Anda di halaman 1dari 6

Isolasi dan Analisis Protein Rekombinan -Galaktosidase

Febby Nurdiya Ningsih


Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
Febby Nurdiya : febbynurdiya@gmail.com

ABSTRAK
Seiring dengan meningkatnya kebutuhan masyarakat, berbagai teknologi sintetis terus
dikembangkan. Teknologi rekombinan merupakan salah satu kegiatan yang terus dilakukan dan
memberikan sumbangsih yang cukup besar. Produksi -Galaktosidase dapat dikembangkan melalui
teknologi rekombinan mengingat semakin maraknya kasus alergi terhadap laktosa. Kegiatan ini
dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui teknik isolasi dan analisis protein rekombinan Galaktosidase. Ada beberapa tahapan yang dilakukan, yakni rekombinasi gen, isolasi DNA plasmid,
PCR-RFLP, Induksi IPTG, Isolasi protein, SDS-PAGE dan Western Blot. Melalui kegiatan ini teknik
isolasi dan analisis protein rekombinan dapat dipahami. Didapatkan sejumlah informasi berupa
visualisasi gel elektroforesis, nilai kemurnian dan konsentrasi DNA, dan ketepatan protein yang
dihasilkan dari proses rekombinasi.
Kata kunci : -Galaktosidase, DNA rekombinan, PCR-RFLP, SDS-PAGE, Western Blot.
ABSTRACT
Along with the increasing needs of the community, a variety of synthetic technologies continue to be
developed. Recombinant technology is one of the activities that are continuously performed and provide
considerable contribution. Production of -Galactosidase can be developed through recombinant
technology given the increasingly of lactose intolerance cases. This activity is carried out with the purpose
to know the techniques of isolation and analysis of recombinant protein -Galactosidase. There are several
stages that are made, i.e. gene recombination, Plasmid DNA isolation, PCR-RFLP, IPTG Induction,
protein isolation, SDS-PAGE and Western Blot. Through this activity, isolation technique and analysis of
recombinant proteins can be understood. It brings a number of information like visualization of gel
electrophoresis, purity values of DNA and concentration, and precision of the protein produced from the
recombination process.
Key words : -Galactosidase, DNA recombinant, PCR-RFLP, SDS-PAGE, Western Blot.

PENDAHULUAN
Di era yang sudah serba maju ini,
teknologi rekombinan sering sekali dilakukan
dalam rangka memenuhi kebutuhan masyarakat
yang semakin beraneka ragam. Teknologi
Rekombinan tidak pernah lepas dari prinsip dan
teknik analisis biologi molekuler. Salah satu
rekayasa yang biasa digunakan adalah protein
rekombinan. Protein rekombinan merupakan
produk yang seringkali dibutuhkan dalam
aktivitas research dan dunia farmasi. Protein
yang dihasilkan dapat digunakan untuk
memodifikasi organisme, untuk mengukur
aktivitas enzimatik, untuk produksi antibodi dan
obat-obatan serta sintesis zat aditif [4]

-Galaktosidase merupakan protein yang


berperan dalam proses pemecahan laktosa
menjadu glukosa dan galaktosa. Tidak semua
organisme memiliki gen yang dapat mengkode
protein ini [5]. Mengingat banyak sekali
ditemukan kasus alergi terhadap susu sapi,
sintesis protein ini menjadi menarik untuk
dikembangkan lebih lanjut [3] Melalui teknologi
gen rekombinan, produksi -Galaktosidase dapat
ditingkatkan dan dikembangkan sebagai produk
komersil. Eschericia coli merupakan organisme
yang sering sekali digunakan dalam dunia
farmasi dan penelitian, misalnya dalam produksi
insulin.
Kegiatan kali ini mengusung topik protein
rekombinan dengan menggunakan gen pengkode
-Galaktosidase yang direkombinan dalam

