

ditemukan di sera dan air mata cairan tikus
diobatisistemik jika dibandingkan dengan
kontrol atau kelompok perlakuan secara
topikal (Gambar. 6C dan D).
Tidak ada antibodi HSV-spesifikyang terdeteksi
dalam cairan air mata tikus diobatisistemik.
Sebaliknya, kadar antibodi serupa ditemukan
dalam cairan air mata topikal yang diobati dan
tikuskontrol.
Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan
bahwa baik respon imun seluler dan humoral
terhadap HSV-1 jelas menurun setelah aplikasi
2c mAb sistemik.

Berkurangnya respon imun

spesifik HSV-1 pada tikus
Jumlah sel menurun di pengeringan kelenjar getah bening
yang
diobati
secara
dari mAb 2c tikus perlakuan
menunjukkan
bahwa
rute
sistemik aplikasi mungkin mengurangi respon imun seluler
sistemik
HSV-1 spesifik.

Untuk menentukan peran CD4 + dan CD8 + limfosit

setelah terapi antibodi analisis berikutnya respon sel T
dilakukan.
Respon proliferatif dari splenosit atau DLN-limfosit setelah
stimulasi dengan antigenHSV-1 menunjukanrespon imun
spesifik terutamaHSV-1 didorong oleh sel CD4 + T (Gbr. 7).
Sel CD4 + T proliferasi meresponsecara nyata berkurang
ketika tikus diobatisistemik dengan mAb 2c (Gbr. 7).
CD4 + Type-1 T limfosit (Th1) terutama mensekresi
interleukin 2 (IL-2) dan IFN- ditunjukkan untuk terjadinya
immunopatologi dalam perjalanan penyakit kornea [36-38].

 Untuk menyelidiki apakah pengobatan mAb 2c

mempengaruhi sekresi IFN- dan IL-2, kita
perlakukan 5 tikus BALB / c dengan 300 g mAb
2c atau PBS oleh intravena injeksi 24 jam
sebelum infeksikornea HSV-1 KOS.
Setelah 14 hari kami menganalisis produksi
sitokin limfosit yang diisolasi dari pengeringan
kelenjar getah bening atau limpa setelah
stimulasi dengan-tidak aktif UV HSV-1 KOS.
Sekresi IFN- dan IL-2 berkurang secara
signifikan di DLN-limfosit dan splenosit diisolasi
dari tikus diobatisistemik dengan mAb 2c (Gbr.
8).
Secara bersama-sama, hasil ini
mengkonfirmasi bahwa mAb 2c secara
signifikan mengurangi respon HSV-1spesifik
CD4 + T pada tikus yang diobatisecara
sistemik.

Efektifitas Netralisasi HSV1

oleh
mAb2c
ditempat
Untuk menyelidiki apakah pengobatan topikal atau
infeksi
sistemik dengan mAb 2c dapat menurunkan
viral

load di tempat infeksi, kita isolasi mata awalnya

terinfeksi dari 6 tikus perwakilan dari masingmasing kelompok pada hari ke 5 setelah infeksi
dan memeriksa konten virus menggunakan alat
tes plak standar.
Sistemik diterapkan mAb 2c dimediasi
pengurangan substansial dari HSV-1 di mata
terinfeksi (Gambar. 9).
Penurunan besar viral load diamati pada tikus
yang menerima dosis tunggal 300 g mAb 2c 24
jam sebelum infeksi.

 Terlihat penurunan yang signifikan dari viral

load terdeteksi pada tikus yang menerima tiga
dosis terapi (300 g) dari mAb 2c, mulai 24 jam
setelah infeksi (Gbr. 9).
Dalam kelompok ini virus benar-benar
tersingkir di 5 dari 6 tikus.
Sebaliknya, tidak ada pengurangan dari titer
virus diamati pada tikus yang diobati dengan
mAb 2c mengandung tetes mata.
Hasil ini jelas menunjukkan bahwa mAb 2c
efektif mengurangi HSV-1 di situs kornea
infeksi bila diterapkan secara sistemik.
Hasil ini konsisten dengan perjalanan
penyakitdan menunjukkan bahwa efektifitas
netralisasi virus mungkin penting untuk
pencegahan HSK.

