Uji BSLT

Yunietha Lakhiafa
Toksisitas Akut Dengan BSLT ( Brine Shrimp Letality Test )

I.

II.

Tujuan

Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan menggunakan metode BSLT

Mengetahui cara perhitungan LD50 dengan metode BSLT

Mampu melaksanakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan menggunakan

metode BSLT

Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksisan akut berdasarkan analisa

probit.

Landasan Teori
Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi dari
suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut
mengenai atau masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat
racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu
yang singkat, dan bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun
dalam jangka waktu yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam
jumlah yang sedikit).
Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan
mempelajari efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan,
pemaparan bahan kimia terhadap organism tingkat rendah seperti bakteri dan kultur selsel dari mamalia di laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap manusia.
Untuk skrining dan fraksionasi fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat di
lakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek). Suatu metode yang digunakan
secara luas dalam penelitian bahan alam untuk maksud tersebut adalah adalah Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu cara yang cepat dan murah
untuk uji aktifitas farmakologi dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut
yaitu larva udang Artemia salina Leach. Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di
sebabkan oleh senyawa uji. Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang
tinggi.
Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spectrum aktifitas farmakologi
yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar,
serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini sering dikaitkan dengan
metode penapiasan senyawa antikanker. Dengan alas an-alasan tersebut, maka uji ini
sangat tepat digunakan dalam penelitian bahan alam.
Peranan antioksidan sangat penting dalam meredam efek radikal bebas yang
berkaitan erat dengan terjadinya penyakit degeneratif seperti tekanan darah tinggi,
jantung koroner, diabetes dan kanker yang didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh.
Radikal bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses metabolisme normal,
dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh yang akhirnya
menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif. Reaksi radikal bebas secara umum
dapat dihambat oleh antioksidan tertentu baik alami maupun sintetis. Sebahagian besar
antioksidan alami berasal dari tanaman, antara lain berupa senyawaan tokoferol,
karatenoid, asam askorbat, fenol, dan flavonoid.

Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi, oleh karena itu daya
bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis
ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga memonitor fraksi bioaktif
selama fraksinasi dan pemurnian. Salah satu organisme yang sesuai untuk hewan uji
adalah brine shrimp (udang laut).
Untuk
mengetahui
toksisitas
ekstrak
daun dalam
penelitian
ini
digunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) dan untuk mengetahui aktivitas
ekstrak daun sebagai antioksidan digunakan metode DPPH (-1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).
Pengukuran antioksidan secara Efek peredaman radikal bebas DPPH merupakan metode
pengukuran antioksidan yang sederhana, cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen
seperti halnya uji lain (xantin-xantin oksidase, metode Tiosianat, antioksidan total). Hasil
pengukuran menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum tidak berdasar
jenis radikal yang dihambat. Pada metode ini, DPPH berperan sebagai radikal bebas yang
diredam oleh antioksidan dari bahan uji, dimana DPPH akan bereaksi dengan antioksidan
tersebut membentuk 1,1,-difenil-2- pikril hidrazin. Reaksi ini menyebabkan terjadinya
perubahan warna yang dapat diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada 515
nm, sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan.
Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. Metode Meyer et al. digunakan untuk
mempelajari toksisitas sampel secara umum dengan menggunakan telur udang (Artemia
salina Leach). Penetasan Larva Udang,disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di
satu ruang dalam bejana tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam
penetasan, sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan
+ 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan aluminium
foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Diambil larva udang
yang akan diuji dengan pipet.
Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. Sebanyak 100 L air laut yang
mengandung larva udang sebanyak 10-12 ekor dipipet, kemudiandimasukkan ke dalam
wadah uji. Di tambahkan larutan sampel yang akan diuji masing-masing sebanyak 100
L, dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500dan 1000 ppm. Untuk setiap konsentrasi
dilakukan 3 kali pengulangan (triplikat). Larutan diaduk sampai homogen. Untuk kontrol
dilakukan
tanpa
penambahan sampel.
Larutan
dibiarkan
selama
24
jam,
kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup dari tiap lubang. Angka mati
dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi (3
lubang).Angka hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup dalam setiap
konsentrasi (3 lubang).Perhitungan akumulasi mati tiap konsentrasi dilakukan dengan
cara berikut: akumulasi mati untuk konsentrasi 10 ppm = angka mati pada konsentrasi
tersebut, akumulasi mati untuk konsentrasi 100 ppm = angka mati pada konsentrasi 10
ppm + angka mati pada konsentrasi 100nppm, akumulasi mati untuk konsentrasi 200
ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm +
angka
mati
pada
konsentrasi
200 ppm.
Akumulasi
angka
mati
dihitung
sampai konsentrasi 1000 ppm. Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan
dengan cara berikut: akumulasi hidup untuk konsentrasi 1000 ppm = angka hidup pada
konsentrasi 1000 ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 500 ppm = angka hidup
pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm, akumulasi hidup
untuk konsentrasi 200 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup
pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada konsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka
hidup dihitung sampai konsentrasi 10 ppm.
Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah
akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan log
konsentrasi sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50
merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan kematian 50% yang diperoleh

dengan memakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zatdikatakan aktif atau
toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa.
III.

