Anda di halaman 1dari 24

MAKALAH ORGANOLOGAM

SYNTHESIS AND APPLICATION OF ORGANOMERCURY HAPTENS FOR


ENZYME-LINKED IMMUNOASSAY OF INORGANIC AND ORGANIC MERCURY
Caryn K. Prudente, Rebekah S. Sirios, Shaun Cote (2010)
Sintesis dan Aplikasi dari Organomerkuri Hapten untuk Enzyme-linked Immunoassay
pada Merkuri Anorganik dan Organik

Disusun oleh:
Yuni Prasetiowati
Tiva Umaroh

103234023
103234025

Jepi Isnanto

103234030

Maulani Anies Shiami

103234035

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
2013

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Merkuri adalah logam yang secara terus-menerus berada di lingkungan dan
terakumulasi dalam rantai makanan. Merkuri ada dalam bentuk organik maupun
anorganik. Bentuk organik dapat dibagi sebagai elemental merkuri dan garam merkuri.
Organomerkuri mengandung senyawa alkil da aril didalamnya. Elemental merkuri
menguap pada suhu ruang dan bereaksi dengan banyak unsur membentuk garam,
amalgam, dan senyawa organomerkuri.
Pada dasarnya semua bentuk merkuri adalah toksik. Misalnya senyawa
organomerkuri, sangat beragam dari senyawa dengan toksisitas rendah (mercurochrome)
sampai senyawa dengan toksisitas tinggi (dimetilmerkuri). Merkuri di alam, secara
toksikologikal merupakan unsur yang penting. Dinyatakan oleh Environmental
Protection Agency (EPA) bahwa merkuri merupakan unsur yang berbahaya akibat
sifatnya yang tetap dan akumulatif di lingkungan dan biota. Meskipun merkuri bukan
unsur kimia yang melimpah di alam, merkuri menjadi tersebar luas akibat hasil dari
banyak industri dan agrikultural proses.
Merkuri memiliki peran penting dalam lingkup kimia bioanalitik, seperti
sejumlah aplikasi berbasis merkuri beragam ditemukan di seluruh literatur. Misalnya,
merkuri yang memiliki sifat elektronik unik telah terbukti berguna dalam merancang
metode pengujian tiol berbasis elektrokimia. Logam merkuri telah membantu
karakterisasi mikroskop elektron dari protein dan telah dimasukkan ke dalam neon
peptida dan kepingan protein. Baru-baru ini, sensor kimia dan fluorescent telah dibuat
untuk mendeteksi merkuri dan spesies logam lainnya, dan berbagai metode
nanoteknologi telah muncul. Telah ada minat dalam mengembangkan antibodi antimerkuri monoklonal (mAb: monoclonal antibody) untuk digunakan sebagai alat
diagnostik yang mampu memberikan spesifikasi tinggi, murah, mudah digunakan dalam
tes deteksi merkuri. Logam merkuri, garam merkuri, dan senyawa organomerkuri adalah
racun di lingkungan dan ada terus-menerus, dan bahaya bagi kesehatan manusia,
mamalia, dan sistem perairan. Meskipun kemajuan di teknik instrumental canggih
mampu mendeteksi logam berat pada konsentrasi sangat rendah, masih ada minat dalam

pengembangan uji logam yang mudah digunakan yang menyediakan efisiensi, hemat
biaya, dan deteksi merkuri yang sensitif.
Pmbuatan biokonjugat yang mengandung logam dengan tujuan menghasilkan
antibodi yang mampu mengikat logam dan ion logam, telah menjadi fokus dari banyak
upaya penelitian selama lebih dari 20 tahun. Karena logam, seperti banyak hapten
dengan berat molekul rendah, tidak imunogenik, salah satu pendekatan yang umum
dilakukan untuk menghasilkan spesies imunogenik berbasis logam yang melekatkan
secara kovalen EDTA atau agen pengkhelat logam lainnya pada permukaan protein.
Bagian khelat memfasilitasi enkapsulasi logam dalam struktur kandang di permukaan
karier melalui pembentukan ikatan koordinasi antara atom khelat kaya elektron dan atom
logam yang kekurangan elektron. Contoh awal dari biokonjugat dibuat dari metodologi
khelasi logam telah menghasilkan beberapa substrat berguna. Meskipun beberapa dari ini
biokonjugat sebelumnya tidak menghasilkan antibodi dengan kekhususan mengikat
memadai untuk tes analitis, biokonjugat khelat logam telah menemukan aplikasi praktis
sebagai antibodi terapi logam berlabel, sebagai substrat pencitraan resonansi magnetik,
dan teknik radioimaging. Salah satu ekstensi terbaru dari metodologi khelasi EDTA telah
sintesis sensor optik neon yang dirancang untuk mendeteksi ion Hg2+. Dalam jurnal ini,
ion Hg2+ terjebak dalam struktur kandang seperti yang timbul dari suatu dimer porfirin.
Pekerjaan awal telah menunjukkan bahwa sensor kimia mampu mendeteksi Hg2+ pada
konsentrasi 104-107 M dengan derajat spesifitas tinggi atas ion logam divalen lainnya.
Saat ini, hanya ada beberapa contoh protokol yang telah menghasilkan antibodi
yang mengikat logam dari metodologi selain kompleksasi khelat. Benkovic dan rekan
kerja memodifikasi secara kimia situs pengikatan antibodi katalitik untuk
mengakomodasi kompleksasi ion Zn2+. Laju hidrolisis katalitik yang dihasilkan oleh
substrat AbZn2+ diamati untuk meningkatkan relatifitas terhadap antibodi asli. Mirip
dengan enkapsulasi merkuri dalam khelat, yang lain telah mengeksploitasi afinitas ikatan
yang tinggi dari sulfur untuk logam merkuri. Setelah secara kovalen mengikat
glutathione, tripeptida dari asam glutamat, sistein, dan glisin, terhadap Keyhole Limpet
Hemocyanin (KLH) melalui karbodiimida kimia, merkuri klorida (HgCl2) melekat pada
karier glutathione termodifikasi oleh pertukaran ligan yang dimediasi sulfur. Imunogen
yang dihasilkan menghasilkan antibodi yang mampu mendeteksi konsentrasi rendah
garam merkuri (II) dalam air.

Rancangan dan persiapan sintesis hapten organomerkuri dilakukan dengan


metode konjugasi protein, dengan tujuan menghasilkan antibodi yang mampu mengikat
baik logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri di berbagai media sampel.
Strategi secara keseluruhan adalah dengan melakukan reaksi oxymerkurasi intramolekul
untuk mensintesis struktur sederhana, tapi kuat secara kimia, hapten organomerkuri yang
mudah terikat kovalen pada protein karier melalui amina yang ada, strategi yang cukup
unik dibandingkan dengan yang sebelumnya dijelaskan dalam metode khelasi. Dalam
studi ini, antibodi anti-merkuri tikus yang sangat serbaguna diberikan dengan
menerapkan strategi yang dievaluasi secara mendalam melalui berbagai format
immunoassay. Hasil dari penelitian ini memberikan dorongan untuk mengejar produksi
mAb. Berdasarkan hasil yang dijelaskan di bawah ini, bahwa mAb yang berasal dari
hapten organomerkuri akan sangat kuat, sehingga sistem deteksi merkuri serbaguna dan
sangat sensitif.

B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana proses sintesis dan karakterisasi hapten organomerkuri?
2. Bagaimana penerapan hapten organomerkuri sebagai antibodi yang mampu mengikat
baik logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri diberbagai media sampel?

C. Tujuan
1. Mengetahui peroses sintesis dan karakterisasi hapten organomerkuri.
2. Mengetahui penerapan hapten organomerkuri sebagai antibodi yang mampu mengikat
baik logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri diberbagai media sampel.

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

A. Organomerkuri
Organomerkuri mengacu pada kelompok senyawa organologam yang
mengandung merkuri. Biasanya ikatan Hg-C stabil terhadap udara dan kelembaban,
tetapi sensitif terhadap cahaya. Senyawa organomerkuri yang penting adalah kation
metilmerkuri (CH3Hg+), kation etilmerkuri (C2H5Hg+), dimetil merkuri (CH3)2Hg, dan
dietilmerkuri. Merkuri organik (RHg, R2Hg, ArHg) seperti metilmerkuri dan etilmerkuri
yang keduanya termasuk bentuk alkil rantai pendek dijumpai sebagai kontaminan logam
dilingkungan. Merkuri organik merupakan bentuk senyawa merkuri yang paling
berbahaya. Sebagian besar peristiwa keracunan merkuri disebabkan oleh senyawa ini.
Merkuri organik digunakan secara luas pada industri pertanian, industri pulp dan kertas,
dan dalam bidang kedokteran. Senyawa ini juga dapat terbentuk dari metabolisme
merkuri metalik atau dari merkuri anorganik dengan bantuan mikroorganime tertentu
baik dalam lingkungan perairan ataupun dalam tubuh manusia.

B. Reaksi Oksimerkurasi
Reaksi oksimerkurasi merupakan reaksi adisi elektrofilik yang mengubah suatu
alkena menjadi alkohol netral. Dalam oksimerkurasi, akena bereaksi dengan Hg(II) asetat
dalam larutan aquos membentuk adisi gugus asetoksimerkuri (HgOAc) dan gugus
hidroksi (OH).
Contoh reaksi Oksimerkurasi:

Mekanisme reaksi oksimerkurasi secara umum dijelaskan oleh gambar berikut:

Seperti reaksi adisi pereaksi lain terhadap alkena, oksimerkurasi merupakan


reaksi dua tahap. Adisi dimulai dari serangan nukleofilik (HgOAc)+ yang diikuti oleh
serangan nukleofilik H2O.

C. Immunoassay
Immunoassay adalah deteksi dan uji zat dengan metode serologis (imunologi),
pada sebagian besar aplikasi zat tersebut berfungsi sebagai antigen, baik dalam produksi
antibodi dan dalam pengukuran antibodi oleh zat uji. Metode deteksi secara Enzyme
Linked Immunosorbent Assay (ELISA) yang berdasarkan reaksi spesifik antara antigen
dengan antibodi memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi karena menggunakan
enzim sebagai indikatornya. ELISA juga memiliki keunggulan sebagai metode yang
sederhana, cepat, murah, dapat mendeteksi sampel dalam jumlah banyak.
ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifisitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah yang tidak diketahui dari antigen yang bergerak pada
dukungan solid baik non-spesifik (melalui adsorps ke permukaan) atau khusus melalui
penangkapan oleh antibodi lain spesifik terhadap antigen yang sama. Setelah antigen
tersebut bergerak, antibodi deteksi yang ditambahkan membentuk kompleks dengan
antigen. Deteksi antibodi kovalen dihubungkan dengan enzim atau dapat dideteksi
sendiri oleh antibodi sekunder yang terkait dengan enzim melalui biokonjugat. Pada
tahapannya, setiap langkah plate biasanya dicuci dengan larutan deterjen ringan untuk
menghilangkan protein atau antibodi yang tidak terikat secara khusus. Setelah langkah

akhir, plate dikembangkan dengan menambahkan substrat enzimatik untuk menghaslkan


sinyal yang terlihat dan menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel.
Antigen adalah suatu substansi kimia yang mampu merangsang sistem imun
untuk menimbulkan respon spesifik. Contoh antigen tidak lengkap adalah hapten. Hapten
adalah molekul organik kecil yang dapatmengikat bagian reseptor antigen. Meskipun
molekul ini kecil tetapi dapat menginduksi responimun sendiri. Selain itu juga dapat
menginduksi antibodi dengan titer yang tinggi jika diikatkan dengan pembawa carrier
berupa protein yang mempunyai berat molekul tinggi atau polimersintetik contohnya
adalah logam berat non-mulia.
Antibodi merupakan biomolekul yang tersusun atas protein dan dibentuk sebagai
respons terhadap keberadaan benda-benda asing yang tidak dikehendaki di dalam tubuh
kita. Benda-benda asing itu disebut antigen. Tiap kali ada benda-benda asing yang
masuk ke dalam tubuh diperlukan 10-14 hari untuk membentuk antibodi. Antibodi
dihasilkan oleh limfosit B atau sel-sel B. Antibodi digunakan untuk menetralkan atau
menghancurkan antigen yang masuk ke dalam tubuh. Setiap detik sekitar 2.000 molekul
antibodi diproduksi oleh sel-sel B. Salah satu contoh peristiwa yang melibatkan antibodi
adalah ketika kulit kita terkena infeksi karena luka maka akan timbul nanah. Nanah itu
merupakan limfosit atau sel-sel B yang mati setelah berperang melawan antigen.
Antibodi tidak dapat menghancurkan antigen. Antibodi tidak bisa secara langsung
menghancurkan antigen. Fungsi utama antibodi adalah menonaktifkan dan menandai
antigen untuk pengancuran lebih lanjut. Umumnya, jika antibodi bertemu dengan antigen
akan terbentuk kompleks antigen-antibodi.
Antibodi dapat ditemukan pada aliran darah dan cairan nonseluler. Antibodi
memilik struktur molekul yang bersesuaian dengan antigen secara sempurna, seperti
anak kunci dengan lubangnya. Tiap jenis antibodi spesifik terhadap antigen jenis tertentu.

Jenis-jenis Antibodi
Antibodi disebut juga immunoglobulin (Ig) atau serum protein globulin, karena
berfungsi untuk melindungi tubuh lewat proses kekebalan (immune).Ada lima macam
immunoglobulin, yaitu IgG, IgM, IgA, IgE, dan IgD.
ImmunoglobulinG (IgG)

IgG terbentuk 2-3 bulan setelah infeksi, kemudian kadarnya meninggi dalam satu
bulan, menurun perlahan-lahan, dan terdapat selama bertahun-tahun dengan kadar
yang rendah. IgG beredar dalam tubuh dan banyak terdapat pada darah, sistem
getah bening, dan usus. Senyawa ini akan terbawa aliran darah langsung menuju
tempat antigen berada dan menghambatnya begitu terdeteksi. Senyawa ini
memiliki efek kuat antibakteri maupun virus, serta menetralkan racun. IgG juga
mampu menyelinap diantara sel-sel dan menyingkirkan mikroorganisme yang
masuk ke dalam sel-sel dan kulit. Karena kemampuan serta ukurannya yang kecil,
IgG merupakan satu-satunya antibodi yang dapat dipindahkan melalui plasenta
dari ibu hamil ke janin dalam kandungannya untuk melindungi janin dari
kemungkinannya infeksi yang menyebabkan kematian bayi sebelum lahir.
Selanjutnya immunoglobulin dalam kolostrum (air susu ibu atau ASI yang
pertama kali keluar), memberikan perlindungan kepada bayi terhadap infeksi

sampai sistem kekebalan bayi dapat menghasilkan antibodi sendiri.


Immunoglobulin A (IgA)
Immunoglobulin A atau IgA ditemukan pada bagian-bagian tubuh yang dilapisi
oleh selaput lendir, misalnya hidung, mata, paru-paru, dan usus. IgA juga
ditemukan di dalam darah dan cairan tubuh lainnya, seperti air mata, air liur, ASI,
getah lambung, dan sekresi usus.
Antibodi ini melindungi janin dalam kandungan dari berbagai penyakit. IgA yang
terdapat dalam ASI akan melindungi sistem pencernaan bayi terhadap mikroba

karena tidak terdapat dalam tubuh bayi yang baru lahir


Immunoglobulin M (IgM)
Antibodi ini terdapat pada darah, getah bening, dan pada permukaan sel-sel B.
Pada saat antigen masuk ke dalam tubuh, Immunoglobulin M (IgM) merupakan
antibodi pertama yang dihasilkan tubuh untuk melawan antigen tersebut. IgM
terbentuk segera setelah terjadi infeksi dan menetap selama 1-3 bulan, kemudian
menghilang.
Janin dalam rahim mampu memproduksi IgM pada umur kehamilan enam bulan.
Jika janin terinfeksi kuman penyakit, produksi IgM janin akan meningkat. IgM
banyak terdapat di dalam darah, tetapi dalam keadaan normal tidak ditemukan
dalam organ maupun jaringan. Untuk mengetahui apakah janin telah terinfeksi

atau tidak, dapat diketahui dari kadar IgM dalam darah.


Immunoglobulin D (IgD)
Immunoglobulin D atau IgD juga terdapat dalam darah, getah bening, dan pada
permukaan sel-sel B, tetapi dalam jumlah yang sangat sedikit. IgD ini bertindak

dengan menempelkan dirinya pada permukaan sel-sel T, mereka membantu sel

sel T menangkap antigen.


Immunoglobulin E (IgE)
Immunglobulin E atau IgE merupakan antibodi yang beredar dalam aliran darah.
Antibodi ini kadang juga menimbulkan reaksi alergi akut pada tubuh. Oleh karena
itu, tubuh seorang yang sedang mengalami alergi memiliki kadar IgE yang tinggi.
IgE penting melawan infeksi parasit, misalnya skistosomiasis, yang banayk
ditemukan di negara-negara berkembang.

BAB III
METODE PENELITIAN

1. Sintesis hapten dan prosedur biokonjugasi


Tert-butil alil karbamat (2)

4,87ml alilamin (65 mmol) dalam 80 ml H2O

Ditambah 40ml Na2CO3 1,5 M


Ditambah 13,9 ml di-tert-butilkarbonat (63,7mmol)
Distirer semalam dalam suhu kamar

Tert-butil alil karbamat

Tert-butil N-[2-(kloromerkurio)-3-[(1-hidroksipentana-2-il)oksi] propil karbamat (3)


Merkuri nitrat (162mg, 0.5 mmol)

Tert-butil alil karba

Dilarutkan dal

Dilarutkan dalam 3 ml CH3CN

Dimasukkan dalam labu

Distirer selama 15 menit di suhu ruang

Larutan kuning cerah

Padatan kuning
Ditambah 1,2-pentanadiol (105l, 0.98mmol) yang dilarutkan dalam 2ml CH3CN
Distirer dalam N2 di suhu ruang semalam

Campuran kuning

Tert-butil N-{3-[(1-hidroksipentana-2-il)oksi] propil} karbamat (4)

Hasil (3) dalam 2 ml CH2Cl2

Direduksi dengan 37 mg (1mol) NaBH4 yang terlarut dalam 1ml NaOH 0,2M
Distirer dalam suhu ruang

Campuran menjadi suspensi abu-abu

Setelah distirer 15 menit, produk mentah difiltrasi melalui Celite


Filtrat diekstrak dengan CH2Cl2
Fraksi organik dicuci dengan air asin da dikeringkan dengan Na2SO4

Minyak kuning pucat

2-[3-amino-2-(kloromerkurio)propoksi] pentana-1-ol (5)


Hasil (3) (248mg 0,5mmol) dalam 2 ml CH2Cl2

Dideproteksi dengan 114 mg (1mmol) TFA yang terlarut dalam 2 ml CH2Cl2


Distirer di suhu ruang selama 1 jam
Diekstraksi dengan air, kemudian fasa aquos dibasakan dengan NaOH sampai pH 8-9
Difiltrasi

Minyak pekat berwarna kuning

2. Persiapan fase padat konjugat


Persiapan biokonjugat BS3

1,0 ml larutan BSA


Diencerkan dalam 20 mM fosfat buffer dengan 150 mM saline pada pH 7,2 (PBS)
Ditambahkan 0,023 mmol hapten 1 (8,0 mg)
Ditambahkan 0,023 mmol hapten 5 (9,0 mg)
Distirer
Ditambahkan 0,6 ml (0,031 mmol) BS3 pada 30 mg/ml dalam PBS
Distirer selama 2 jam.
Fase padat BS3 biokonjugat

Dimurnikan dengan kromatografi (Sephadex G-25) dengan menggunakan PBS sebagai e


Hasil

Persiapan biokonjugat SMCC

Minyak mentah hapten 1 (5,0 Minyak


mg, 0,014
mentah
mmol)
hapten 5 (6,0 mg, 0,0
Ditempatkan dalam vial

Ditempatkan d

Diencerkan dengan 200 l dari PBS (masing-masing sampel)


Ditambah 200 l dari 30 mg/ml (0,018 mmol) SMCC (masing-masing sampel)
Keduanya dicampur
Distrirer selama 1 jam dalam botol terpisah

Ditambah 20 mg BSA (10 mg ml dalam PBS) dan 1,0 ml dari 4,0-mg/ml (0,030 mmol) lar
Diinkubasi selama 1 jam pada RT
larutan BSA/2-IMT dilewatkan melalui kolom Sephadex G-25 menggunakan PBS sebagai
Hasil

3. Persiapan immunogen dan antisera

Penelitian bermaksud menggunakan BSA sebagai pembawa untuk pengujian fase


padat tersebut, IgG ayam terpilih sebagai pembawa imunogen untuk meminimalkan
ikatan spesifik.
500 l larutan 20 mg/ml IgG ayam pada PBS

Ditambahkan 10 mg (0,028 mmol) dari (5-metilmerkuri klorida tetrahidrofuran-2-il) - me


Diaduk
Ditambahkan 170 l dari 30 mg/ml BS3 (8,9x10-3 mmol)
Distirer selama 90 menit
Immunogen

Dimurnikan dengan kromatografi (Sephadex G-25) dengan menggunakan P


Larutan immunogen
Diencerkan menjadi 3,0 mg/ml dalam PBS
Disaring
Disimpan pada -20 oC sampai digunakan
Hasil

Mencit

Diimmunisasi setiap minggu dengan 100 g antigen dengan 100 g antigen dicampur d

Darah dikumpulkan melalui pendarahan retro-orbital sebelum immunisasi awal dan setia

Darah dibiarkan membeku pada suhu kamar dan kemudian diinkubasi pada 4 oC semala
Disentrifugasi pada 3000 rpm dalam pendingin microfuge termoIEC.
Serum dipindahkan dan disimpan pada -20 oC tanpa pemurnian lebih lanjut

Hasil

4. Pelapisan plat dan prosedur ELISA


Plat mikrotiter skrining

Dilapisi dengan 100 l dari BSA BS3 hapten 1 yang diencerkan sampai 10 g/ml dalam P
Konsentrasi lapisan optimal ditentukan dengan titrasi fase padat dengan menggunakan
Plat dicuci tiga kali dengan 20 mmol PBS yang mengandung 0,05 % Tween 20

Plat diblok paling sedikit 1 jam pada RT dengan 250 ml dari 1% baik BSA dalam PBS ata
Plat disimpan pada suhu 4 oC sampai digunakan

Hasil
Antisera yang serial

Diencerkan dalam PBS yang mengandung 0,05% Tween 20


Ditambahakan HRP-label anti-tikus IgG (GAM-HRP) yang diencerkan menjadi 10,0 ng/ml
Ditambahkan 75 l antibodi deteksi HRP label, Gam-HRP
Ditambahkan plat yang telah dilapisi
Ditambahkan 50 l dari 1,0 mg/ml OPD pada penyangga peroksida stabil

Setelah berdiri selama 15-30 menit pada RT, reaksi diakhiri dengan menambahkan 50

Absorbansi diukur pada 490 nm dan direkam dengan menggunakan Bio-Tek Instrumen p

Hasil
Semua analisa diukur setidaknya diduplikat dan umumnya dalam rangkap tiga.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sintesis Hapten Organomerkuri


Yang pertama dilakukan dalam jurnal ini adalah melakukan sintesis hapten
berbasis organomerkuri. Hapten adalah molekul kecil yang bersifat antigenik tapi tidak
imunogenik, yang bisa berikatan dengan produk respon imun tapi tidak bisa
membangkitkan respon imun. Antibodi atau limfosit teraktivasi yang terbentuk untuk
melawan ikatan tersebut kemudian seringkali akan bereaksi secara terpisah terhadap
protein atau hapten. Hapten yang menimbulkan tipe respon imun seperti obat-obatan
dengan berat molekul rendah, unsur kimiawi dalam debu, produk pemecahan ketombe
dari hewan, bahan kimiawi industri , toksin dari racun tumbuh-tumbuhan yang menjalar,
dll.
Hapten + Protein Karier imunogenik.
Keterangan : Hapten yang berikatan dengan protein karier bersifat imunogenik
yang disebut hapten carriers conjugate.
Hapten 1 disintesis dari material awal 2-propen-1-amina 1. Berikut adalah
gambaran reaksinya:

Gambar 1. Sintesis 1: pembentukan hapten 1.


Sintesis hapten organomerkuri 1 dimulai dengan melindungi alil amina (dalam hal ini 2propen-1-amina) dengan t-butil karbamat. Rekristalisasi dari reaksi campuran t-BOCalilamina membentuk epoksida 2 akibat adanya reaksi dengan mCPBA dalam CH2Cl2.
Kemudian dibentuk senyawa hidroksi alkena 3 dengan reaksi menggunakan
reagen Grignard dan dioxane. Tujuan penggunaan dioxane, yang merupakan eter, adalah

untuk membuka cincin nukleofilik dari epoksida. Ketika magnesium bromida berada
dalam larutan, epoksida 2 mudah bereaksi terhadap ion bromida yang membantu
terbukanya cincin nukleofilik membentuk bromohidrin sebagai produk samping. Pada
saat larutan yang kaya dialilmagnesium, yang dihasilkan dari reaksi Reagen Grignard
dan dioxane, akan terjadi reaksi dengan epoksida 2 menghasilkan hidroksi alkena 3 tanpa
ada gangguan dari bromohidrin.
Dengan terbentuknya senyawa hidroksi alkena 3, sintesis dengan metode
intramolekular oxymerkurasi dapat dilakukan. Senyawa 3 merupakan prekursor
organomerkuri yang dapat digunakan dalam membuaat hapten organomerkuri.
Reaksi oxymerkurasi dilakukan dengan menambahkan merkuri (II) asetat
terhadap larutan hidroksi alkena 3 dalam asetonitril. Kemudian dalam campuran diberi
NaCl untuk memfasilitasi pertukaran ligan menghasilkan siklis merkuri klorida 4.
Tahap akhir dari sintesis hapten 1, senyawa 5, deproteksi terhadap t-BOC
senyawa 4 dilakukan oleh pemberian TFA (trifluoroacetic acid/asam trifluoroasetat) yang
berlebih, yang hasilnya dilepaskan oleh pemberian NaOH dan diperoleh hasil utama
yaitu amina bebas hapten organomerkuri 5.
Dalam jurnal ini tidak hanya dilakukan satu jenis sintesis hapten organomerkuri
saja melainkan juga dilakukan sintesis hapten 5 yang juga berbasis organomerkuri.
Berikut adalah gambaran reaksinya:

Gambar 2. Sintesis 2: pembentukan hapten 5


Prinsip sintesisnya mirip dengan sintesis hapten 1, yaitu proteksi alilamin 1 (2propen-1-amina) menggunakan t-BOC untuk menghasilkan senyawa 2. Namun, reaksi
oxymerkurasi yang dilakukan dalam pembentukan hapten 5 adalah reaksi oksimerkurasi

intermolekular, dimana t-BOC-alilamin direaksika dengan merkuri (II) nitrat, diikuti


adisi in situ 1,2-pentanadiol yang menghasilkan intermediet merkurinium.
Jika dalam sintesis hapten 1 merkuri (II) asetat memfasilitasi reaksi
oksimerkurasi, dalam sintesis hapten 5 t-BOC-alilamin 2 membutuhkan merkuri (II)
nitrat yang lebih elektrofil untuk mempercepat reaksi adisi yang menghasilkan senyawa
3. Sedikit dari senyawa 3 direduksi menjadi senyawa 4 dengan pemberian NaBH4 untuk
meminimalisasi pembongkaran terhadap merkuri selama karakterisasi.
Tahap akhir dari sintesis hapten 5, senyawa 5, dilakukan deproteksi terhadap tBOC senyawa 4 dilakukan oleh pemberian TFA yang berlebih, yang hasilnya dilepaskan
oleh pemberian NaOH dan diperoleh hasil utama yaitu amina bebas hapten 5.

B. Karakterisasi Hapten Organomerkuri


Dalam jurnal ini tidak dipaparkan secara pasti bagaimana hasil dari karakterisasi
hapten organomerkuri yang dihasilkan. Hanya pada proses sintesis organomerkuri hapten
5, dikatakan bahwa analisis NMR dari senyawa 4 pada sintesis hapten 5 menunjukkan
adanya regioisomer pentanadiol yang dihasilkan dalam campuran produk.
Namun dalam jurnal pendukung yang kami gunakan, dikatakan bahwa pada
sintesis hapten 1, melalui data GC menunjukkan bahwa epoksida yang dihasilkan
merupakan produk yang murni.

C. Aplikasi Hapten Organomerkuri


Hapten organomerkuri yang telah dihasilkan, diaplikasikan dalam immunoassay
enzime-linked terhadap merkuri organik dan anorganik. Immunoassay adalah suatu
metode analisis yang menggunakan antibodi atau antigen sebagai pereaksi untuk
mengukur bahan kimia tertentu, atau analit. Immunoassay sangat akurat dan sensitif
terhadap tingkat konsentrasi yang sangat rendah dari analit.
Dalam jurnal ini, hapten 1 dikonjugasikan terhadap BSA (Bovine Serum Albumin)
melalui BS3 (bis[sulfosuccinimidyl]suberate) dan SMCC (Succinimidyl 4-[Nmaleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylate) sebagai reagen cross-linkingnya. Berikut
adalah prosesnya:

Gambar 3. Biokonjugasi hapten organomerkuri terhadap BSA melalui BS3 dan


SMCC sebagai reagen cross-linking
Dalam penelitian ini juga dibuat konjugat imonugen ayam IgG-hapten1 sebagai
kontrol dalam analisis.
Setelah diketahui bahwa hapten organomerkuri itu terikat kovalen dengan karier,
empat tikus diimunisasi dengan IgG ayamhapten1 dicampur dengan Imject Alum.
Antisera tikus discreening tanpa purifikasi setiap 2 minggu dimulai 12 minggu setelah
imunisasi awal. BSA diencerkan pada 10 mg/ml dalam PBS dan BSABS3 ditutup
dengan allylamine sebagai kontrol negatif dalam percobaan ini. Berdasarkan uji dengan
ELISA, dapat dikatakan bahwa karakter nonpeptida hidrofilik hapten, dikopling dalam
bentuk kaku dengan backbone siklopentana, menghasilkan antibodi menunjukkan derajat
sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Hapten 1 dianggap sebagai pilihan yang logis
untuk imunisasi karena ketersediaan merkuri tampaknya lebih menguntungkan untuk
memunculkan respon imun daripada hapten dengan struktur yang kurang kaku. Ini
adalah contoh pertama dari antibodi anti-merkuri yang diturunkan dari imunogen yang
dibuat secara kovalen dari hapten berbasis organomerkuri terhadap protein karier.
Beberapa modifikasi sintesis fase padat dieksplorasi untuk mengevaluasi
spesifisitas antibodi terhadap bentuk-bentuk organik dan anorganik merkuri dan untuk
menentukan korelasi antara struktur konjugat fasa padat dan sensitivitas uji logam.
Sebuah fase padat kedua konjugat disiapkan dengan kopling hapten 1 terhadap BSA via
SMCC. Kondisi pengkoplingan tidak dioptimalkan untuk memberi kerja awal dengan
BS3, melainkan menyarankan protokol kopling (Gambar 3).

Enam pengenceran antiserum ditambahkan ke plate dengan tiga replikasi, dan


dua konsentrasi antibodi HRP-label (80 dan 40ng/ml) digunakan untuk mengevaluasi
ikatan antibodi pada setiap fase padat (Gambar 4). Pada konsentrasi deteksi antibodi
yang lebih tinggi (80 ng/ml), dua kurva yang dihasilkan sangat mirip. Namun, konjugat
SMCC menunjukkan peningkatan jarak dinamis (25%) dibandingkan dengan konjugat
BS3 ketika konsentrasi antibodi deteksi HRP-label dikurangi menjadi 40ng/ml. Hasil ini
jelas menunjukkan bahwa antibodi secara spesifik terikat pada struktur hapten daripada
arm linker atau beberapa bagian dari hapten dan arm linker. Kiranya mudah untuk
memprediksi bahwa sensitivitas uji kemungkinan akan meningkat secara signifikan pada
optimalisasi kimia cross-coupling dan atau pemilihan agen cross-linking. SMCC dapat
memberi kesempatan yang lebih baik untuk ikatan antibodi dikarenakan jarak relatif
linker arm yang lebih panjang terhadap BS3 (1,97 vs 1,14 nm) dan/atau karena kekakuan
relatif SMCC yang lebih besar untuk BS3, akhirnya mengarah ke uji yang lebih peka.
Selain itu, kinerja immunoassay umumnya meningkat ketika linker arm di imunogen
yang secara struktural berbeda dari linker arm yang digunakan untuk menyiapkan
komponen uji. Karena struktur hapten sintetik meliputi amina, maka dapat segera
dikoplingkan ke berbagai pilihan reagen cross-linking untuk menghasilkan amida
linkage yang stabil antara hapten dan kariernya, memberi ikatan yang lebih tahan lama
dibandingkan dengan ikatan sulfur-merkuri yang digunakan dalam konjugat dengan
dasar Hg2+ sebelumnya.

Gambar 4. Respon ikatan antibodi anti-merkuri tikus pada konjugat fasa padat yang dibuat dari
kopling hapten 1 ke BSA melalui dua reagen cross-linking (BS3 vs SMCC). Kedua
konjugat fasa padat dilapisi 10g/ml. respon antibodi terhadap kedua konjugat fasa
padat diukur menggunakan 80 dan 40ng/ml peroksidase anti-mouse IgG.

Kemudian untuk hapten 5, dikonjugasikan terhadap BSA melalui SMCC untuk


mengevaluasi lebih lanjut selektivitas antibodi anti-merkuri. Berikut adalah prosesnya:

Gambar 5. Kopling hapten 5 terhadap BSA via SMCC


Antibodi anti-merkuri menunjukkan derajat ikatan tinggi pada kedua konjugat
fase padat (Gambar 6). Secara keseluruhan, ikatan antibodi dengan hapten 5 lebih tinggi
daripada dengan hapten 1. Rentang dinamis yang ditampilkan oleh kedua konjugat fase
padat meningkat ketika menggunakan konsentrasi antibodi deteksi rendah HRP label
(20 ng/ml) dibandingkan dengan 40 ng/ml. Sensitivitas tinggi antibodi terhadap hapten 5
relatif terhadap hapten 1 tampaknya sedikit mengejutkan, namun biokonjugat
BSASMCC tidak dianalisis dengan MALDI, yang mengungkapkan rasio
hapten/protein. Mungkin hapten 5 lebih efisien untuk BSA karena merupakan hapten
yang lebih polar dari hapten 1, memberi rasio hapten/protein yang lebih tinggi dari 8:1
dan permukaan fase padat yang lebih kompak dengan hapten.

Gambar 6. Respon antibodi terhadap hapten 1 dan 5. Kedua hapten


dikoplingkan ke BSA melalui SMCC dan dilapisi pada plate
microtiter 10g/ml. Respon antibodi terhadap kedua hapten
diukur dengan 40 dan 20 ng/ml peroksidase anti-mouse IgG.

Linker lengan panjang dan kepadatan epitop telah terbukti berdampak pada sensitivitas
antibodi. Hasil ini mendorong karena antibodi anti-merkuri yang dihasilkan
menampilkan kemampuan unik untuk mengikat berbagai konfigurasi fase padat,
memberikan tingkat fleksibilitas yang tinggi dalam format desain assay.

Gambar 7. Hasil uji persaingan inhibisi menggunakan plate yang dilapisi


dengan BSABS3hapten1 dan Hg(Oac)2, Hg(NO3)2, dan hapten 1
sebagai inhibitor.

Sebuah studi pendahuluan inhibisi kompetitif dilakukan menggunakan coated plate


dari BSABS3hapten 1. Antisera tikus diencerkan 1:10.000, 1:15.000, 1:20.000, dan
1:30.000 di PBS. Setiap pengenceran dipreinkubasi dengan merkuri asetat (Hg(OAc)2) pada
20 ppm, merkuri nitrat (Hg(NO3)2) pada 20 ppm , dan 10 ppm hapten 1 tak terkonjugasi
selama 1 jam pada suhu kamar sebelum menambahkan 50l masing-masing sampel ke plate
dalam dua replikasi. Setiap pengenceran serum juga diinkubasi pada kondisi yang sama
dengan tidak adanya inhibitor apapun. Ketika antibodi anti-merkuri fase padat berikatan
dihambat dengan Hg(OAc)2 dan Hg(NO3)2, sinyal rata-rata untuk semua sampel yang
diinhibisi setara dengan tingkat kontrol negatif (Gambar 5). Hapten 1 tidak memblokir
kemampuan ikatan fase padat antibodi seefisien garam merkuri. Mungkin hapten 1 tak
terkonjugasi kurang tersedia untuk ikatan antibodi karena ada fleksibilitas konformasi yang
lebih besar dan impedansi kurang sterik ketika larut dibandingkan dengan konformasi kaku
yang terjadi ketika konjugat haptenBSA diserap ke permukaan plate.
Immunoassays sangat kuat, tapi mudah digunakan, alat-alat analisis untuk mendeteksi
kontaminan lingkungan hadir dalam konsentrasi rendah. Penelitian ini memvalidasi strategi
untuk sintetis hapten berbasis organomerkuri unik dan dapat digunakan untuk
mengembangkan immunoassay yang sangat sensitif yang mampu mendeteksi kontaminasi
merkuri dalam berbagai kondisi lingkungan. Pendekatan dalam penelitian ini memanfaatkan
reaksi oxymerkurasi untuk mensintesis hapten organomerkuri yang stabil dan larut dalam air.
Fungsi hapten mudah membentuk ikatan kovalen dari bagian organomerkuri terhadap protein
karier. Penelitian ini telah membuat immunogen berbasis merkuri dengan metode dasar yang
sama, yaitu, koordinasi garam Hg2+ untuk kelat atau sulfur. Disini, antibodi yang dihasilkan
menunjukkan tingkat ikatan terhadap merkuri yang tinggi dalam berbagai format uji dan
mampu mengikat bentuk merkuri anorganik (Hg2+) dan organik.

BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
1.

Sintesis hapten organomerkuri dilakukan dengan reaksi oxymerkurasi yang hasilnya


dikonjugasikan ke protein, dengan tujuan menghasilkan antibodi yang mampu mengikat baik
logam Hg(II) maupun bentuk organologam merkuri di berbagai media sampel. Strategi secara
keseluruhan adalah dengan melakukan reaksi oxymerkurasi intramolekul untuk mensintesis
struktur sederhana, tapi kuat secara kimia, hapten organomerkuri yang mudah terikat kovalen
pada protein karier melalui amina yang ada, strategi yang cukup unik dibandingkan dengan
yang sebelumnya dijelaskan dalam metode khelasi.

2.

Sintesis hapten berbasis organomerkuri dapat digunakan untuk mengembangkan


immunoassay yang sangat sensitif yang mampu mendeteksi kontaminasi merkuri dalam
berbagai kondisi lingkungan

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.

2011.

Mengenal

Antibodi

dan

Antigen.

http://sistempertahanantubuh.blogspot.com/2011/04/mengenal-antibodi-dan-antigen. html. (Diakses pada 16 Desember 2013).


Anonim. 2013. What is ELISA? Enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA). http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction. (Diakses
pada 16 Desember 2013).
Fesenden, R.J. dan J. S. Fessenden. 1992. Kimia Organik Jilid 1 Edisi ke-3.
Terjemahan

Aloysius

Hadyana

Pudjaatmaka.

Jakarta:

Penerbit

Erlangga.
Prudente, Carry K. dan Margaret C. H.. 2003. Organomercury Bioconjugate Synthesis and
Characterization by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry.
Bioconjugates Chemistry 14: 1270-1278.
Sriwahyuni, Reni. 2012. Organomerkuri. http://kimia-reni.blogspot.com/2012/11/
organomerkuri.html. (Diakses pada 16 Desember 2013).
Yan, Li dan Zhe Ming Ni. 2002. Determination of Trace Mercury in Environmental and Food
Samples by Online Coupling of Flow Injection Displacement Sorption
Preconcentration to Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry. Environmental
Science & Technology, Vol. 36 (22): 4886-4891.

Anonim.2010.Antibodi dan Jenis Jenis Antibodi.Immune


system.wordpress.com/.../antibodi-dan-jenis-jenis-antibodi/ diakses 16 Desember
2013