HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

Anggia--Ardian--Arinta--Artha--Astrid--Atisa Avrina--Bagus--Patimah
Pramudita--Puji--Aini--Rachmadhani--Rahmat--Rista--Sakinah
5/19/15

Bab I.
Latar Belakang
Tswett
1930

Izmailov&
Schreiber
1938

Martin&
Synge
1941

Kirland
et al.
1969

5/19/15

Rumusan masalah
1. Apa prinsip kerja HPLC?
2. Apa analisa dari HPLC?
3. Bagaimana mekanisme kerja HPLC?
4. Bagaimana interpretasi dari output data HPLC?

Tujuan
1. Mengetahui prinsip kerja dari HPLC.
2. Mengetahui analisa dari HPLC.
3. Mengetahui mekanisme kerja HPLC.
4. Mengetahui interpretasi dari output data HPLC.

5/19/15

5/19/15

Bab 2
Tinjauan pustaka
1. HPLC dan komponennya
HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan
farmasetik. Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah
fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat
injeksi), kolom, detektor, reservoir, drain, layar display, dan suatu
komputer atau integrator atau perekam.

Gambar Diagram Skematik Sistem HPLC

5/19/15

2. Jenis HPLC
Berdasarkan kepolaran fase diam dibanding fase gerak :
a) HPLC fase normal
b) HPLC fase terbalik
Berdasarkan pada mekanisme adsorpsi solut :
c) Kromatografi Adsorbsi
d) Kromatografi fase terikat
e) Kromatografi penukar ion
f) Kromatografi Pasangan Ion
g) Kromatografi Eksklusi Ukuran
h) Kromatografi Afinitas

5/19/15

3. Kelebihan dan kekurangan HPLC

Kelebihan :
a) HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.
b) HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi.
c) Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi.
d) Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
e) Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam
beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit
fase gerak yang dikonsumsi).
f) Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat
menurunkan biaya karyawan.
g) Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan :
h) Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
i) Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor

Bab 3
Aplikasi dari HPLC

5/19/15

5/19/15

5/19/15

Bab 4
A. Prinsip & Mekanisme kerja

HPLC merupakan teknik pemisahan dengan menggunakan fase gerak

cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju
detektor dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan kedalam aliran fase
gerak dengan cara penyuntikan. Pemisahan senyawa - senyawa dalam kolom
akan

keluar

atas

dasar

kepolaran

yang

berbeda,

sehingga

akan

mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam.

Senyawa- senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan
keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat
dengan fase diam akan keluar lebih lama.

Mekanisme
kerja HPLC

Skema Mekanisme Kerja HPLC

B. Analisis

5/19/15

1. Analisis secara Kualitatif

5/19/15

Setiap senyawa memiliki waktu retensi (tR) yang berbeda-beda, dipengaruhi

oleh :
a) Tekanan
b) Kondisi fase diam
c) Komposisi pelarut
d) Temperatur kolom

2. Analisis secara Kuantitaif

Pada analisis HPLC secara kuantitatif, ada beberapa hal yang harus
diperhatikan diantaranya :
a) Parameter percobaan antara sampel dan standar
b) Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang
sama
c) Penentuan kadar dilakukan berdasarkan korelasi dengan
menggunakan standar seri pada waktu retensi tertentu.
d) Berdasarkan area kromatogram
e) Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

5/19/15

C. Interpretasi output
Data (Output) yang diperoleh dari detektor berupa rangkaian
puncak - puncak, dimana masing- masing puncak mewakili satu
senyawa dalam campuran.

Area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah

puncak X. Ini mungkin disebabkan

karena Y lebih sedikit dari X,

tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang

gelombang lebih sedikit dibanding dengan X.

5/19/15

Kesimpulan
1. Prinsip

kerja

HPLC

yaitu

metode

pemisahan

dengan

menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom

menuju

detektor

dengan

bantuan

pompa

dimana

sampel

dimasukkan ke dalam aliran fase gerak, di dalam kolom terjadi

pemisahan senyawa dan akan keluar atas dasar kepolaran yang
berbeda.
2. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan
waktu retensi antara sampel yang diidentifikasi dengan waktu
retensi

dari

dapatkan

larutan
dengan

kromatogram

akan

standar.

Analisis

melihat

kromatogram

terdapat

secara
di

kuantitatif
mana

puncak-puncak

di

pada
yang

menginterpretasikan banyaknya komponen dari senyawa yang

dianalisis sehingga dilakukan pencocokan spectrum 3D dari sinyal
kromatogram.

5/19/15

3. Mekanisme kerja dari HPLC yaitu eluen yang ditampung dalam

reservoir akan masuk ke dalam degasser dan diteruskan ke dalam
drain sehingga beberapa eluen yang digunakan akan bercampur.
Sampel diinjeksikan dengan syringe melalui injection port
sehingga eluen dan sampel dapat tercampur dan masuk ke dalam
guard column (kolom penjaga) dan diteruskan ke dalam kolom
utama untuk proses pemisahan. Hasil yang diperoleh akan
dideteksi oleh detektor yang ditampilkan pada display dalam
bentuk kromatogram.
4. Data (Output) yang diperoleh dari detektor berupa rangkaian
puncak- puncak dimana masing- masing puncak mewakili satu
senyawa dalam campuran. Waktu retensi (tR) dapat digunakan
untuk identifikasi zat apabila analisis sampel dan standar
dilakukan pada kondisi yang sama.

Saran

5/19/15

5/19/15

SEKIAN