vektor yang kemudian diperbanyak melalui


E.coli. Kegiatan ini bertujuan untuk mengetahui
teknik isolasi dan analisis protein rekombinan Galaktosidase. Melalui kegiatan ini diharapkan
dapat menjadi awal yang baik bagi
perkembangan ilmu pengetahuan dan dapat
diaplikasikan untuk mendongkrak kesejahteraan
kesehatan dan perekonomian.
METODE
Rekombinasi Gen. Kultur isolat E.coli
yang
telah
diremajakan
sebelumnya,
diinokulasikan ke dalam 5 ml medium cair LB.
Isolat diinkunbasi selama 37oC dalam shaker
semalaman sehingga didapatkan pre-kultur.
Sebanyak 2 mL pre-kultur dituangkan dalam 100
mL medium LB dan diinkubasi kembali dalam
shaker kecepatan 240 rpm dan suhu 37oC
semalaman. Setelah semalaman, sel dipanen
dengan sentrifus pada kecepatan 1700 g selama 5
menit, supernatan dibuang. Pellet yang
merupakan sel, diresuspensi dalam 50L CaCl2
50 mM dan diinkubasi selama 15-30 menit
dalam kotak es. Disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 1700g selama 5 menit. Supernatan
dibuang dan pellet diresuspensi kembali dalam
larutan CaCl2 dan ditambahkan 15% gliserin.
Diinkubasi selama 15-30 menit dalam kotak es
hingga diperoleh sel kompeten dalam fase cair.
Sel kompeten ini kemudian ditransformasi
dengan mencampurkan Mix 1L pET 14b ke
dalam 50 L sel kompeten dan diinkubasi selama
20 menit dalam kotak es. Setelah itu diinkubasi
kembali selama 90 detik dengan suhu 42oC. Sel
yang telah ditransformasi diberi LB sebanyak
1mL dan diinkubasi dalam suhu 37oC selama 30
menit. Kemudian disentrifus 1700g selama 3
menit, supernatan dibuang. Kemudian pellet
dispreader ke medium agar LB yang sudah diberi
ampicillin dan diinkubasi semalaman dengan
suhu 37oC.
Isolasi DNA Plasmid. Koloni tunggal
yang tumbuh diinokulasikan ke medium agar LB
yang sudah diberi ampicilllin dan dikultur dalam
media cair LB. Kultur yang tumbuh diambil
sebanyak 1,5 mL kemudian disentrifus dengan
kecepatan 10.000 rpm, 5 menit, 4oC. Supernatan
dibuang dan diresuspensi dengan 100 L Larutan
I dingin, divortex 5 menit. Ditambahkan 200 L
Larutan II dan digoyangkan perlahan agar
bercampur sebanyak 2-5 kali. Diinkubasi pada
suhu ruang 2-3 menit kemudian ditambahkan
150 L Larutan III, divortex lalu disimpan dalam

