PERAN PLASMID dalam

REKAYASA GENETIKA
* Sebelum membicarakan peran plasmid,
kita bicarakan mengenai rekayasa genetika
lebih dahulu. Rekayasa genetika ini
merupakan bagian dari bioteknologi.
* Apakah bioteknologi itu?

BIOTEKNOLOGI
Bioteknologi: gabungan teknologi modern dan biologi
terapan yang bertujuan untuk meningkatkan mutu
kebutuhan hidup manusia.
Definisi Bioteknologi:
1. Kegiatan pemanfaatan prinsip ilmiah dalam rekayasa
2. Kegiatan pemanfaatan aktifitas biologi dalam lingkup
teknologi proses dan teknologi produksi dalam industri
3. Bioteknologi meliputi: B. Kedokteran, B. Farmasi, B.
Pertanian, B. Peternakan Dll.
Kita bicarakan mengenai Bioteknologi Kedokteran

BIOTEKNOLOGI
Bioteknologi kedokteran: upaya diagnosis, pengobatan,
dan penyembuhan penyakit pada penderita.
Rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan
merupakan primadona dalam bioteknologi.
Rekayasa genetika/teknik DNA rekombinan:
pembentukan rekombinan material genetik baru, yang
selanjutnya dapat diturunkan ke generasi berikutnya.
Dengan diketemukannya enzim restriksi, hal ini
memungkinkan dilakukannya pemutusan fragmen DNA
spesifik. Untuk menggandakan fragmen tersebut dalam
jumlah besar, maka fragmen perlu disisipkan ke dalam
suatu vektor (kendaraan yang berupa segmen DNA,
yang mampu bereplikasi secara autonom).

REKAYASA GENETIKA
Cara: Dengan menyisipkan suatu gen atau fragmen DNA
(yang dihasilkan sel lain) ke dalam suatu vektor,
terbentuklah rekombinan DNA. Rekombinan tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam host/sel inang, sehingga
memungkinkan terjadinya penggandaan gen di dalam host.
Proses tersebut juga dikenal dengan sebutan gene cloning,
karena organisme yang secara genetik terbentuk adalah
identik, dan membawa seluruh gen atau fragmen DNA yang
disisipkan, dan juga memperbanyak gen sisipan tersebut.
Aspek penting dari proses ini: kemampuan menerobos
barier alamiah suatu spesies dan kemungkinan dapat
memperoleh dan memanipulasi gen, yang selanjutnya gen
tersebut dapat menyandi suatu fungsi spesifik.

GENE CLONING
Cloning: menginsersikan dan mempertahankan suatu
segmen DNA ke dalam cloning vector
Dua dasar penerapan gene cloning:
1. Dapat melakukan isolasi dan mempelajari gen tertentu,
sehingga dapat diperoleh pengertian mendalam tentang
struktur, fungsi dan regulasi gen.
2. Diperoleh peningkatan produksi gen spesifik.
CLONE:1. Suatu populasi sel atau organisme identik secara
genetik, sebagai hasil dari reproduksi aseksual, dan
membentuk organisme identik secara genetik oleh
adanya transplantasi nukleus. 2. Suatu populasi sel host
dengan susunan DNA yang sama. 3. Menginsersikan
suatu segmen DNA (gen) ke dalam suatu vektor atau
kromosom host.

VEKTOR, ENZIM RESTRIKSI, &

ENZIM LIGASE
Teknik DNA rekombinan berkaitan erat dengan
penemuan berbagai vektor, enzim restriksi, dan
enzim ligase.
Vektor: kendaraan yang dapat dititipi/disisipi
gen/fragmen DNA. Vektor yang paling umum
digunakan adalah plasmid bakteri (molekul DNA
sirkular yang mengandung gen resisten
antibiotik) dan bakteriofag (virus bakteri).
Enzim restriksi: enzim yang dapat digunakan
untuk memotong nukleotida pada situs tertentu
Enzim ligase: enzim yang dapat menyambung
potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA

TAHAP-TAHAP TEKNIK DNA

REKOMBINAN
1. Isolasi DNA atau RNA
2. Pemotongan DNA menjadi gen tunggal
atau menjadi kelompokan gen
3. Isolasi vektor DNA
4. Penyisipan dan penyambungan gen pada
vektor
5. Analisis pemotongan & penyambungan
gen pada vektor
6. Transformasi pada host & uji transformasi

ISOLASI DNA

1. Penghancuran dinding sel:

a. Secara mekanik
b. Secara enzimatik
2. Lisis sel: disuspensikan di dalam bufer atau
dalam detergen SDS, atau triton X-100
3. Membersihkan debris: dengan sentrifugasi,
untuk memisahkan protein dari lisat
4. Presipitasi DNA dengan alkohol

PEMOTONGAN DNA
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi
Sifat enzim restriksi:
1. Mengenal secara spesifik 4-8 pasang urutan nukleotida
DNA/palindrom (dibaca dari kiri/kanan, bunyinya sama)
2. Memotong DNA pada kedua untai pada tempat spesifik
(recoqnition site). Contoh E. restriksi: EcoR1, memotong
GAATTC, dan menghasilkan fragmen dengan ujung
menggantung (sticky end) yang berguna untuk
meningkatkan perlekatan sambungan antara 2 fragmen
DNA (Gambar). Tidak semua enzim restriksi
menghasilkan sticky end, mis.AluI menghasilkan blunt
end.

