Anda di halaman 1dari 9

TUGAS TERSTRUKTUR

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Agrobacterium tumefaciens, Gen Penanda (antibiotic resistance)


Gen Pelapor (GUS)

Oleh:
Nama

: Firmansyah Capasaputra

NIM

: A1L112011

Prodi

: Agroteknologi Paralel

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS PERTANIAN
PURWOKERTO
2014

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang


banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk
menghasilkan suatu tanaman transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat
menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga
menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor).
Bakteri yamg tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah
plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi
penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Bakteri ini menyerang tanaman
dikotiledon serta tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebu telah
digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium
berbentuk batang, berukuran 0,6 1,0 m sampai 1,5 3,0 m, dalam bentuk
tunggal atau berpasangan.
Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak (motile) dan
memiliki 1-6 flagela peritrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu
optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28C. Kumpulan bakteri ini biasanya
berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen. Agrobacterium diisolasi
dari tanaman yang terinfeksi Crown Gall. Tumor Crown Gall adalah jaringan
tanaman yang pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara
tanaman-tanaman yang rentan dengan strain virulen Agrobacterium tumefaciens.
Secara singkat mekanisme infeksi A. tumefaciens dimulai dengan tanaman
luka dan bakteri A. tumefaciens menginfeksi. Sel A. tumefaciens menempel pada
sel tanaman. Selanjutnya T-DNA ditransfer dari Ti-plasmid, masuk ke sel tanaman
dan terintegrasi pada kromosom tanaman. T-DNA yang disisipkan mengandung
gen-gen yang menyandikan senyawa opine, yaitu senyawa yang merupakan
sumber karbon dan nitrogen bakteri tersebut, dan gen gen yang menyandikan
enzim untuk menyintesis auksin dan sitokinin untuk mendorong pembelahan sel
inang yang menyebabkan tumbuh tumor sehingga tanaman terkena crown gall.

Kemampuan bakteri Agrobacterium untuk mentransfer T-DNA ke dalam


sel tanaman dan T-DNA tersebut terintegrasi pada kromosom tanaman, digunakan
sebagai alat untuk memasukkan dan mengintegrasikan gen yang diinginkan
manusia untuk terekspresi di tanaman. Hal ini dimungkinkan dengan
memodifikasi T-DNA Agrobacterium sehingga sel tanaman yang terinfeksi tidak
menjadi sel tumor yaitu dengan menghilangkan oncogenes dan menambahkan gen
yang dikehendaki pada T-DNA, atau menambahkan plasmid yang mengandung
gen yang dikehendaki ke dalam sel Agrobacterium yang telah dimodifikasi Tiplasmidnya.
A. tumafaciens mengandung sebuah Ti-plasmid dan kromosom. Sebuah Tiplasmid bertanggung jawab pada proses onkogenesitas A. tumefaciens. Namun,
Ti-plasmid sendiri tidak mampu menyebabkan terjadinya transformasi pada
tanaman. Gen-gen pada kromosom dari A. tumifaciens juga menyumbangkan
fungsi lain yang berguna untuk onkogenesitas in planta. Ti-Plasmid A.
tumefaciens merupakan plasmid yang berukuran besar 200-250 kb dengan berat
molekul 1,2 x108 dan bereplikasi di dalam sel secara mandiri. Bagian-bagian Ti
Plasmid adalah T-DNA yang mengandung Left border, Gen auksin synthase, Gen
sitokinin synthase, Gen opine synthase, dan Righ border, Gen virulensi yang
berfungsi untuk mentransfer T-DNA ke genom inang, Gen replikasi, Gen
konyugasi transfer, Gen opine katabolisme.