kotak es selama 3-5 menit. Disentrifugasi dengan


kecepatan 10.000 rpm, 5 menit, 4oC. Supernatan
diambil dan ditambahkan fenol volume 1x, lalu
divortex
5
menit.
Campuran
tersebut
disentrifugasi lagi dengan kecepatan 10.000 rpm,
5 menit, 27oC. Supernatan yang didapat
ditambah dengan EtOH absolut volume 2x dan
dicampurkan dengan cepat 2-3 kali lalu disimpan
dalam es 3-5 menit. Disentrifugasi kembali
10.000 rpm, 5 menit, 4oC. Pellet yang didapatkan
ditambah dengan 500 L EtOH 70%,
dicampurkan dengan sempurna. Kemudian
disentrifugasi kembali 10.000 rpm, 5 menit, 4oC.
Penambahan EtOH dan sentrifugasi diulang
sebanyak 2-3 kali. Pellet yang didapatkan
dikering
anginkan
selama
10
menit.
Ditambahkan sebanyak 50 L TE buffer (pH7,6)
dan disimpan dalam suhu -20oC hingga
digunakan.
Uji kualitatif dilakukan melalui proses gel
elektroforesis. Proses Gel Elektroforesis
dilakukan dengan menyiapkan gel agarosa
sebanyak 0,3 gr yang dilarutkan dalam 30 mL
TBE kemudian dididihkan dalam microwave.
Gel yang mendidih di campur dengan 1 L EtBr.
Kemudian dituang ke dalam well yang berisi
sisiran. Gel yang sudah mengeras dipindah ke
dalam bak berisi larutan TBE 1x. Sebanyak 3 L
sampel DNA ditambah dengan 1 L loading dye
kemudian dipipet hingga bercampur. Sampel
yang sudah tercampur merata dipipet ke masingmasing sumuran. Sebanyak 2 L marker
ditambahkan ke sumuran. Gel dirunning dengan
100V selama 20 menit.
Uji kuantitatif dilakukan dengan analisis
nanodrop
Spektrofotometri.
Nanodrop
Spektrofotometri dikalibrasi dengan TE buffer.
Masing-masing sampel diteteskan sebanyak 3-5
L ke dalam tiap mikroplate. Kemudian diukur
nilai absorbansi.
PCR-RFLP. Sampel yang sudah tersisipi
gen -Galaktosidase diperbanyak sehingga
didapatkan sampel gen dalam jumlah banyak.
Satu PCR tube berisi 6 L ddH2O, 10 L PCR
mix (dNTP, Mg2+, Taq polymerase, buffer), 1 L
Primer 1, 1 L Primer 2, 1 L Primer 3dan 1 L
DNA plasmid. Sebanyak 9 tube yang telah berisi
konten tersebut dicampur dengan perlahan dan
dilabel. Seluruh tube diruning dalam mesin PCR
dengan pengaturan jumlah siklus dan suhu yang
sudah ditentukan.
Sebanyak 5 L larutan pendegradasi
dimasukkan ke dalam microtube baru. Kemudian
masih dalam microtube yang sama ditambahkan

30
L
H2O.
Digoyangkan
perlahan.
Ditambahkan 5 L sampel DNA hasil PCR.
Digoyangkan perlahan agar bercampur. Kembali
ditambahkan dengan 1 L enzim restriksi
BamH1. Mikrotube berisi campuran larutan
tersebut diinkubasi dalam suhu 37oC selama 1
jam untuk memaksimalkan aktivitas pemotongan
sequence oleh enzim restriksi. Setelah 1 jam,
diinkubasi pada suhu 70oC selama 15 menit
untuk menghentikan aktivitas enzim restriksi.
Sampel dan marker kemudian di running dengan
gel elektroforesis.

Mercaptoethanol, 10% SDS). Campuran tersebut


didihkan dengan waterbath bersuhu 100oC
selama 5 menit. Kemudian tube dipindahkan ke
dalam kotak es. Ditambahkan sukrosa dan
gliserol. Sebanyak 10 L sampel dipipet ke
dalam well. Sebanyak 5 L marker ditambahkan
ke dalam well lainnya. Sampel dan marker
dirunning bersamaan dengan tegangan 200 volt
selama 1 jam. Setelah selesai running, gel
diangkat. Bagian stacking gel dipotong dan
separating gel direndam dalam commasie blue.
Divisualisasi dengan UV transilluminator.