IV.

Alat dan Bahan

Kotak penetasan larva

Mikro pipet 2-20 L

Mikro pipet 20-200 L

Wellplate

Kaca pembesar

Tabung reaksi

Labu ukur

kotak

steroform

Prosedur kerja
a.Penetasan larva

b.Orientasi konsentrasi

V.

HASIL PENGAMATAN
Analisis data BSCT dengan analisis Probit
Kelas
Konsentrasi
Log C
Hidup
ppm
(y)

mati

%
kematian

Probit

Lc 50

A
Ekstrak
BINTARO

B
Ekstrak
Alpukat

10000
1000
100
10
1
0,1
10000
1000
100
10
1
0,1

4
3
2
1
0
-1
4
3
2
1
0
-1

1
4
5
2
3

10
10
10
10
10
10
10
9
6
5
8
7

100
100
100
100
100
100
100
90
60
50
80
70

8,7190
8,7190
8,7190
8,7190
8,7190
8,7190
8,7190
6,2816
5,2533
5,000
5,8416
5,5244

26,4338
ppm

Ket :
Digunakan regresi linier
Y = a + bx
Probit = a + b (log C)
a = 3,26715
b = 1,21853
r = 0,9271
di hitung LC 50 ?
LC 50 = (5-a)/b
LC 50 = (5-3,26715)/1,21853
LC 50 = 1,42216
Antilog LC 50 = 26,4338 ppm

Analisis data BSCT dengan analisis Reed-Munch

kelas

Konsentrasi ppm

hidup

mati

mati

B
Ekstrak
Alpukat

0,1
1
10
100
1000
10000

11
7
13
13
1
0

19
23
17
17
29
30

19
42
59
76
105
135

hidup
45
34
27
14
1
0

Di hitung :
h= 50%-a/(b-a)
h : ukuran jarak
a : % yang menyebabkan kematian lebih kecil dari 50 %
b : % yang menyebabkan kematian lebih besar dari 50 %
h = (50%-29,68%)/(55,26%-29,68%)
Di hitung :
i = log kematian diatas 50% / kematian dibawah 50%

total

ratio

64
76
86
90
106
135

19/64
42/76
52/79
76/90
105/106
135/135

%
kematian
29,68
55,26
68,6
84,4
99,0
100

LC

0,62
pp

i
i
i
i

: log kenaikan dosis

= log 1/0,1
= log 10
=1

Di hitung :
g=hXi
g : hasil kali dari ukuran jarak dan log kenaikan dosis
g = 0,749 X 1
g = 0,749
DI hitung :
y = g + log kematian lebih kecil dari 50 %
y : hasil penjumlahan g dan log kematian kecil dari 50 %
y = 0,749 + log 0,1
y = 0,749 1
y = - 0,206
LC 50 = anti log y
LC 50 = anti log 0,206
LC 50 = 0,6223 ppm
Analisis data BSCT dengan analisis Farmakope
kelas
Konsentrasi
Log
Hidup Mati
ppm
dosis
0,1
-1
11
19
1
0
7
23
B
10
1
13
17
Ekstrak
100
2
13
17
Alpukat
1000
3
1
29
10000
4
0
30

mati

Pi

Pi

LC 50

63
76
56
56
96
100

0,63
0,76
0,56
0,56
0,96
100

4,47

1,071 ppm

Di hitung :
m = a b ( Pi 0,5)
Pi : % kematian terhadap % seluruh hewan yang dicobakan.
m = 4 1 (4,47 0,5)
m = 4 1 (3,97)
m = 4 3,97
m = 0,03
LC 50 = anti log m
LC 50 = anti log 0,03
LC 50 = 1,071 ppm
VI.

