Sekuen DNA membawa informasi

DNA

Transcription

mRNA

Translation

Protein

2-deoxyribose (sugar)

Ujung 5
C

Ujung 3
G

Bases

A (adenine) komplementer dengan T (thymine)

C (cytosine) komplementer dengan G (guanine)

DNA utas ganda

 Sequencing merupakan metode menentukan urutan

basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada

sepotong DNA.

Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang

akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.

Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan

perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya

protein non fungsional
Akibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada
organisme

Terdapat dua teknik sequencing:

Maxam & Gilbert, menggunakan chemical sequencing
Sanger, menggunakan dideoxynucleotides.
Sequencing yang modern menggunakan prinsip teknik Sanger.
Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide
triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada
karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada
deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam
reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan
bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti karena
3OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida
berikutnya tidak ada.

DNA Sequencing

A lot of modern DNA

sequencing is based
upon the following
modified nucleotides.
Metode Sanger dideoxy ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel
1980

Karena tidak ada

OH, replikasi berhenti

 DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai

template DNA
Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang
berpasangan dengan template DNA dan berfungsi
sebagai starting point untuk replikasi
DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA,
menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari
template
Sejumlah nukeotida normal
Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel
(radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)

Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida

normal tetapi secara random dideoxy (DD)

nukleotida diambil (dipasangkan).
Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan
reaksi berhenti
Hasilnya DNA dengan panjang yang
bervariasi , masing-masing berhenti pada
DDnukleotida tertentu yang dilabel.
Karena tiap panjang yang berbeda bergerak
dengan kecepatan yang berbeda selama
elektroforesis, maka urutannya dapat
ditentukan.

DNA Sequencing
Metode original
dengan
menggunakan
radiolabeled DNA.
Sejumlah kecil
dideoxy
nucleotides
ditambahkan ke
reaksi polymerase
DNA.

DNA Sequencing
1.Terdapat lebih dari
satu utas DNA dalam
reaksi.
2. Tidak semua
nukeotida adalah
dideoxy.

DNA Sequencing
1.Terdapat lebih dari
satu utas DNA dalam
reaksi.
2. Tidak semua
nukeotida adalah
dideoxy.
Sehingga multiple
terminated products
dihasilkan (tanda panah
merah)

DNA Sequencing
Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang
dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan
dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser
saat DNAs melewati jendela detektor.
Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang
terlihat dibawah ini.

Automated DNA sequencing pada automated DNA

sequencing, deoxynucleotide radioaktif tidak
digunakan dan ke-4 reaksi dideoxy dikerjakan dalam
satu tabung tunggal.
Ini karena tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna
flourescent yang berbeda.
Sehingga warna yang ada pada tiap fragmen yang
disintesa korespon dengan warna yang berikatan pada
dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk
menghentikan sintesis fragmen.
Isi dari satu tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur pada
gel dan dielektroforesis.

Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke gel

dan mendeteksi dan mencatat warna yang berikatan
dengan fragmen saat mereka melewati gel.
Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan warna
yang keluar dari gel.

Capillary tubes
Reagents

Sample tray
goes here

DNA sequence alignment memasangkan dua DNA

sequences untuk memaksimalkan kesamaannya
1. AACG dan AACG

AACG
| | | |

AACG
AAGG
| |

2. AAGG dan AACG

AACG
1 mismatch

3. AACGGTATGC dan ATCGGGTTGC

AACG - GT ATGC
ATCG G GT -TGC

2 gaps

Best alignment memasangkan dua sekuens dengan

sesedikit mungkin jumlah mismatches dan gaps
Score: tiap pasangan yang sama posisinya: +2;
tiap mismatch/ gap: -1
AACG
| | | |

AACG
score = 8

AAGG
| |

AACG

score = 5

AACG - GT A TGC
ATCG G GT - TGC
score = 16

 BLAST: http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/