Induksi IPTG. Sebanyak 65 ml medium


LB dan 50 L/ml ampicilin dicampurkan sebagai
stok. Kemudian sebanyak 60 ml dari medium
tersebut ditambah dengan 1 ml sel kultur dan
diinkubasi pada suhu 37oC hingga memiliki
OD595= 0,6. Kultur tersebut diberi dua perlakuan
yang berbeda. Perlakuan pertama sebanya 20 mL
kultur disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 10 menit dan pellet dibekukan dengan
suhu -20oC. Perlakuan kedua, 40 ml sel kultur
ditambah dengan 16 L (1M) IPTG hingga
konsentrasinya sebesar 0,4 mM. Diinkubasi
dalam shaker selama 3 jam dengan suhu 37oC.
Sebanyak 40 mL kultur disentrifugasi 10.000
rpm selama 10 menit dan pellet disimpan pada
suhu -20oC. Perlakuan pertama sebagai kontrol
dan kedua sebagai perlakuan positif koloni,
masing-masing disentrifus dengan kecepatan
15000 rpm selama 3 menit, supernatan dibuang.
Pellet ditambah dengan CelLytic B plus working
solution dan divortex selama 10 menit.
Disentrifus kembali 1900 rpm selama 15 menit
dan supernatan dipisahkan dari pellet (supernatan
diambil).

Western Blot. Sampel protein dirunning


SDS PAGE kembali namun tanpa diwarnai
dengan divisualisasi. Gel yang mengandung band
diinkubasi selamat beberapa menit dengan wetblot buffer (Tris+glisin+methanol+akuades).
Selama perendaman, sebanyak 15 kertas saring
whatmann direndam dengan wet blot buffer dan
PVDF membran di dalam methanol 70%. Gel,
membran dan kertas saring disusun menjadi
sandwich dengan urutan dari bawah ke atas 9
kertas whatman, membran PVDF, gel acrilamide
dan 6 kertas whatman. Setelah sandwich
tersusun, dirunning dalam mesin western blot.
Plat katoda menutup di bagian atas dan diseting
tegangan 0,16V dan 0,35A selama 1 jam. Setelah
proses running selesai, membran PVDF dipindah
ke dalam kontainer dan dituangi PBST beserta
skim milk 5% pada bagian atas membran.
Diinkubasi selama 30 menit dalam shaker.
Setelah itu dicuci dengan PBST sebanyak 3 kali,
masing-masing 10 menit. Ditambahkan antibodi
primer yakni Rat antiHisTag dan diinkubasi
semalaman dengan suhu ruang. Setelah
semalaman dicuci dengan PBST 3x masingmasing selama 10 menit dan dishaker.
Ditambahkan antibodi sekunder yakni goat
antirat IgG dan diikunbasi selama 1 jam. Dicuci
dengan PBST 3x masing-masing 10 menit.
Setelah itu distaining dengan enzim AP (Alkaline
Phosphatase) sebanyak 1 mL dalam ruang gelap
selama 30 menit. Dicuci dengan akuades
kemudian
divisualisasi
dengan
LAS
(Luminescent Image Analyzer).

SDS PAGE. Vertical Gel elektroforesis


disiapkan. Separating gel 12,5% yang digunakan
mengandung 30% acrylamide (3125 L), 1M
Tris pH 8,8 (2750 L), ddH2O (1505 L), 10%
SDS (7 L), 10% APS (75 L) dan TEMED
(6250 L). Sedangkan untuk stacking gel 3%
terdiri dari 30% acrylamide (450 L), 1M Tris
pH 6,8 (680 L), ddH2O (2110 L), 10% SDS
(30 L), 10% APS (30 L) dan TEMED (5 L).
Setelah separating dan stacking gel siap,
sebanyak 530% acrylamide (3125 L), 1M Tris
pH 8,8 (2750 L), ddH2O (1505 L), 10% SDS
(7 L), 10% APS (75 L) dan TEMED (6250
L). Sampel protein (supernatan hasil induksi
IPTG) sebanyak 5 L dipipet ke dalam
mikrotube dan ditambah dengan 5 L RSB atau
Reducing Sample Buffer (Bromophenol, -

HASIL DAN PEMBAHASAN


Gen yang telah ditransformasi diuji
keberadaan gen rekombinannya melalui uji
kualitatif dan uji kuantitatif. Uji kualitatif yang
dilakukan kali ini melalui running Gel
Elektroforesis. Sedangkan uji kuantitatif
menggunakan
metode
nanodrop

Spektrofotometri [1]. Melalui uji kualitatif


didapatkan hasil visual berupa pita DNA seperti
pada Gambar 1.