Efektifitas Pengurangan
penyebaran virus dan
Tingkat
keparahan penyakit
kornea
sangat
berkorelasi
reaktivasi
dari
TG
dim
Ab2c
dengan frekuensi reaktivasi HSV dari pada pasien
terinfeksi HSVpada
laten.
mencit perlakuan

Dilihat dalam konteks ini, kita hipotesis bahwa

membatasi penyebaran virus HSV ke neuron anatomis
terkait di mana virus maka biasanya menetapkan
latency mungkin memiliki efek menguntungkan pada
terjadinya reaktivasi.
Akibatnya, kita menyelidiki apakah mAb 2c mampu
menghambat penyebaran virus HSV ke ganglia
trigeminal oleh uji virus reaktivasi.
Oleh karena itu, ganglia trigeminal diisolasi dari situs
ipsilateral dan kontralateral mata terinfeksi pada hari ke14 setelah infeksi.

 Ganglia yang co-kultur dengan sel Vero selama tiga

minggu, dan dimonitor untuk reactivations virus.
Pemulihan HSV-1 diamati pada semua ipsilateral
dan kontralateral TG terisolasi dari tikus kelompok
kontrol (10/10).
Pada tikus diobatitopikal, virus diaktifkan kembali
itu sama ditemukan di 10/10 dari ipsilateral TG dan
8/10 dari kontralateral TG, mengungkapkan tidak
ada perbedaan yang signifikan jika dibandingkan
dengan kelompok kontrol.
Sebaliknya, secara sistemik diterapkan mAb 2c
signifikan membatasifrekuensireaktivasi virus dari
ganglia trigeminal.
Meskipun virus dapat diaktifkan dari 10 dari 10
(profilaksis) atau 9 dari 10 (terapi) ganglia
ipsilateral, tidak ada virus pengaktifan ditemukan di
situs kontralateral dari infeksi.

 Data ini menunjukkan penghambatan

efektif virus menyebar dari ipsilateral ke
ganglia kontralateral (Gbr. 10A).
Untuk memverifikasi temuan kami
mengulangi percobaan ini (5 tikus masingmasing kelompok) dalam kondisi yang
sama dan dihitung DNAHSV-1 dari ganglia
trigeminal.
Tidak ada HSV-DNA dapat dideteksi pada
ganglia kontralateral tikus 2c diperlakukan
secara sistemik mAb.
Sebaliknya, HSV-DNA terdeteksi pada 5/5
ipsilateral dan kontralateral 4/5 ganglia
pada kelompok kontrol PBS (Gambar.10C).

 Menariknya, percobaan reaktivasi

mengungkapkan tidak ada perbedaan antara
kelompok yang menerima mAb 2c
sebelumnya atau post infeksi.
Namun, penularan virus ke TG mata yang
terinfeksi tidak dapat dicegah pada tikus
yang terinfeksi dengan dosis tinggi (1 10 5
PFU) dari HSV-1 KOS.
Untuk menyelidiki apakah penyebaran virus
ke ipsilateral TG dapat benar-benar dihambat
oleh mAb 2c dalam infeksi HSV dosis rendah,
5 tikus per kelompok terinfeksi dengan dosis
menurun virus (105, 104 atau 103 PFU) dari
HSV-1 KOS 24 jam setelah intravena
penerapan 300 g mAb 2c.

 Mengaktifkan virus dari ipsilateral TG dapat

dideteksi pada 5/5 atau 2/5 tikus yang tidak
diobati terinfeksi 104 atau 103 PFU HSV-1
KOS.
Sebaliknya, frekuensi virus mengaktifkan itu
nyata berkurang pada tikus secara
diobatisistemik dengan mAb 2c.
Virus mengaktifkan dapat dideteksi pada 3/5
tikus yang terinfeksi dengan 104 PFU HSV-1
KOS, dan tidak ada reaktivasi diamati dari
ganglia tikus yang terinfeksi dengan 103 PFU
HSV-1 KOS (Gbr. 10B).
Hasil ini menunjukkan bahwa penularan
virus dari pinggiranke ganglia trigeminal
mungkin dihambat oleh mAb 2c dalam
infeksi virus tergantung dengan dosis.