Plasmid pUC19

Plasmid pUC19
Plasmid pUC19 yang dipelihara dalam Escherichia coli (
E. coli), adalah vektor umum yang sering digunakan untuk cloning fragmen DNA yang panjangnya sampai 8 kb.
Plasmid pUC19 adalah molekul DNA double stranded,
sirkuler, letak di luar kromosom bakteri (extrachromosomal), panjang 2686 bp, mengandung: suatu origin of
replication; gen -galactosidase (lacZ); gen resistensi
terhadap ampicillin Amp1; gen lacI yang menyandi
protein represor dan meregulasi ekspresi gen lacZ; dan
multiple cloning sequence yang mengandung 14 situs
cloning yang unik yaitu EcoRI, SacI, KpnI, XmaI, SmaI,
BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SpbI, dan
HindIII.

PENYISIPAN & PENYAMBUNGAN

GEN PADA VEKTOR
Isolasi vektor.
Vektor yang sudah diisolasi kemudian
dipotong dengan E. restriksi, mis. EcoRI.
Gen disisipkan di antara tempat
pemotongan vektor.
Penyambungan gen yang disisipkan pada
vektor dengan menggunakan enzim
ligase, pada suhu 4-15 0C, selama 1
malam (Gambar).

ANALISIS PEMOTONGAN &

PENYAMBUNGAN GEN PADA VEKTOR
Analisis pemotongan & penyambungan gen pada vektor
dengan elektroforesis gel agarosa atau poliakrilamid.
Gel agarosa secara umum digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan variasi panjang dari ratusan
hingga 20.000 pasang nukleotida, Sedang poliakrilamid
untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih kecil.
Molekul DNA bermuatan - maka dalam medan listrik
akan bergerak ke elektroda +.
Bila molekul DNA dengan berbagai ukuran dimasukkan
ke dalam sumur-sumur gel agarosa dan aliran listrik
dijalankan, maka mol. DNA bergerak melalui matriks gel
ke arah +. Kecepatan bergerak tergantung ukuran mol.
DNA, yang lebih kecil bergerak lebih cepat & lebih jauh.

ANALISIS PEMOTONGAN &

PENYAMBUNGAN GEN PADA VEKTOR
Gel yang berisi DNA yang sudah dielektroforesis
dalam waktu tertentu segera diangkat dari
medan listrik, kemudian diwarnai dengan etidium
bromida.
Gel-DNA kemudian diamati dengan sinar UV,
maka pita DNA akan berfluoresensi.
Ukuran potongan DNA dibandingkan dengan
ukuran kontrol.
Gel agarosa juga dapat digunakan untuk isolasi
fragmen DNA. Caranya dengan memotong gel
yang mengandung fragmen DNA tadi, kemudian
agar dihancurkan, dan DNA dipresipitasikan.

TRANSFORMASI & UJI

TRANSFORMASI
Transformasi: adalah teknik untuk memasukkan DNA
yang sudah diproses secara in vitro ke dalam suatu sel
organisme.
Contoh: Vektor yang sudah disisipi suatu gen, setelah
dianalisis dan berhasil, dimasukkan ke dalam sel E. coli.
Cara:
1. Vektor bersisipan dan E. coli dicampur dalam larutan
CaCl2 pada suhu 0 0C -5 0C.
2. Dilakukan heat shock (37 0C -45 0C), untuk
meningkatkan frekuensi transformasi.
3. Dari pengalaman hasil uji transformasi hanya 1%
populasi E. coli yang mampu mengambil DNA.

IDENTIFIKASI GEN/FRAGMEN
DNA
Metoda lainnya untuk identifikasi gen/fragmen DNA
dapat dilakukan dengan mis. Hibridisasi.
Deteksi sequence gen tertentu dapat dilakukan dengan
teknik hibridisasi molekular. Hibridisasi dapat dilakukan
dengan metoda Southern blotting.
Teknik ini berdasarkan pada ketentuan: hibridisasi terjadi
bila ssDNA dapat membentuk pasangan basa (anneal)
dengan complementary single stranded DNA-nya.
Sementara itu gagalnya annealing berarti keduanya
tidak berkomplemen/tidak homolog/tidak cocok.

IDENTIFIKASI GEN/FRAGMEN
DNA
Untuk hibridisasi fragmen DNA genom seseorang
(sejumlah klon gen) didigesti dengan enzim restriksi.
Fragmen yang dihasilkan dipisahkan dengan
elektroforesis gel, kemudian ditransfer dan difiksir pada
film nitroselulosa. Hibridisasi dilakukan dengan DNA
pelacak (probe/marker) yang dilabel dengan radioisotop,
dan ditangkap dengan film sinar-X, sehingga klon yang
mengandung sequence nukleotida homolog dengan
DNA probe dapat dideteksi.
Fragmen DNA/gen yang sudah diklon dapat digunakan
sebagai penanda/marker/probe hibridisasi
Mutasi yang ditandai oleh adanya perubahan ukuran
fragmen dapat dideteksi bila dibandingkan dengan pola
normal.

Complementary DNA (cDNA)

Seringkali identifikasi suatu gen dimulai
dengan identifikasi mRNA yang
ditranskripsikan oleh gen yang
bersangkutan. Untuk itu single stranded
RNA dikonversi lebih dahulu menjadi
double-stranded DNA dengan
menggunakan enzim reverse
transkriptase. Hasil konversi ini disebut
complementary DNA (cDNA).

DARI MANA ASAL PROBE?

Dari gen yang sudah diidentifikasi sebelumnya
Dengan menggunakan cDNA. Mis. cDNA dari mRNA
retikulosit (yang bila ditranslasikan akan menghasilkan
hemoglobin).
Dengan menggunakan pengetahuan kode genetik,
oligonukleotida dapat disintesis secara kimiawi dari hasil
sequencing asam-asam amino produk protein suatu gen.
Dengan menyatukan beberapa oligonukleotida, akhirnya
dapat didesain cDNA probe.
Dengan adanya kodon degeneratif pembuatan
oligonukleotida ini dilakukan dengan membuat beberapa
kemungkinan.
Bila tidak tersedia protein, pembuatan cDNA probe dapat
dicapai dari antibodi terhadap produk gen itu.

POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)
PCR (polimerase chain reaction): suatu teknik yang
dipergunakan untuk menggandakan sampel DNA yang
jumlahnya terlalu kecil dalam ukuran nanogram, dari
suatu campuran kompleks, dengan menggunakan jasa
enzim DNA polimerase.
Teknik ini diilhami oleh proses penggandaan/replikasi
alami DNA pada setiap sel organisme yang bernukleus,
dengan menggunakan enzim DNA polimerase.
Enzim polimerase adalah universal, dan dihasilkan serta
digunakan oleh sel organisme untuk mengadakan
replikasi atau penggandaan DNA sebelum mengadakan
pembelahan sel.
Teknik ini memungkinkan analisis fragmen DNA tertentu
tanpa harus melakukan kloning lebih dahulu.

POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)
1. Sintesis 2 primer oligonukleotida dengan panjang 20-35
nukleotida,berdasarkan sequence yang dikenal pada
fragmen DNA.
2.Kedua primer ditambahkan pada DNA genom (yang
berlaku sebagai template), kemudian DNA didenaturasi
untuk memisahkan kedua untai DNA, primer akan
3.Ditambahkan enzim Taq polimerase (dihasilkan oleh
bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber air
panas), aktivitas seperti DNA polimerase, dan tahan
terhadap suhu 95 0C.
4. Selain itu juga ditambahkan: bahan pembangun berupa
dNTP, bufer dan aquabides.

POLYMERASE CHAIN REACTION

(PCR)
5. Tahap-tahap PCR:
* Denaturasi:pemisahan DNA template.
* Annealing: hibridisasi primer-DNA template.
* Extension: elongasi/sintesis DNA.
* Inkubasi
6. Dilakukan penentuan waktu:
Mis. Denaturasi DNA pada suhu 94-95 0C, 30;
Annealing primer pada kedua ujung segmen DNA pada
suhu 50-55 0C, 30;
Elongasi pada suhu 68 0C, 90,
Dilakukan sebanyak 30-40 siklus .
Inkubasi pada 4 0C.

VERIFIKASI HASIL PCR

Hasil berupa pangkat dari penambahan jumlah
DNA. Jumlah material menjadi dobel pada
setiap akhir siklus. Oleh karena itu pada akhir
dari siklus ke 30 misalnya, fragmen DNA
sudah diamplifikasi sebanyak 230 kali, atau
sekitar sejuta kali.
Verifikasi hasil PCR dapat dilakukan dengan
elektroforesis gel, untuk visualisasi pita-pita
fragmen DNA khusus.

APLIKASI PCR
Tidak terbatas pada deteksi perubahan
nukleotida yang mengubah situs restriksi saja,
(karena mutasi).
Kemampuan PCR untuk menghasilkan sampel
fragmen DNA tunggal yang murni, memungkinkan hasilnya dapat digunakan untuk hibridisasi,
yang memungkinkan untuk mendeteksi
perbedaan nukleotida tunggal sampel DNA.
Uji genetik
Diagnosis
Kepentingan IKK

NORTHERN BLOTTING
Teknik yang digunakan untuk analisis
mRNA suatu gen. Caranya sama dengan
Southern blotting, hanya saja sampel
berupa mRNA, dihibridisasikan dengan
DNA probe.

Daftar Referensi
Pasternak JJ. An Introduction to Human
Molecular Genetics. 2nd ed. A John Wiley
& Sons Inc. Pub. 2005. New Yersey
Stratchan T, Read AP. Human Molecular
Genetics Bios Scientific Pub. 1996. New
York
Wiley, J. Gene Cloning.