Gambar 1. Hasil Visualisasi dari Gel Elektroforesis

tersebut menentukan nilai absorbansi DNA,


sedangkan 280 menentukan kemurnian DNA
tersebut [1]
Analisis PCR-RFLP kali ini dilakukan
untuk memperbanyak DNA plasmid sehingga
dapat digunakan untuk analisis lainnya serta
memastikan arah insersi DNA plasmid benar [2].
Namun setelah dilakukan konfirmasi terhadap
hasil PCR-RFLP melalui gel elektroforesis, tidak
didapatkan pita pada semua sampel (Lihat
Gambar 2). Ada kemungkinan bahwa sampel
yang dirunning terlalu sedikit, atau dikarenakan
DNA yang diisolasi tidak murni. Smear yang ada
pada pita diduga akibat adanya kontaminasi
protein. Ada dugaan lain bahwa yang terisolasi
bukanlah DNA plasmid melainkan whole
genome sehingga tidak dapat diamplifikasi serta
tidak tampak di pita.

Pada gambar tersebut diketahui bahwa dari


kedelapan sampel yang dirunning, semuanya
menunjukkan pita DNA yang diperkirakan
memiliki panjang 3000 bp. Untuk plasmid Empty
sebesar 47671 bp dan Wrong 7752 bp. Pada
gambar tersebut tampak smear pada masingmasing sampel. Smear tersebut disebabkan oleh
adanya kontaminasi RNA dalam proses isolasi
DNA plamid [2].
Hasil uji kuantitatif melalui nanodrop
spektrofotometri memberikan nilai absorbansi
pada A260/A280 dan A260/A230. Nilai tersebut
kemudian menjadi dasar penentuan konsentrasi
DNA (Lihat Tabel 1).
Tabel 1. Nilai Absorbansi dan Konsentrasi DNA
Sample A260/A280 A260/A230
DNA
concentration
(ng/L)
E1A
1.443
1.883
761
E1B
1.470
715
2.161
E2A
1.431
709
2.087
E2B
1.678
665
2.081
W1A
5.291
1015
1.917
W1B
6.746
1097
1.948
W2A
14.5
811
1.920
W2B
1.746
10.7
750

Beberapa sampel dengan nilai absorbansi


pada A260/A280 sebesar 1,917; 1,948; 1,920
memiliki kemurnian yang tinggi. Sedangkan
sampe lainnya diduga kuat mengalami
kontaminasi protein karena nilai absorbansinya
kurang dari 1,8 [5]. Setelah dikalkulasi, sampel
W1B memiliki konsentrasi DNA yang paling
tinggi dan paling murni juga, yakni sebesar 1097
(ng/L). Pengukuran nilai absorbansi dilakukan
pada panjang gelombang 260 karena nilai

B
Gambar 2. A) Visualisasi gel elektroforesis hasil
PCR. B) RFLP

Setelah dilakukan berbagai analisis dan uji


konfirmasi keberhasilan insersi gen, dilakukan
induksi IPTG sebagai penunjang terjadinya
ekspresi protein yang diinginkan. IPTG bekerja
langsung untuk melepaskan Lac represor
sehingga Lac operon dapat memulai proses
transkripsi [1]. Proses transkripsi ini akan

menghasilkan ekspresi gen berupa sintesis


protein yang diinginkan, yakni Beta galaktosa.
Protein tersebut kemudian diisolasi dan dianalisis
lebih lanjut melalui metode SDS-PAGE dan
Western Blotting. Pada kesempatan ini, secara
teknis protein -Galaktosidase tidak berhasil
diisolasi karena faktor kesalahan bekerja
sehingga digunakan protein Beta Actin dari
ovarium kambing untuk dianalisis lebih lanjut.

terdeteksi oleh antibodi diperkirakan memiliki


ukuran berkisar 120 kDa. Ukuran tersebut
merujuk pada kesimpulan bahwa protein yang
terdeteksi merupakan -Galaktosidase. Proses
deteksi atau probing ini menggunakan sistem
indirect, dimana digunakan 2 antibodi yakni
antibodi primer dan antibodi sekunder. Antibodi
primer ini akan mengenali protein target,
sedangkan antibodi sekunder akan mengenali
antibodi primer dan terlabel dengan enzim
Alkaline Phosphatase.
KESIMPULAN

Gambar 3. Hasil running SDS-PAGE

Melalui SDS-PAGE, protein dapat


terseparasi sesuai dengan berat molekulnya. Pada
Gambar 3, diketahui bahwa pita hanya terlihat
pada sampel 3,4 dan 5. Pita tersebut memiliki
ukuran 116 kDa. Sedangkan menurut literatur, Galaktosidase ditunjukkan oleh pite yang
berukuran 120 kDa. Setelah analisis SDS-PAGE,
dilakukan analisis Western Blotting. Western
Blotting atau Imunnoblotting merupakan metode
untuk mengkonfirmasi sekaligus mendeteksi
protein rekombinan yang terisolasi. Tingkat
ekspresi dari protein tersebut juga dapat
diketahui melalui ekspresi pita setelah
pewarnaan dengan Coomassie blue. Keberadaan
protein rekombinan akan terdeteksi secara
imunologis melalui ikatan spesifik epitopantibodi. Hasil visualisasi western blot yang
dilakukan tidak memberikan data apapun.
Sehingga untuk kebutuhan analisis dan
pembahasan digunakan hasil pada Gambar 4.

Gambar 4. Visualisasi hasil Western blot


(Practise result, 2011; Abcam plc, 2015)

Gambar 4 menunjukkan bahwa protein


yang terisolasi dan ditransfer ke membran serta

Teknik isolasi dan analisis protein


rekombinan -Galaktosidase dapat dilakukan
dengan beberapa tahapan yakni Rekombinasi gen
dan isolasi plasmid, PCR-RFLP, SDS-PAGE dan
Western Blot. Untuk mengetahui kebehasilan
isolasi dapat dilakukan uji kualitatif dan uji
kuantitatif. Melalui serangkaian tahapan tersebut,
didapatkan hasil visualisasi gel elektroforesis
berupa pita, kemurnian dan konsentrasi DNA
serta ketepatan protein yang dihasilkan dari
rekombinasi.
UCAPAN TERIMA KASIH

Keberhasilan kegiatan ini tidak terlepas


dari bantuan dan bimbingan Tim Dosen dan Tim
Asisten praktikum Teknik Analisis Biologi
Molekuler beserta Laboran Laboratorium Biologi
Molekuler
Jurusan
Biologi,
Universitas
Brawijaya.
DAFTAR PUSTAKA
[1] Alberts B, Johnson A., Lewis J, Raff M,
Roberts K, Walter P. 2002. Molecular
Biology of The Cell, 4thEdition. Garland
Science. USA.
[2] Fatchiyah, Estri, LA., S. Widyarti., S.
Rahayu. 2011. Biologi Molekular : Prinsip
Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta.
[3] NHSChoice. 2014. Lactose Intolerance.
http://www.nhs.uk/conditions/Lactoseintolerance/Pages/Introduction.aspx.
Diakses pada 20 Mei 2015.
[4] Prospecbio. 2015. Recombinat Protein.
http://www.prospecbio.com/Recombinant_P
roteins/. Diakses pada 20 Mei 2015.
[5] Wilson, K and J. Walker. 2004. Principles
and Techniques of Practical Biochemistry.
4th Edition. Cambridge University Press.
Cambridge