Sebuah wilayah T-DNA (DNA yang ditransfer) diduplikasi dan ditransfer


ke sel tanaman. Walaupun T-DNA merupakan elemen yang mudah berpindah, TDNA bukanlah elemen yang dapat diubah urutannya, karena T-DNA sendiri tidak
mengkode produk yang memediasi perpindahannya. Sebagai gantinya, sebuah
komponen kedua, yaitu wilayah virulen (vir) pada Ti-plasmid, menyediakan
sebagian besar produk trans-acting untuk transit T-DNA. Daerah virulen (vir)
berukuran 35 kb, yang terdiri dari tujuh lokus utama (virA,virB,virC, virD, virE,
virF, virG). Protein produk dari gen ini, disebut protein virulen (Vir), yang respon
terhadap senyawa fenolik yang dikeluarkan oleh tanaman berkayu untuk
menghasilkan copy T-DNA dan sebagai mediasi T-DNA ke dalam sel inang.
Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada sel
tanaman. Kejadian awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada
kromosom bakteri (gen chvA, chvB dan att). Langkah berikutnya adalah
terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal yang spesifik didalam sel
bakteri sehingga dihasilkan produk dari expresi gen-gen virulen untuk memproses
T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel bakteri. Prosesing dan transfer T-DNA
dimediasi oleh berbagai protein yang dikode pembentukannya oleh gen-gen
virulen. Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai
tunggal yang disebut T-strand yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Kejadian ini
dimediasi oleh produk dari gen virD1 dan virD2 yang berfungsi memotong TDNA di bagian left border dan right border. Salah satu produk yaitu molekul

VirD2 tetap melekat secara kovalen pada 5 end dari T-strand dan membentuk apa
yang disebut T-complex yang masih setengah jadi. Pembentukan T-complex ini
dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju inti sel
tanaman inang. Tahap akhir dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah
integrasi T-DNA ke dalam genom sel tanaman inang.

Gambar. Ilustrasi transfer T-DNA oleh A. Tumefaciens kedalam sel tanaman

Penanda Genetik

Penanda genetik disebut juga dengan penanda, marker, marka, atau


markah. Penanda genetik merupakan ekspresi pada individu yang terlihat oleh
mata atau terdeteksi dengan alat tertentu, yang menunjukkan dengan pasti
genotipe suatu individu. Penanda genetik dapat diketahui lokasinya pada
kromosom. Penanda yang lokasinya dapat diketahui pada kromosom memberikan
informasi bagi sekuensing dan perbandingan antar genotipe, meskipun seringkali
tidak praktis dalam aplikasinya. Penanda genetik yang sering digunakan Penanda
selektif (selectable marker) dan Penanda analitik (analytical marker).
Penanda selektif adalah penanda genetik yang dapat membedakan antara
sel/jaringan yang mengalami transformasi atau tidak. Cara membedakan antara sel
yang tertransformasi sesuai dengan keinginan kita (cell of interest) adalah dengan
menumbuhkannya dalam media atau kondisi selektif yang tidak memungkinkan
sel yang tidak mengalami transformasi untuk tumbuh. Macam Penanda Selektif
adalah:
Penanda selektif yang dapat divisualisasi :
a) Penanda Histologis
Dapat menghasilkan penampakan yang dapat dilihat secara visual pada
sel/jaringan tertentu. Macam penanda hitologis adalah Gen GUS, Gen
lacZ yang berasal dari Escherichia coli, Luciferase, dan GFP (Green
Fluorescent Protein).
b) Penanda Morfologis
Penanda morfologis adalah penanda genetik yang jika diekspresikan
dapat menyebabkan perubahan morfologis pada jaringan tanaman yang
ditransformasi.
c) Penanda Pigmentasi
Penanda pigmentasi adalah penanda genetik yang dapat menyebabkan
terjadinya perubahan warna pada tanaman yang ditransformasi.
Penanda yang dapat menyebabkan kematian
a) Penanda resistensi terhadap antibiotik atau herbisida
Resistensi tersebut dapat dilakukan dengan salah satu mekanisme berikut:
1. Detoksifikasi dengan menggunakan modifikasi enzimatis
2. Pengurangan afinitas suatu target terhadap agensia selektif
3. Ekspresi berlebih suatu target tipe alami
b) Penanda Auksotrofik (PA)

