Anda di halaman 1dari 66

HPLC

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

KIMIA ANALISIS
KUANTITATIF II
D III ANAFARMA
IIK BHAKTI WIYATA

By EVI K

HPLC
High Pressure Liquid Chromatography
High Performance Liquid Chromatography
Liquid Chromatography
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

HPLC
Chromatography teknik pemisahan
Liquid Fase gerak berupa cairan
High Pressure digunakan tekanan tinggi
untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom

HPLC
Dikembangkan

pada awal 1970-an


Dewasa ini merupakan teknik paling banyak
digunakan untuk pemisahan dan analisis dari
berbagai bidang seperti farmasi,
bioteknologi, lingkungan, polimer dan
makanan.
Merupakan method of choice for the
analysis of a wide variety compounds

HPLC
Ditinjau dr sistem peralatan HPLC termasuk
kromatografi kolom, krn dipakai fase diam
yang diisikan atau terpacking di dalam kolom.
Ditinjau dr fasa pemisahan HPLC termasuk
kromatografi adsorpsi atau partisi.
Proses pemisahan dilaksanakan di dalam
kolom
disertai
pemakaian
pelarut
pengembang dengan tekanan tinggi.

MAKSUD DAN TUJUAN HPLC

Didapatkan pemisahan yg baik dan proses


analisis berlangsung dalam waktu relatif
singkat

KEUNTUNGAN HPLC
Dapat dilakukan pd suhu kamar
Kolom dan pelarut pengembang dpt
digunakan berkali-kali
Detektor HPLC dpt divariasi dan banyak
jenisnya
Waktu analisis pd umumnya lbh singkat
Ketepatan dan ketelitian relatif tinggi
Mudah dioperasikan secara otomatis

TEORI DASAR HPLC


Kromatogram HPLC mrpkn hubungan antara
waktu sbg absis (x) dan tanggap detektor
sbg ordinat (y), dimana titik nol dinyatakan
sbg saat dimulainya injeksi sampel.
Idealnya profil setiap kromatogram HPLC
mrpkn suatu garis tegak lurus bagi masingmasing analit.

TEORI DASAR HPLC

Molekul2 sampel yg diinjeksikan menuju


kolom analisis tdk akan berkumpul pd satu
titik scr serempak dlm waktu yg sama, tiap2
molekul analit akan mengalami hambatan
fase diam di dlm kolom dg waktu yg berbeda,
krn itu semua molekul analit tdk serempak
keluar dr kolom.

TEORI DASAR HPLC

Molekul analit akan keluar dr kolom scr acak,


demikian pula respon detektor thd analit yg
keluar dr kolom tsb tdk serempak thd semua
molekul.

waktu

waktu

TEORI DASAR HPLC


Parameter yg digunakan untuk mengetahui
kualitas suatu kromatogram
Waktu Tambat/Waktu Retensi/Retention
Time (tR)
Merupakan selang waktu yg diperlukan
oleh analit mulai saat injeksi sampai keluar
dr kolom dan sinyalnya secara maksimal
ditangkap oleh detektor.

TEORI DASAR HPLC


Rt
Area

waktu

TEORI DASAR HPLC


Waktu tambat analit yg tertahan pd fase diam
dinyatakan sbg tR
Waktu tambat analit yg tidak tertahan pd fase
diam, atau yg sering disebut sbg waktu tambat
pelarut pengembang dinyatakan sbg t0 atau tM
Waktu tambat analit dikurangi dg waktu tambat
pelarut pengembang disebut sbg waktu tambat
terkoreksi
tR = tR - tM

TEORI DASAR HPLC


Faktor Kapasitas
Merupakan ciri khas suatu analit pd
kondisi tertentu, yaitu pd komposisi fase
gerak, suhu dan jenis kolom tertentu.
k = tR - t0
t0

TEORI DASAR HPLC


Harga k berkisar 1 10
Jika k < 1 elusi terlalu cepat.
Jika k > 10 elusi terlalu lambat
kA sebaiknya antara 1 dan 5

TEORI DASAR HPLC


Jumlah Pelat Teori
Merupakan banyaknya distribusi
keseimbangan dinamis yg terjadi di dalam
suatu kolom.
Digunakan utk mengetahui efisiensi suatu
kolom
N = 16 tR 2
N = 5,54 tR 2
W
W

TEORI DASAR HPLC


N = 16 tR

N = 5,54 tR

tR
= Waktu tambat analit
W
= Lebar pd dasar puncak
W = Lebar pd setengah tinggi puncak

TEORI DASAR HPLC


Rt

Area

H
W1/2
H1/2
W

Semakin besar harga N semakin baik

TEORI DASAR HPLC


Jarak Setara Pelat Teori (JSPT)
Tinggi Setara Pelat Teori (TSPT)
High Equivalent of Theoritical Plate (HETP)
Merupakan panjang kolom kromatografi (mm)
yg diperlukan sampai terjadinya satu kali
keseimbangan distribusi dinamis molekul analit
dlm fase gerak dan fase diam

TEORI DASAR HPLC

H=L/N
Makin kecil harga H maka makin efisien kolom
yg dipakai untuk pemisahan.

TEORI DASAR HPLC


Resolusi
Mengukur perbedaan waktu trambat (tR) dr
dua macam analit yg dibagi dg lebar dasar
puncaknya (W)
RS =
tR2 tR1
0,5 (W1+W2)

TEORI DASAR HPLC


Faktor Pemisahan ()
Menggambarkan pemisahan antara dua
puncak relatif terhadap satu sama lain,
dimana harus > 1
= tR2 t0
tR1 t0

TEORI DASAR HPLC


Faktor Simetri
Disebut juga tailing factor (TF), yaitu
terjadinya pengekoran pd kromatogram
sehingga bentuk kromatogram menjadi tidak
simetris.

TEORI DASAR HPLC


TF = BC
AC
h
A

Jika TF = 1berarti kromatogram simetris


Jika TF > 1 berarti kromatogram mengekor (tailing)
Jika TF < 1 berarti kromatogram mengandung (fronting)

TEORI DASAR HPLC

INSTRUMENTASI HPLC
Gradient
Controller

Column

Pump

Detector
Injector

Mobile Phases

INSTRUMENTASI HPLC
Pompa

Cairan
Persyaratan sistem pompa HPLC
- Memberikan tekanan sampai 6000-8000 psi
- Memberikan kecepatan aliran 0,1 10 ml/mnt
- Aliran terkontrol
- Tahan karat

INSTRUMENTASI HPLC

Gerbang suntik
Macam sistem injektor pada HPLC :
- Injektor dg diafragma (septum injector)
- Injektor tanpa diafgragma (septumless injector)
- Injektor dg pipa dosis (loop valve)
- Sistem injeksi otomatis (autoinjector)

INSTRUMENTASI HPLC
Keuntungan menggunakan septum injector:
Pengambilan volume sampel yg akan
diinjeksikan dpt dipilih sesuai dg keinginan
Sederhana dan harganya murah
Dpt diinjeksi dg volume sampel yg sedikit
Mrpkn sistem injeksi yg paling banyak
digunakan

INSTRUMENTASI HPLC
Keuntungan menggunakan septumless injector:
Dpt mencegah tersumbatnya jarum injektor krn
pengaruh dr partikel diafragma (septum) dmn
hal ini akan dapat menyumbat kolom HPLC

INSTRUMENTASI HPLC
Keuntungan menggunakan loop valve:
Akan didapatkan ketepatan jumlah volume
sampel. Hal ini penting khususnya untuk
analisa kuantitatif.
Keuntungan menggunakan auto injector:
Volume yg diinjekkan tdk akan berkurang
selama proses injeksi
Mampu memisahkan sampel-sampel dlm
jumlah yg banyak dan dlm waktu yg singkat

INSTRUMENTASI HPLC

Kolom HPLC
Merupakan bagian yg sangat penting dlm HPLC
krn pemisahan komponen-komponen sampel
akan terjadi di dalam kolom.
Harus diperhatikan:
- Pemilihan kolom yg sesuai
- Pemeliharaan kolom
- Uji thd spesifikasi kolom

INSTRUMENTASI HPLC
Fase Diam Kolom
Kolom Fase Normal
Fase diam bersifat polar, dan fase gerak
bersifat nonpolar, sehingga analit yg
dipisahkan adl analit yg bersifat nonpolar
Contoh:

INSTRUMENTASI HPLC
Fase Diam Kolom
Kolom Fase Terbalik
Fase diam bersifat nonpolar, dan fase gerak
bersifat polar, sehingga analit yg dipisahkan
adl analit yg bersifat polar
Contoh:

INSTRUMENTASI HPLC
Kolom HPLC diletakkan di dalam oven untuk
menjaga suhu kolom agar tetap stabil.
Oven kolom yg banyak dipakai adalah dg
menggunakan sirkulasi udara panas yg
bertekanan dengan suhu kerja sampai
dengan 99C

INSTRUMENTASI HPLC

Detektor
Berfungsi untuk memberikan informasi ttg segala
sesuatu yg diperlukan sehubungan dg tujuan
analisis kualitatif maupun kuantitatif yg
menggunakan metode HPLC

INSTRUMENTASI HPLC
Persyaratan detektor;
Mempunyai sensitivitas tinggi
Stabil dan reprodusibel
Memberikan tanggapan yg linier thd
konsentrasi analit
Dpt bekerja mulai dr suhu kamar sampai dg
suhu 400C
Tdk dipengaruhi perubahan suhu dan
kecepatan pelarut pengembang

INSTRUMENTASI HPLC
Macam detektor HPLC
Detektor UV/VIS
Detektor Photodiode Array

PELAKSANAAN ANALISIS
DENGAN HPLC
Pemilihan pelarut pengembang

Harus derajat pro HPLC

Memperhatikan tetapan fisika dan kimia


(viskositas, daya mampat/kompresibilitas,
tekanan uap, etc)

Memperhatikan pernyataan dan peringatan


badan-badan resmi
Contoh: metanol, acetonitril, THF
1.

PELAKSANAAN ANALISIS
DENGAN HPLC
2.

Pemilihan kolom
Dengan melakukan trial and error
Menyamakan kolom yg digunakan utk analit
yg serupa
Mendapatkan informasi dr pustaka

PELAKSANAAN ANALISIS
DENGAN HPLC
Parameter untuk mengetahui keefektifan
pemisahan dlm kolom:
Kecepatan, kapasitas dan daya pisah
Kecepatan dpt diukur melalui waktu tambat
analit (tR)
Kapasitas dpt diukur melalui faktor kapasitas
(k)
Daya pisah dpt diukur melalui faktor
selektifitas () dan resolusi (R)

PELAKSANAAN ANALISIS
DENGAN HPLC

Panjang kolom
Tekanan kolom

Penggunaan Kolom
Sebelum digunakan hendaknya kolom dialiri
dg pelarut pengembang yg kuat seperti
metanol, eter atau heksana untuk
menghindari adanya perubahan tekanan dan
suhu yg mendadak.

PELAKSANAAN ANALISIS
DENGAN HPLC
Preparasi Sampel
Sampel diusahakan untuk dilarutkan dlm
pelarut yg komposisinya sama dg komposisi
fase gerak yg dipakai.
2.

METODE ANALISIS HPLC


Analisis kualitatif
mendeteksi ada atau tidaknya suatu
senyawa dlm sampel
Analisis kuantitatif
memberikan informasi ttg jumlah
komposisi analit yg terdapat dlm sampel.

METODE ANALISIS HPLC


HPLC tdk dpt memberikan informasi ttg
suatu senyawa yg belum diketahui, karena
teknik yg digunakan dlm HPLC adalah dg
membandingkan data yg ada pada
pembandingnya

ANALISIS KUALITATIF
Mengacu pada :
Waktu tambat puncak kromatogram analit
Pemurnian zat yg dianalisis dan melanjutkan
dengan teknik analisis yg lain

ANALISIS KUALITATIF

Kendala :
Tdk terjaminnya kesempurnaan pemisahan
dan rumitnya matriks sampel yg dianalisis

ANALISIS KUALITATIF

Pemakaian waktu tambat


Waktu tambat suatu analit pd analisis
kualitatif sifatnya khas namun tdk spesifik.
Dipengaruhi oleh:
Macam pelarut pengembang
Jenis detektor yg dipakai
Jenis kolom yg dipakai

ANALISIS KUALITATIF
Pengamatan dilakukan dengan:
Membandingkan dg waktu tambat standar
pembanding
Membandingkan beda waktu tambat analit
dg standar internal yg ditambahkan ke dalam
sampel
Membandingkan waktu tambat dg waktu
tambat standar pembanding yg
dipublikasikan

ANALISIS KUALITATIF

Pemurnian zat yg dianalisis dan melanjutkan


dengan teknik analisis yg lain
Aliran efluen (campuran analit dan fase
geraknya) yg telah melalui detektor dan telah
diketahui waktu tambat analitnya ditampung,
kemudian dilakukan analisis kualitatif dan
kuantitatif dg metode fisikokimia lain spt:
Spektrofotometer UV-Vis, IR, dsb

ANALISIS KUANTITATIF

Dpt

dilakukan secara sepihak, artinya tanpa


mengacu pada zat standar pembanding.
Atau dpt pula dilakukan pembandingan
dengan zat standar pembanding sbg standar
internal maupun standar eksternal

ANALISIS KUANTITATIF
Analisis perhitungan:
Dengan mengukur tinggi puncak
kromatogram
Dengan menentukan area kromatogram

ANALISIS KUANTITATIF
Pengukuran tinggi puncak kromatogram
Lebih sederhana dan cepat, tetapi pd puncak
kromatogram yg besar (diluar skala) akan
banyak informasi kadar yg tdk terdeteksi.
Tdk dpt dipakai utk analisis kuantitatif pd
komponen2 yg memberikan tanggap
detektor yg sama atau mendekati

ANALISIS KUANTITATIF
Penentuan area kromatogram
Merupakan cara terbaik utk menentukan
kadar analit pd kromatogram krn area
kromatogram sangat proporsional dg
konsentrasi analit.
Penentuan area yg sangat sulit scr manual
tlh dpt teratasi dg penentuan scr otomatis.

GANGGUAN PADA HPLC


Dapat dilihat pd kromatogram yg dihasilkan.
Dibedakan atas:
Gangguan sistem garis dasar
Gangguan bentuk puncak

GANGGUAN PADA HPLC


Gangguan sistem garis dasar yg mungkin
timbul:
Noise (derau)
Drift (melayang)
Spiking (berpaku)
Wander (menyimpang)
Shift ( bergeser)

GANGGUAN PADA HPLC


Gangguan bentuk puncak (peak shape) yg
mungkin timbul:
Puncak lbh kecil dr yg diharapkan
Tailing (mengekor)
Fronting (mengandung)
Puncak berubah bentuk (cigar top, round top,
flat top)
Puncak membelah (split)
Puncak negatif

GANGGUAN PADA HPLC

HPLC

SOLVEN

%A %B %C
Flow Rate
{H2O}
{MeOH} (mL/min)

to column

Pressure
(atmos.)

load
Ready

inject

Rheodyne
Injector
Varian 9010 Solvent Delivery System

to injector

Column

through pump

through
pulse
dampener

Ternary Pump

from solvent
reservoir

to
detector

KOLOM HPLC
Column
the key part of the separation

SAMPLE INJECTION
Load and Inject -Position

Kromatograf
Preparasi
sampel

Sampel

Kromatogram
B

Respon
detektor

D
0

10
15
waktu (menit)

20

Absorbance

HPLC
Chromatograms

Peak A

Approximation
of peak area by

triangulation

Peak B
height

Time (minutes)
Rt = 3.0 min.
faster moving
less retained

Rt = 5.2 min.
slower moving
more retained

7
base

Area =

base x height
2