Anda di halaman 1dari 70

Teknologi dna rekombinan

(GENETIC ENGINEERING)

DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.

Teknik Rekombinan meliputi:


-Teknik untuk mengisolasi DNA
-Teknik untuk memotong DNA.
-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.
-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup
sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan
dapat diekspresikan

Organisme transgenik:
organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis
organisme lainnya.
Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika
Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA Rekombinan
kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk
mengkombinasikan gen-gen secara buatan.

Apa Rekayasa Genetika?


Definisi:
Perubahan genetik suatu organisme, atau keturunan,

teknik untuk menghilangkan karakteristik bahan yang


tidak diinginkan atau untuk menghasilkan bahan
yang baru yang diinginkan.

Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal

dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang


diinginkan

Isolasi dan pemurnian DNA


Isolasi DNA bakteri
Isolasi DNA plasmid
Pemurnian secara kimiawi dan enzimatis
Berbagai jenis dan karakterisasi
vektor
vektor plasmid
vektor yeast
vektor bakteriofag
Enzim restriksi dan ligase
Jenis enzim restriksi
Faktor yang berpengaruh terhadap enzim
restriksi
Faktor yang berpengaruh terhadap enzim
ligase

Teknik Elektroforesis dan PCR


Faktor yang berpengaruh dalam
elektroforesis
Faktor yang berpengaruh terhadap PCR
DNA sekuensing dan
hibridisasi
southern blot
northern blot
western blot
DNA rekombinan dan
Transformasi
Isolasi
Restriksi
Sel kompeten
Transformasi

Rekayasa genetik pada :


Rekayasa genetik pada hewan
Rekayasa genetik pada
tumbuhan
Rekayasa genetika pada
manusia
Produk transgenik, keamanan dan
bioetika
Biosafety
bioetika
GMO dan genetically modofied foods

Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai

teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah


gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan
Genetically Modified Organism (GMO) dengan
genotipe baru
Berbagai jenis modifikasi genetik yang
mungkin: memasukkan gen asing dari satu
spesies menjadi
- spesies lain,
- membentuk organisme transgenik;
- mengubah gen yang ada sehingga produknya
berubah, - mengubah ekspresi gen sehingga
ditranslasikan lebih sering atau tidak sama sekali

MENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?

Awalnya manipulasi genetik secara tradisional


seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman
terlalu lambat
Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme
dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)
Kloning gen untuk menentukan fungsinya
Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat
yang diinginkan

Rekayasa genetika dengan teknik molekuler


Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar
pada kecepatan yang jauh lebih cepat
Produksi bahan farmasi dalam jumlah besar

Teknik Dasar Rekayasa Genetika


Selective Breeding
Tanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan
paling banyak digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut

Hybridization (Crossbreeding)
Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk
menggabungkan karakteristik terbaik dari keduanya.
(burung dara + perkutut = sinom)

Recombinant DNA Technologies


Transformasi

Basic steps in genetic engineering


1.
2.
3.
4.
5.

Isolasi gen
Insersi ke dalam host menggunakan vector
Perbanyak copy DNA sebanyak mungkin
Pemisahan produk gen yang dihasilkan
Ekstraksi produk gen yang diinginkan

Fluorescent proteins are a useful tool


in biotechnology
Menjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein

target dalam sel-sel hidup suatu organisme

Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein

(GFP) pertama kali diisolasi dari Victoria aequorea (ubur-ubur),


dapat dilekatkan ke hampir semua protein dan yang menarik
dan masih dapat menjadi fluorescent molecule.

Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya

belum di-karakterisasi untuk memvisualisasikan dan melacak


protein untuk lebih memahami peristiwa selular.

Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan

Hewan Transgenik
Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem

kekebalan tubuh dan penyakit genetik

Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk

transplantasi

Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin

Organisme rekombinan
Tanaman tahan hama
jagung (gen toksin dari

Bacillus thuringiensis
yang dapat membunuh serangga)
Tanaman tomat
Golden rice (beta-carotene)
Plant-based vaccines

Genetically Modified Organisms


Tanaman tahan hama
Jagung Bt (mengandung gen toksin dari

Bacillus

thuringiensis yang membunuh hama)


Golden rice (mengandung beta-carotene)
Tanaman sebagai vaksin

Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn)


Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants

Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying


insecticide
Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila
memakan jagung

Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanaman

Golden Rice mengandung gen untuk menghasilkan vitamin A

Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti


vitamin A dan precursornya (-carotene).
Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan
penurunan sistem imun tubuh.

HUMAN GENETIC ENGINEERING


Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen

dalam sel manusia yang hidup

Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang

disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru.


Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan
akan sembuh .

Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan

gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan


untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan
gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya

HUMAN GENETIC
ENGINEERING

"Somatic" genetic engineering


Rekayasa genetika yang menargetkan gen di organ

tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa


mempengaruhi gen dalam telur atau sperma.
Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani
uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat
ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan
dengan efektif

"Germ line" genetic


engineering
Rekayasa genetika yang menargetkan gen dalam
telur, sperma, atau embrio sangat awal
Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam
tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan
kepada semua generasi berikutnya

[note: The term "somatic" comes from the Greek


"soma" for "body."
The term "germline" refers to the "germ" or
"germinal" cells, the eggs and sperm.

Produk DNA Recombinant untuk terapi


pada manusia

Insulin (diabetics)
Factor VIII (males w/hemophilia A)
Factor IX (hemophilia B)
Human growth hormone
Erythropoietin (anemia)
Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs)
leptin

DESIGNE
R BABY

Kesulitan pada Rekayasa Genetika


Manusia
Inserting gene in correct cells
Inserting gene so it is expressed correctly

Orientation
Regulation
Controlling virus vector
Ethical issues

KLONING GEN

Kloning - definisi
Dari Bahasa Yunani - klon, ranting
Kumpulan turunan suatu individu

yang dihasilkan tanpa melalui


perkawinan; kumpulan replika
sebagian atau seluruh makromolekul
(contoh, DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu
sel somatik induknya serta memiliki
identitas genetik yang sama dengan
induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang
semua identitasnya sama dengan
molekul atau sel penurunnya

Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau
mengidentifikasi dan memperbanyak
suatu potongan DNA tertentu (klon) yang
dikehendaki dari campuran potonganpotongan DNA yang kompleks.

Kloning Gen
Ketika keseluruhan

DNA dari suatu


organisme
diekstraksi, akan
diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
Pada kloning gen,
hanya gen (DNA)
tertentu yang
diisolasi,
dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)

Tujuan mengklon Gen


Menentukan urutan basa nukleotida

penyusun gen tersebut


Menganalisis atau mengidentifikasi
urutan basa nukleotida pengendali gen
tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim
yang disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi
pada kecacatan gen yang
mengakibatkan penyakit bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan
tertentu, misalnya memproduksi
insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Sumber DNA untuk


diklon

DNA kromosom
cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA sebagai
cetakan (template)
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR

Bahan / Alat untuk


Mengklon

Enzim endonuklease restriksi


Enzim ligase
Vektors

Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke

dalam sel inang

Memotong DNA
Menggunakan enzim

endonuklease restriksi
Ujung lengket (sticky

ends)
Ujung tumpul (blunt
ends)

Penamaan enzim
EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli)
R = strain
I = # of enzyme

Penyambungan (pasting)
DNA
Pembentukan

ikatan-H pada
ujung-ujung yang
komplemen (sticky
ends)

Ligase membentuk

ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA

Vektor untuk
Mengklon

Diperlukan suatu wahana


(vehicle) untuk
memasukkan suatu
potongan DNA ke dalam sel
agar DNA tersebut dapat
disimpan dan diperbanyak
di dalam sel tersebut

Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal
DNA) yang secara alami dimiliki suatu
jasad
Bentuknya benang ganda (double strands
DNA, dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat
dibuat dengan menambahkan potonganpotongan DNA lain

Vektor untuk
Mengklon
Plasmid dapat dimodifikasi untuk
mampu membawa potongan DNA lain
ke dalam sel bila memiliki:
Replikator (origin of replication)
Penanda (Marker) yang mudah diseleksi

(misalnya gen ketahanan terhadap


antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA
yang memiliki urutan basa nukleotida
yang menjadi sasaran enzim restriksi
tetapi tidak terletak di dalam daerah
replikator atau penanda

Plasmid yang Dimiliki oleh


Escherichia coli

Berasal dari plasmid alam


Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan

Plasmid Khimera (Chimeric


Plasmids)

Khimera berasal dari mitologi Yunani,


makhluk dengan tubuh gabungan dari
bagian-bagian makhluk binatang lain
Setelah pemotongan plasmid
menggunakan suatu enzim restriksi,
potongan DNA asing yang memiliki ujung
pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan
DNA asing disambung, akan dihasilkan
"plasmid rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi
dalam sel inang yang sesuai

Kloning Terorientasi
Bila
diinginkan
untuk
menginsersikan
potongan
DNA
asing dengan orientasi tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA
vektor maupun DNA sumber gen
yang dikehendaki menggunakan
dua enzim restriksi yang berbeda

Vektor untuk
Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial
Chromosome) & YAC (Yeast
Artificial Chromosome)

Vektor berupa
Plasmid
1.
Memiliki origin of replication dari
inang yang dituju, sehingga
memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif:
Memudahkan seleksi sel pembawa
plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan
(multiple cloning sites, MCS)

Multiple Cloning Site


(MCS)

Vektor berupa
Plasmid

Vektor berupa
Plasmid
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan

DNA ukuran kecil (< 10kbp)


Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon

potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

Bakteriofaga ( phage)

Vektor berupa bakteriofaga


( vectors)

Lengan kiri:
Protein penyusun

kepala & ekor


Lengan kanan:
Sintesis DNA
Pengendalian
Lisis inang
Daerah yang
dihilangkan:
integrasi & eksisi
Pengendalian

Vektor berupa bakteriofaga


( vectors)

Vektor berupa
Bakteriofaga
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon

potongan DNA ukuran besar (10 - 23


kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya

Vektor
Gabungan
Cosmid sifat vektor plasmid dan
sifat berguna dari situs cos
(dihilangkan pada vektor )

Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA berukuran sangat
besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:
Tidak terlalu mudah untuk
mengerjakan plasmid dengan
ukuran sangat besar (~ 50 kbp)

Vektor
Cosmid

Vektor BAC
Replikasi dimediasi

oriS dan oriE


parA and parB
mengendalikan
agar hanya
terdapat satu
vektor dalam sel
Menggunakan
penanda ketahanan
terhadap
KhloramfenikolR

Vecktor YAC
large
inserts
HIS3
URA3
ARS
telomere
centromere markers
replication
origin

telomere

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000

kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

BACs dan YACs


BACs : Bacterial Artificial
Chromosomes
YACs
:
Yeast
Artificial
Keunggulan:
Chromosomes

Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA


dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan
urutan basa nukleotida total genom

Kelemahan:
Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan

ukuran sangat besar

Shuttle Vector
Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang

(memiliki origin of replication dari masing-masing


inang)

Memilih Vektor
Ukuran DNA yang

disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim
restriksi yang
tersedia
Jumlah salinan
(copy number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk
menapis DNA
sisipan
Rencana penelitian
selanjutnya

Cara
Mengklon
DNA
(1)
Isolasi vektor kloning

(plasmid bacterial) & DNA


sumber gen
Pemotongan DNA sumber
gen & vektor kloning
menggunakan enzim
restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam
vektor kloning yang telah
dipotong menggunakan
enzim restriksi yang sama;
potongan disambung
dengan bantuan enzim DNA
ligase

Cara Mengklon DNA (2)


Vektor kloning yang

telah tersisipi
potongan DNA
dimasukkan ke dalam
sel inang (transformasi
sel inang)
Penapisan sel
pengklon (dan gen
yang dimasukkan)
Identifikasi sel
pengklon pembawa
gen yang dikehendaki

Transformasi Sel Inang


Memasukkan plasmid (yang
merupakan vektor yang telah
disisipi gen) ke dalam sel
inang

Transformasi
PRA-INKUBASI

Sel E. coli calon penerima plasmid


dipaparkan kepada ion positif kalsium
klorida (CaCl2). Perlakuan ini
memberikan cekaman kepada bakteri
yang mengakibatkan membran sel dan
dinding sel bakteri tersebut menjadi
permeabel terhadap plasmid donor.
Proses ini mengakibatkan E. coli
menjadi kompeten" untuk menerima
plasmid .

Transformasi
INKUBASI

Plasmid ditambahkan ke dalam

suspensi sel E. coli kompeten.


Suspensi sel E. coli kompeten
lainnya yang tidak ditambah
plasmid digunakan sebagai
kontrol.

Transformasi
KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)

Sel kompeten (baik yang diberi


plasmid maupun kontrol) dipaparkan
sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC.
Langkah ini memaksimumkan
masuknya plasmid menembus
membran dan dinding sel.

Transformasi
PENYEMBUHAN (RECOVERY)

Sel kompeten (baik yang diberi


plasmid maupun kontrol)
ditumbuhkan dalam medium kaya
nutrisi untuk memberi kesempatan
penyembuhan setelah mengalami
cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung
satu waktu generasi (untuk E. coli
berkisar antara 30 hingga 45 menit)

Transformasi
PENAPISAN (SCREENING)

Sel kompeten yang telah mengalami


penyembuhan ditapis pada medium
padat yang mengandung senyawa
penapis berdasarkan penanda yang
dibawa oleh plasmid.

Koloni E. coli yang membawa


plasmid dengan penanda gen
pendar fluor (pGLO)

E. coli yang Membawa


Plasmid pGlo

Penapisan Klon
Medium pertumbuhan

diberi antibiotik yang


sesuai dengan sifat
ketahanan yang
digunakan sebagai
penanda, misalnya
Kanamisin
Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid
dengan penanda
ketahanan terhadap
Kanamisin(Kanr), yang
di sebelah kiri tidak
memilikinya

Manfaat
Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu
pengetahuan maupun dibidang terapan.
Contoh:
Bidang Kesehatan:
Insulin manusia
telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetis.
Merekdagang: HumulinR
Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk
mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).
Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi
secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri