Anda di halaman 1dari 15

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Materi Isolasi DNA

Nama

: Aninda Dwi Yanuar

NIM

: 135040200111146

Kelompok

: H1

Asisten

: Nur Syafaah

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI


FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014

BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA merupakan

hal

yang

penting

dalam

kehidupan. DNA adalah molekul utama yang mengkode


semua

informasi

yang

dibutuhkan

untuk

proses

metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3


komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen,
dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA
terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat
berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas
yang

menentukan

stuktur

protein

dan

proses

metabolisme lain. DNA dapat mengalami denaturasi dan


renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. DNA yang
diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh
polisakarida dan metabolit sekunder

seperti tannin,

pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan


isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi
dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan
karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan
pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan
dari ekstrak asam nukleat. Karena pentingnya isolasi
DNA ini, maka dilakukan praktikum tentang isolasi DNA
ini agar dapat lebih memahami tentang hal ini.

1.2 Tujuan
a. Untuk memahami pengertian isolasi DNA
b. Memahami macam-macam metode Isolasi
DNA
c. Mengetahui Tahap Isolasi DNA
d. Untuk mengetahui Manfaat Isolasi DNA
1.3 Manfaat
Berdasarkan latar belakang diatas, praktikum ini
memiliki manfaat agar dapat memahami lebih dalam
tentang isolasi DNA

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian isolasi DNA
Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil
akhirnya strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam
sel dalam bentuk kumpulan strand berwujud benangbenang putih. (Aditia, 2010)

DNA isolation is the most important step in


molecular biology analysis. Several DNA isolation
techniques which are developed were expensive.
(Listanto,1996)
Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam
analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang
telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan
waktu yang lama
2.2 Macam metode Isolasi DNA
Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle
(1990) dengan Nitrogen Cair.
a) Metode I.
Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus
dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung.
Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan
diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C,
kecepatan

150

rpm

selama

jam.

Selanjutnya

diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1)


sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5
menit.

Aliquot

yang

terdapat

pada

bagian

atas

dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan


isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian
diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet
dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g

selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii


(etanol 76% dan ammonium

asetat). Sentrifugasi

dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10 menit.


Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet yang telah
dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan
ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10
ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama 30
menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang
dihasilkan

diresuspensi

Proteinase

dengan molecular

ditambahkan

dengan

dua

water.
variasi

penambahan.
Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle
(1990) tanpa Nitrogen Cair.
b) Metode II.
Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus
dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB,
1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8),
0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan
dengan incubator shaker pada suhu 65C dengan 50
rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada
suhu ruang untuk proses cooling.Sampel ditambahkan
0.75

mL

kloroform:

isoamil

alkohol

(24:1)

dan

disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu


4oC. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru
dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin

kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali. Smapel


tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4oC. Pelet yang telah kering diberi 25 L molecular
water dan disimpan pada suhu -20C.
Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995).
c) Metode III.
Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan
ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5), 50
mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%)
sebanyak

400

dalam

mortar

dingin.

Sampel

ditambahkan 100 L buffer ekstraksi di dalam tabung


dingin dan ditambahkan 400 L kloroform kemudian
diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1
menit pada suhu 4oC. Lapisan atas yang terbentuk
ditambahkan 800 L etanol absolut dan diinkubasi pada
suhu -20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000
rpm selama 3 menit pada suhu 4oC. Endapan berupa
pellet DNAditambahkan 500 L Etanol 70% dan
disentrifugasi

kembali.

diresuspensi

dengan

Pellet
50

yang

telah

L molecular

kering

water dan

ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37oC


selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan
selama

menit.

Pellet

kering

ditambahkan

50

Lmolecular water. Suspensi tersebut disimpan pada


suhu -20oC.

Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk


mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik.
Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol
76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat
3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan
PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi
penambahan larutan pada tahap yang berbeda. (Utami,
2012)
2.3 Tahap Isolasi DNA
Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah
terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara
fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu.
Pemecahan

dengan

cara

fisik

misalnya

dengan

menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb


yang menghasilkan suara

ultra tinggi. Pemecahan

dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel


bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek
eukaryote.
Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah
dinding

sel.

dikombinasikan

Seringkali
dengan

penggunaan
perlakuan

enzim

fisik,

ini

misalnya

dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah.


Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel
untuk

isolasi

DNA adalah

Ammonium Bromide).