Pencegahan HS Koleh
antibodi
manusia
mAbhu2c
Berkaitan dengan aplikasi klinis masa depan

antibodi monoklonal HSV-gB spesifik pada manusia

untuk pencegahan HSK, kami kemudian meneliti
efek perlindungan dari varian antibodimanusia ini
(mAb hu2c) di corneatikus yang terinfeksiHSV-1.
Karena rute topikal aplikasi tidak menunjukkan efek
perlindungan pada perkembangan penyakit kornea,
hanya aplikasirute sistemik diselidiki untuk mAb
hu2c.
Tikus terinfeksi dengan HSV-1 KOS dan sistemik
diobati dengan mAb hu2c sebelum pasca infeksi
HSV-1 seperti yang dijelaskan di atas untuk
antibodi tikus tua.
Antibodi manusia terbukti sama-sama efektif dalam
pencegahan HSK jika dibandingkan dengan
antibodi tikus.

 Gejala yang menyertai dari HSK (blepharitis,

cacat epitel dan HSK) secara signifikan (P
<0,05) menurun pada tikus secara sistemik
diobati dengan mAb hu2c, dibandingkan
dengan kontrol (Gambar. 11).
Semua tikus yang diobati menunjukkan
kelopak mata yang normal dengan hampir
tidak ada peradangan.
Mata-blink refleks masih utuh dan mirip
dengan kornea terinfeksi (data tidak
ditampilkan).
Secara bersama-sama, baik antibodi tikus tua
serta varian manusiawi yang menunjukkan
efek perlindungan yang sama pada
pengembangan HSK dan kebutaan pada
model tikus yang sangat relevan.

Deteksi sistemik diberikan

mAbhu2c
dikornea
Tidak adanya antibodi HSV-spesifik dalam cairan air mata tikus
diobati secara sistemik menunjukkan bahwa adanya antibodi dalam
cairan air mata mungkin tidak berdampak padaterinfeksi
perkembangan
penyakit.
Namun, mengurangi viral load di mata tikus diobati secara sistemik
menunjukkan bahwa antibodi disuntikkan mungkin menetralisir
virus.
Untuk mengklarifikasi apakah sistemik diterapkan mAb hu2c benarbenar dapat mencapai jaringan kornea menunjukkan aktivitas
antivirus, kami memeriksa bagian kornea berasal dari HSV-1 KOS
terinfeksi tikus intravena disuntikkan dengan mAb hu2c di infeksi
pasca 48 jam oleh imunofluoresensi.
Mata diisolasi dan dipotong enam jam setelah injeksi untuk
memungkinkan antibodi untuk berdistribusi ke jaringan kornea.
Antibodi manusia terdeteksi pada kornea terinfeksi HSV ketika
colocalized dengan antigen HSV.
Sebaliknya, tidak ada antibodi dapat dideteksi pada kornea
terinfeksi, termasuk fluoresensi mengikat atau latar belakang tidak
spesifik (Gbr. 12).
Hasil ini memberikan bukti untuk distribusi sukses mAb hu2c ke
kornea terinfeksi.

Diskusi

 Meskipun kemajuan medis yang sangat besar selama

dekade terakhir, herpes stroma Keratitis masih tetap
menjadi penyebab utama kebutaan kornea menular.
Sampai saat ini, tidak ada vaksin yang efektif yang
tersedia [39, 40].
Penggunaan obat-obatan antiviral tersebar luas, tetapi
terbatas karena toksisitas dan resistensi virus [41].
Meningkatnya prevalensi asiklovir dan multidrug
resistant strain HSV (6,4%) di antara pasien dengan
HSK adalah penyebab utama kegagalan terapi
inflamasiInfeksi HSV kornea [8, 42].
Penggunaan antibodi monoklonal untuk pencegahan
infeksi HSV kornea yang luas dibahas dalam penelitian
sebelumnya [7, 43-47].
Antibodi monoklonal yang ditujukan terhadap HSV
glikoprotein gB, gC, gD, dan GE menunjukkan efek
menguntungkan pada tingkat keparahan penyakit
kornea pada tikus di bekas penelitian [44].

 Meskipun perlindungan terbatas dari HSK

juga bisa diamati pada tikus yang diobati
dengan non-antibodi monoklonal spesifik
untuk HSV-1 gC, efek terapi terbaik bisa
dicapai pada tikus diobati dengan antibodi
monoklonal menetralkan Fd79 dan mAb 8D2,
khusus untuk glikoprotein gB dan gD, masingmasing [7, 43, 44].
Meskipun demikian, pretreatment antibodi
bahkan tidak diselidiki (Fd79) atau gagal
(mAb 8D2) untuk mencegah perkembangan
kekeruhan kornea [43].
Sampai saat ini, tidak ada antibodi ini
selanjutnya dilaporkan untuk penggunaan
klinis.

 Konsisten dengan temuan bahwa beberapa vaksin

HSV eksperimental yang protektif pada model
binatang tetapi tidak pada manusia, studi terbaru
menunjukkan bahwa kualitas respon imunhumoral
terhadap HSV signifikan berbed antara manusia,
marmut da nmencit .
Ketika vaksin rekombinan gD sangat menginduksi
antibodi pada model binatang, respon netralisasi
hanya lemah yang terdeteksi dalam vaksin manusia.
Sebagian besar antibodi manusia gD-spesifik tidak
efisien bersaing dengan epitop gD terlihat sangat
oleh antibodi monoklonal berasal dari mencit[48].
Hasil ini menunjukkan bahwa mencit mampu
meningkat respon antibodi lebih kuat terhadap HSV
dari manusia.
Terhadap latar belakang ini, evaluasi antibodi
netralisasi tikus ampuh untuk penggunaan klinis
masa depan tampaknya merupakan strategi yang
menjanjikan untuk memerangi infeksi HSVparah.

 Karena kebutuhan klinis bertahan untuk

mengatasi resistan terhadap obat HSV-infeksi,
kami baru-baru memanusiakan para gB
spesifik antibodi monoklonal mAb 2c yang
mampu menetralkan ACV dan isolat resisten
multi-dari sumsum tulang pasien transplantasi
in vitro dan dalam NOD sangat imunosupresi /
model tikus SCID [11].
The manusiawi mAb antibodi hu2c dan antibodi
tikus orangtua keduanya mengakui epitop yang
sama yang sangat kekal antara HSV-1 dan HSV2 dan penting untuk kebugaran virus.
Mutasi dalam kedua subdomain epitop
mengakibatkan kerugian dramatis infektivitas
[13].
Kedua antibodi menunjukkan sifat penetral
sama terhadap HSV-1 dan HSV-2, secara
independen dari pelengkap atau fungsi efektor
sel antibodi-bergantung[15].

 Dalam penelitian ini kami pertama kali

meneliti khasiat antivirus dari 2c mencit
mAb dalam pencegahan kornea HSVinfeksi dalam model mencit mapan HSK.
Selanjutnya kami fokus pada dampak
pengobatan antibodi pada tingkat respon
imun terhadap HSV yang berhubungan
dengan keparahan disease.
With hormat kornea untuk aplikasi klinis
masa depan, kami akhirnya melakukan
investigasi apakah varian mAb
hu2cmanusia mencegah HSK sebanding
dengan antibodi tikus tua.

 HSK telah terbukti memiliki asal immunopathological

inflamasi [53]. Mekanisme yang tepat dimana
antibodi monoklonal spesifik untuk HSV glikoprotein
memberi efek protektif pada pengembangan HSK
masih belum diketahui.
Beberapa pengamatan menunjukkan bahwa antibodi
mencegah penyakit kornea lebih efektif bila
dibandingkan dengan antibodi non neutralizing [7].
Sebaliknya, penetral antibodi spesifik untuk
glikoprotein D yang efektif mencegah HSK tidak
berdampak signifikan pada beban virus di mata [43].
Antibodi diselidiki dalam penelitian ini secara efektif
dinetralkan HSV-1 di mata.
Hasil ini menunjukkan bahwa netralisasi virus
sebenarnya bukan satu-satunya mekanisme yang
terlibat dalam pencegahan penyakit kornea.
Namun, penelitian sebelumnya telah menunjukkan
bahwa antibodi HSV-spesifik dapat melindungi
terhadap HSK dengan menghambat produksi kemokin
diyakini untuk meminisiasi inflamasirespon imun
terhadap HSV [45].

