Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan kadar glukosa
dalam
darah.
Jenis
pemeriksaan
yang
dilakukan
adalah
pemeriksaan kadar glukosa darah puasa dan kadar glukosa 2 jam
setelah makan atau 2 jam pp. Glukosa puasa adalah pemeriksaan yang memerlukan puasa 8 jam sebelum darah diambil untuk diperiksa. Puasa adalah keadaan tanpa suplai makanan (kalori) selama 8 jam, tetapi diperbolehkan minum air putih. Nilai normal kadar glukosa darah puasa adalah 126 mg/dL. Glukosa 2 jam setelah makan atau 2 jam pp (post pradial) adalah pemeriksaan glukosa yang dilakukan setelah 2 jam pembebasan glukosa yang setara dengan 75 gram glukosa. Pemeriksaan ini dapat digunakan untuk evaluasi insulin dalam tubuh. Nilai normal glukosa 2 jam pp adalah 140 mg/dL. Pemeriksaan untuk pemeriksaan post pradial dan puasa digunakan untuk melihat kerja insulin pada metabolisme glukosa untuk dibandingkan dengan satu sama lainnya. Metode yang digunakan adalah metode GOD-PAP. Metode ini digunakan karena sangat spesifik untuk pengukuran glukosa di dalam serum atau plasma melalui reaksi dengan glukosa oksidase, asam glukonat serta dibentuk hidrogen peroksida. Prinsip pemeriksaan pada metode ini adalah enzim glukosa oksidase mengkatalisis reaksi oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen peroksida. Hidrogen peroksida yang terbentuk bereaksi dengan fenol dan 4-amino phenazone dengan bantuan enzim peroksidase menghasilkan quinoneimine yang berwarna merah muda dan dapat diukur dengan fotometer pada panjang gelombang 546 nm. Intensitas warna yang terbentu setara dengan kadar glukosa darah yang terdapat dalam sampel.
Digunakannya
enzim
glukosa
oksidase
pada
reaksi
pertama menyebabkan sifat reaksi pertama spesifik untuk
glukosa. Tahapan awal penelitian ini adalah penyiapan alat dan bahan. Instrumen yang digunakan untuk percobaan ini adalah spektrofotometri UV-Vis, sedangkan bahan yang digunakan terdiri dari serum yang diambil dari darah responden dan reagen kit Glucose Oxidase 5 yang mengandung enzim GOD 20 KU/I, Peroksidase > 1,5 KU/I, Mutarotase 4,0 L/mL, 4-aminoantypirine 0,38 mmol/L, dan p-OH(C6H6)SO3 10 mmol/L. Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil darah responden melalui pembuluh darah vena, tepatnya pembuluh darah vena yang terdapat pada siku tangan. Darah yang diambil adalah sebanyak 3-5 mL, kemudian dipisahkan dengan serumnya dengan metode sentrifugasi. Plasma darah yang telah terpisah kemudian diambil, dipreparasi untuk kemudian ditambahkan reagen kit. Standar dan blanko juga disiapkan untuk perbandingan, standar terdiri dari larutan standar dan reagen, sedangkan blanko terdiri dari reagen saja. Larutan standar diperlukan untuk menghitung kadar gula darah dalam serum dengan membandingkan absorbansi larutan sampel dan larutan standar. Pembuatan larutan blanko adalah untuk kalibrasi atau sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Larutan blanko tidak mengandung analit yang akan dianalisis, hanya berisi
reagen
yang
digunakan
untuk
mengkalibrasi
spektrofotometri. Metode yang digunakan pada penelitian ini
adalah one point method dimana dilakukan perbandingan antara larutan standar dan larutan sampel. Sebelum melakukan pengukuran absorbansi serum sampel pada spektrofotometer, dilakukan pengukuran terlebih
dahulu untuk baku. Tujuan pengukuran baku ini untuk melihat apakah reagen yang dipakai murni atau tidak terkontaminasi oleh zat lain. Preparat sampel disiapkan secara kuantitatif dengan menggunakan mikropipet dengan volume yang telah ditentukan, yaitu : a. Blanko : 1 mL reagen b. Standar : 1 mL reagen + 10 L larutan standar c. Sampel atau uji : 1 mL reagen + 10 L larutan sampel Setelah larutan sampel, standar, dan blanko telah dibuat kemudian didiamkan dalam suhu 37oC selama 10 menit. Setelah didiamkan selam 20 menit, larutan uji, standar, dan blanko dimasukkan ke dalam spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 546 nm sehingga didapatkan data berupa absorbansi sampel.
Hal yang harus
diperhatikan adalah
bahwa
cara
memegang kuvet harus pada bagian kuvet yang buram karena
jika dipegang pada bagian yang bening dikhawatirkan akan mengganggu
absorbansi
disebabkan
adanya
protein
yang
mungkin tertinggal pada kuvet.
Spektrofotometer UV-Vis terletak pada daerah ultra violet dan sinar tampak dengan rentang panjang gelombang dari 380 nm sampai dengan 780 nm, atau 400 nm sampai dengan 800 nm. Konsentrasi suatu senyawa dapat diukur pada panjang gelombang maksimum yang ditentukan dan memberikan hasil absorbansi tertentu juga. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum 546 nm karena pada panjang gelombang ini, hasilnya akan terdeteksi, bahwa hasil yang terjadi adalah warna merah-violet. Tujuan penetapan panjang gelombang maksimum yaitu untuk mengetahui panjang gelombang yang merupakan serapan terbesar, yaitu pada saat senyawa berwarna yang terbentuk telah optimum, sehingga diperoleh kepekaan yang maksimum. Serapan dibaca pada panjang gelombang 500 nm sesuai dengan panjang gelombang reagen GOD-PAP. Parameter stabil yaitu jika pada waktu tertentu larutan menunjukkan serapan yang bernilai sama berturut-turut. GOD-PAP merupakan enzim yang
memerlukan waktu tertentu untuk bereaksi optimum, sehingga dibutuhkan waktu
inkubasi. Jika waktu inkubasi kurang dari waktu inkubasi optimum atau operating time-nya, maka enzim tidak akan bereaksi sempurna. Sedangkan apabila waktu inkubasi lebih dari waktu inkubasi optimum atau operating time, maka senyawa yang terbentuk akan terdegradasi.