CTAB

(Cetyl

Trimetyl

Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi


dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen
DNA tertentu, DNA genom kemudian dipotong dengan
menggunakan enzin endonuclease restriksi, enzim ini
enzim yang dapat memotong molekul DNA di bagian
tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu akan
menghasilkan ujung-ujung DNA yang sama sesuai
dengan titik potong oleh enzim.
Selain dengan menggunkan enzin endonuclease
restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong secara
mekanis, misalnya menggunakan alat sonikator.Hasil
potongan dengan alat mekanis adalah molekul DNA
yang ujungnya tidak beraturan.(Yuwono,2006)
2.4 Manfaat Isolasi DNA (khususnya bagi pertanian)

BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan Fungsi
3.1.1 Alat
Mortar
: Untuk melembutkan bahan
praktikum
Pastle
: Untuk melembutkan bahan
praktikum
Erlenmayer : Wadah aquades
Cawan
: Sebagai wadah detergen.
Saringan
: Untuk menyaring bahan yang di
ek- straksi
Spatula
: Untuk mengaduk dan mengambil
bahan praktikum
Pisau
: Untuk memotong bahan agar lebih
kecil agar mempermudah dalam
menghalus- kannya.
Timbangan : Untuk menimbang bahan
praktikum
Tabung Reaksi: Untuk meletakkan bahan yang
sudah di haluskan dan untuk
mereaksikan bahan.
Gelas ukur
: untuk wadah pasta
3.1.2
Jagung

Bahan
: sebagai bahan praktikun yang akan

di amati
Kacang tanah : sebagai bahan praktikun yang akan
di amati

Aquades

: untuk melarutkan detergen dan


garam untu

Karbon

: menjaga agar sel tidak rusak pada


saat penggerusan

Nitrogen

: menjaga agar sel tidak rusak pada


saat penggerusan

Mercaptoethanol : untuk menghilangkan flafonoid dan


browning
PVP

: untuk menghilangkan fenol (alkohol)

Buffer TE

: untuk melarutkan DNA

Buffer Pencuci : untuk menghindari kontaminasi


CHISAM

: untuk menghilangkan flafonoid dan


browning

3.2 Langkah Kerja + dokumentasi


Campurkan Buffer ektraksi 1ml + Karbon+
Mercoptoethanol 4 L.
Timbang 0.1 g daun
Gerus dengan Mortar dan tambah nitrogen cair +
PVP

Masukkan ke dalam tube 1.5 ml


Vortex tube di inkubasi dalam oven 650C
(10 Menit) dinginkan sebentar

Sentrifuge,kecepatan 10.000 rpm (5 menit)

Ambil Supernata pindahkan ke tube (2ml) baru

Tambahkan 500 l chisam dan di vortex (5 detik) 2 x


ulangan

Sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm (5


menit) 2 x ulangan
Pindahkan supernatant ditambah 300 l
isopropanol dingin
Bolak balik tube secara perlahan dan diinkubasi
dalam frezer selama 15 menit
Sentrifuge 8000 rpm (5 menit)

Buang Supernatan + buffer pencuci 500 l dan d


vortex

Sentrifuge, 9000 rpm (5 menit)

Buang Supernatan dan keringkan selama 10


menit tambahkan buffer TE sebanyak 50 l
Larutkan Pellet DNA dan mengetube perlahan
3.3 Analisis Perlakuan
Mencampurkan Buffer eksitasi sebanyak 1 ml
kemudahan ditambah karbon ditambah mercaptoethanol
4 l. Timbang daun seberat 0,1 g dan menggerusnya
dengan mortar dan menambahkannya dengan nitrogen
cair+PVP. Setelah itu memasukkannya ke dalam tube
1,5 ml. kemudian vortex tube untuk mencampur larutan.
Setelah itu inkubasi dalam oven 650C selama 10 menit
dan didinginkan sebentar. Inkubasi berfungsi untuk
optimalisasi buffer ekstarksi. Setelah itu disentrifuge
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Setelah
selesai ambil supernatant dan pindahkan kedalam tube
baru sebanyak 2 ml. Tambahkan 500l chisam dan di
vortex selama 5detik serta kemudian masukkan dalam
sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5
menit. Lakukan kedua perlakuan tadi sebanyak 2 kali.
Setelah selesai pindahkan supernatant dan tambahkan
dengan isopropanol dingin 30

l .

Setelah itu bolak

balik tube secara perlahan dan inkubasikan dalam


freezer selama kurang lebih 15 menit. Kemudian
setrifuge kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 5
menit. Dan buang supernatant yang kemudian di tambah
buffer pencuci 500 l serta di vortex. Buffer pencuci ini
untuk menghindari kontaminasi. Kemudian sentrifuge
kembali dengan 9000 rpm (5 menit). Setelah itu buang
supernatan

dan

keringkan

selama

10

menit.

Ditambahkan Buffer TE sebanyak 50 l. Buffer TE untuk


melarutkan DNA. Langkah terakhir adalah melarutkan
pellet DNA dan menget tube perlahan.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1

Hasil

Dapat di lihat pada gambar di atas, DNA tidak terlihat.


4.2

Pembahasan

BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan
5.2 Kritik dan Saran
5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun
Depan
5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten

DAFTAR PUSTAKA
Minimal 2 buku dan 1 jurnal
Note:
-

Cover laporan berwarna biru


Laporan di print dengan kertas ukuran a5
Arial 11 spasi 1,15
Margin 3,2,2,2
Sertakan 1 jurnal pendukung (print A5 mewakili

isi laporan)
Cover warna biru