Anda di halaman 1dari 4

HPLC

1.

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan


perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
[1]
Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang
merupakan fase diam.[1] Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan
kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah.[2] Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat
dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.[2]

2. Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu
sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel
tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa
kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan
tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV,
fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil
yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang
biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC
tersebut.
Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang
puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon <
golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester <
golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.
3.

Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik,


anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ;
analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekulmolekul netral, ionik, maupun zwitter ion ; isolasi dan pemurnian senyawa;
pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan

senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah


banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak
dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun
kuantitatif.
4. jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun
demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada
silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH
sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami
ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk
spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya
air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.
4.Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran


Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat
fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi
terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah
molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak
melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian,
dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut
dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.
5. Persyaratan fase gerak
1. Harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan.
2. Harus murni sekali.
3. Harus jernih sekali.
4. Harus mudah diperoleh, murah tidak mudah terbakar dan tidak beracun.
5. Tidak kental
6. Sesuai dengan detektor

6. Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam
proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase
diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu
senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau
porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan
pada padatan pendukung.
Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat
bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa
bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai
sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil).

7. Ada di ppt
8.