Pembahasan
Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) merupakan uji toksisitas yang digunakan
sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatu zat atau senyawa yang
terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni.
Pada praktikum kali ini larva udang yang digunakan adalah jenisArtemia
salina yang telah berumur 48 jam dan proses pembenihan telur udang yang digunakan
adalah sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan dalam air garam dengan kadar 38% (38

gram dalam 1liter air) hal ini dilakukan sebagai simulasi dari habitat asli udang yaitu air
laut.
Adapun ekstrak yang digunakan adalah ekstrak buah alpukat dan bintaro yang
dibuat larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu mulai dari 10000, 1000,
100, 10, 1 dan 0,1 ppm. Hal ini bertujuan untuk mengetahui LC50 dari masing - masing
ekstrak tersebut dengan berbagai konsentrasi.
Pada prakteknya dengan perlakuan yang sama yaitu larutan ekstrak yang
dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 10 buah larva dengan 10 ml larutan (9 ml
air garam dan ekstrak sebanyak 1 ml). Ekstrak bintaro menunjukkan hasil data yang
error, hal ini ditunjukkan dengan adanya kematian pada semua larva udang di berbagai
konsentrasi. Adapun untuk ekstrak alpukat menunjukkan hasil bahwa dengan naiknya
konsentrasi maka larva udang yang mati semakin banyak, tetapi pada konsentrasi 1 dan
0,1 ppm tidak menunjukkan hal denmikian, sehingga data yang dipakai adalah pada
konsentrasi 10000 sampai 100 ppm. Selain itu percobaan dilakukan triplo agar didapat
data statistik yang baik sehingga, dapat dihitung secara statistik dari data tersebut.
Dalam penentuan nilai LC50 ini dapat dilakukan dengan 3 cara/metode, yaitu :
1.
Perhitungan probit
2.
analisis Reed-Munch
3.
analisis Farmakope
Dalam perhitungan dengan metode analisis probit, diperlukan tabel probit dan
rumus regresi liniear untuk menentukan nilai a, b dan r. Kemudian dimasukkan dalam
rumus X50 = (b-a)/b dan kemudian dapat ditentukan nilai LC50. Adapun hasil perhitungan
dengan menggunakan metode ini menunjukkan hasil bahwa LC50 adalah 26,438 ppm.
Sedangkan dalam perhitungan dengan metode analisis Reed-Munch sebelumnya
harus diketahui jumlah larva yang mati dan hidup. Yang kemudian dihitung ukuran jarak
(h) = (50%-a)/(b-a) , kenaikan dosis (i) = log kematian diatas 50 %/kematian
dibawah 50% , nilai (g) = h X I , nilai (y) = g + log kematian lebih kecil dari 50 %,
kemudian dapat ditentukan bahwa:
nilai LC 50 = anti log y
Dengan menggunakan metode analisis Reed-Munch didapatkan hasil LC50 sebesar
22,54 ppm.
Perhitungan data BSLT dengan metode yang ketiga yaitu dengan analisis
Farmakope. Terlebih dahulu dicari nilai Pi dan sigma Pi untuk selanjutnya dimasukkan
dalam rumus :
m = a b ( Pi 0,5) Pi = % kematian terhadap % seluruh hewan yang
dicobakan
a = dosis terendah yang dapat menyebabkan kematian 100%
b = beda log dosis yang berurutan
selanjutnya dapat ditentukan nilai LC 50 = anti log m. Dari hasil perhitungan
didapatkan nilai LC50 sebesar 26,3 ppm.
Dari ketiga metode tersebut dapat diketahui bahwa didapatkan LC 50dengan
perbedaan yang tak terlalu jauh yaitu 26,438 ppm, 22,54 ppm, dan 22,54 ppm sehingga
hal ini menunjukkan bahwa ekstrak biji alpukat bersifat toksik terhadap larva udang
karena LC 50 1000 g/mL, sedangkan suatu ekstrak dikatakan aktif apabila mempunyai
LC 50 1000 g/mL.

VII.

1.
2.

Kesimpulan

Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan :

Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin banyak larva udang yang mati.
Nilai LC50 pada metode perhitungan analisis probit adalah 26,438 ppm,
pada analisis Reed-Munch nilai LC50 adalah 26,438 ppm,

3.

dan pada analisis farmakope nilai LC50 adalah 26,3 ppm.

Ekstrak biji bintaro tidak dapat dihitung LC50 nya karena pada berbagai konsentrasi larva
udang mati semua.

VIII.

Daftar Pustaka
Anonim. 2000. Informatorium Obat Nasional Indonesia. Depkes RI : Jakarta
Anief, Moh. 2000. Ilmu Meracik Obat. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta
Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI : Jakarta
Ansel, Howard.C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Universitas Indonesia
Press : Jakarta
Ernst Mutschler, 1986, Dinamika Obat ; Farmakologi dan Toksikologi(terjemahan), ITB,
Bandung