 Sesuai dengan temuan ini, keterbatasan sel infiltrasi ke

kornea, pengurangan jumlah total sel dalam
pengeringan,kelenjar getah bening mengurangi respon sel
CD4 + T dan tingkat antibodi berkurang secara signifikan
dalam cairan air mata dan sera tikus diobatisecara
sistemik menunjukkan bahwa mAb 2c juga dapat
melindungi dari HSK oleh penurunan yang signifikan dari
respon imun.
Kemungkinan besar, bertanggungjawab
berkurangnyakekebalan merupakan konsekuensi dari
netralisasivirus oleh mAb 2c.
Khususnya, T-sel yang bertanggungjawabpada infeksiHSV1 memainkan peran penting dalam inisiasi kerusakan
jaringan dalam kornea.
Neutrophiles dan monosit juga menyusup kornea dan
terlibat dalam patogenisitas [30, 45].
Ada bukti substansial bahwa T limfosit-tipe 1 (Th1)
terutama mensekresi interleukin 2 (IL-2) dan interferon
(IFN) - bersifat patogen dalam evolusi penyakit kornea,
karena netralisasi IL-2 dan IFN- hasil dari remisi pada HSK
[36-38, 54].
Sebaliknya, Th2 sitokin terkait IL-4 dan IL-10 menekan
perkembangan HSK [22].

 Hal ini umumnya diterima bahwa pengembangan dan

perkembangan HSK sangat tergantung pada frekuensi
HSV reaktivasi [55, 56].
Antibodi menghambat penyebaran saraf melalui
transmisi sel ke sel secara signifikan dapat mengurangi
frekuensi reaktivasi dan dengandemikian memiliki
dampak berkelanjutan pada munculnya HSK [56].
Meskipun mekanisme secara tepat dari transportasi
DNA virus atau melepaskan dari akson masih belum
diketahui, beberapa pengamatan juga menunjukkan
bahwa antibodi bisa langsung mengganggu aksonal
HSV-1 menyebar in vitro ke in vivo [57, 58].
Dalam penelitian ini kami menunjukkan bahwa mAb
2c dan kedua bagian manusia, baik yang mampu
mengganggu transmisi sel ke sel antara sel-sel epitel
dan neuron.
Selain itu, kami menemukan bahwa pengobatanmAb
2c sistemik terbatas pembentukan laten ke ganglion
trigeminal ipsilateral, menunjukkan bahwa
penyebaransaraf sepanjang serabut saraf ke ganglion
kontralateral terputus.

 Akhirnya, pengobatan sistemik dengan antibodi

mAbhu2c manusiadimediasi perlindungan yang
sama dari pengembangan HSK jika dibandingkan
dengan antibodi mencit.
Hal ini berkorelasi dengan hasil dari studi
sebelumnya di mana kedua antibodi menunjukkan
aktivitas antiviral yang sama di bawah kondisi
imunosupresi [11, 15].
Kesimpulannya, kami telah menunjukkan bahwa
antibodi monoklonal mAb2 cefektif menetralkan
isolat ACV resisten daripasien dengan sering infeksi
berulang korneain vitro, dan mencegah
perkembangan HSK pada tikus. Selain itu,varian
mAbhu2c manusia mencegah perkembangan HSK
dengan khasiat yang sama bila dibandingkan
dengan antibodi orangtua.
Fitur-fitur ini menjamin perkembangan klinis
antibodi ini untuk pengobatan dan pencegahan,
infeksi kornea yang resistan terhadap obat yang
parah pada pasien.