PA adalah penanda berupa mutasi pada salah satu atau beberapa gen
yang terlibat dalam jalur sintesis metabolit tertentu, misalnya sintesis asam
amino dan sintesis nukleotida. Dalam hal ini, tanaman yang akan
ditransformasi berupa mutan tanaman pada salah satu atau beberapa gen
sintesis metabolit tersebut.
Penanda analitik, adalah penanda yang didasarkan pada pengujian atau
analisis terhadap ekspresi gen yang dapat dikuantitasi. Penanda analitik dapat
dilakukan in vitro dengan cara:
a. Uji enzimatik, dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri,
fluorometri atau luminometri.
b. Uji aktivitas protein pada gel, adalah metode analisis suatu enzim dengan
mengukur aktivitas pita protein enzim yang muncul pada suatu gel native
(tidak mengalami perlakuan denaturasi).
c. Uji imunokimia, uji ini untuk menganalisa protein yang tidak dapat
diekspresikan pada tanaman transgenik dengan menggunakan antibodi
terhadap protein tersebut, misalnya dengan teknik ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) yang dimana protein-protein yang disintesis pada suatu
jaringan tanaman diekstraksi kemudian direaksikan dengan antibodi terhadap
protein asing (antigen) yang menjadi target analisis, atau dengan teknik
immunoblotting.

Gen GUS

Gen GUS merupakan gen penanda yang mengkode sintesis enzim Glucoronidase. Gen GUS banyak digunakan sebagai reporter gene (gen penanda)
dalam transformasi pada tanaman. Salah satu sifat gen reporter yang dikehendaki
oleh para peneliti adalah ekspresinya cepat dan mudah dideteksi. Ekspresi gen

Gus dapat dideteksi dengan substrat fluorogenic dan chromogenic. X-gluc (5bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-glucoronidase) adalah substrat chromogenic yang
sangat efisien untuk lokalisasi histokimia aktivitas -glucoronidase dalam jaringan
dan sel, memberikan presipitat biru (spot biru) pada tempat terdapatnya aktivitas
enzima tersebut.
Konstruksi gen GUS mengadung sekuen gen nptII yang menyandi
terbentuknya enzim neomicyne phosphotransferase, sehingga selain sebagai gen
penanda, konstruksi gen GUS juga berfungsi sebagai penyeleksi. Aktifitas nptII
akan menyebabkan eksplan tebu tahan terhadap antibiotik yang tergolong
aminoglikosida seperti genecin dan kanamisin yang terdapat di dalam media
seleksi. Eksplan yang berhasil ditransformasi konstruksi gen GUS ini akan
menunjukkan ketahanan terhadap antibiotik tersebut ketika ditanam di dalam
media seleksi.

Gambar. GUS assay pada T-DNA tagging: a. biji; b. daun; c. bagian organ bunga

DAFTAR PUSTAKA

Ananda, Rr. W. U. 2004. Studi Transformasi pada Tebu dengan Perantara


Agrobacterium Tumafaciens GV2260 (Pma) serta Regenerasi Kalus
Transgenik. (Tesis). Sekolah Pascasarjana. IPB.

Anonymousa. 2012. Transformasi gen oleh bacteri agrobacterium tumefaciens.


http:// anggunhannes. blogspot.com

/2011/ 05/ transformasi-gen-oleh-

bakteri.html. Diakses pada tanggal 13 Oktober 2014

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang.

Ogras T.T., and Gozukirmizi N. 1999. Expression And Inheritance of GUS Gene
in Transgenic Tobacco Plants. Tr. J. of Botany. 23: 297-302.

Zulfahmi. 2013. Penanda Dna Untuk Analisis Genetik Tanaman (DNA Markers
for Plants Genetic Analysis). Jurnal Agroteknologi. Vol. 3, No. 2: 41-52.