Anda di halaman 1dari 20

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

ISOLASI DNA KROMOSOM DAN DNA PLASMID

Disusun oleh :
Kelompok B-3

Raras Puspa W
Nindi Di Pamela
Monica Santoso
Dini Syarifah

132210101096

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER


2015

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Tujuan
Mahasiswa mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan
pET ads dari bakteri Escherichia coli
Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosom bakteri
1.2 Teori Dasar
1.2.1 Isolasi DNA kromosom
DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosom dan DNA
ekstrakromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. DNA
kromosom memiliki ukuran yang besar (>0,5 Mb) dibandingkan dengan DNA
plasmid ( 2 kb). Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi
(DNA di mana informasi genetik dalam sel disimpan, sekuens DNA yang
terletak pada kromosom disebut DNA kromosomal. Kata kromosom berasal
dari kata khroma yang berarti warna dan soma yang berarti badan kromosom
terdiri atas dua bagian, yaitu sentromer ; kinekthor yang merupakan pusat
kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom yang mengandung
kromonema dan gen berjumlah dua pasang).
Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap
perusakan dan pembuanagn dinding sel, lsiis sel, pembuangan remukan sel,
serta pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain
dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya
digunakan triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan
remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA
masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse.
Isolasi DNA kromosom memiliki prinsip, Prinsipnya adalah
memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel
lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.
Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan
isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang
berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk

mendegradasi RNA), sehingga menyisakan adalah DNA. Selanjutnya ekstrak


tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang
mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan
etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air. Secara umum, prosedur preparasi
DNA dari biakan sel bakteri dapat dibagi dalam empat tahap:
1. Biakan bakteri ditumbuhkan dan kemudian dipanen
2. Sel dipecah untuk melepaskan isinya
3. Ekstrak sel diperlakukan untuk menghilangkan semua komponen
kecuali DNA
4. Larutan DNA dimurnikan
1.2.2 Isolasi DNA plasmid
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di
dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid
banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam
penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak
berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di
dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid
banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam
penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak
berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat
digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah :
a.
plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya
b.

lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi


DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama

c.

diisolasi secara kimia


mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat

d.

memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi;


jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di
dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah
diamplifikasi;

e.

mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap


antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi
plasmid yang membawa gen tertentu. (Brock, et al., 1994).
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar

kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen


yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi
pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali
menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam
rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa
gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut
selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin,
interferon, dan berbagai enzim Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Campbell 2002).
Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat
digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid
mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah
diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA
akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori
(origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di
dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak
(multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan
membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi,
yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan
dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan,
yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA

plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk


memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam
jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri
tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas
lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan
membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga
terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia
lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti
lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat).
Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat
magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun
mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.
Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk
merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel
yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan
cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA
dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol
(mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan
protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan,
memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

BAB II
METODOLOGI PENELITIAN
2. 1 Alat dan Bahan
2.1.1

Isolasi DNA Plasmid


2.1.1.1 Alat
Inkubator goyang 37oC
UV transilluminator
Mikropipet
Ose bulat

Sentrifus
Tabung eppendorf 1,5 ml
Tip biru (1 ml)
Tip kuning (100 l)

2.1.2
-

Tip putih (10 l)

2.1.1.2 Bahan
Bakteri Eschericia coli PET 30b
Medium Luria Bertani
Antibiotik Kanamisin
Solution I (150 mM glukosa, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH
8)
Solution II (0,2 N NaOH, 1% SDS [dibuat baru])
Solution III (60 mL 5 M Potasium asetat, 11,5 mL Asam Asetat
Glasial, 28,5 mL Aquadest)
PCI (Phenol Chloroform Isoamilalkohol)
Buffer TE
Etanol pa
Natrium Asetat
Isolasi DNA Kromosom
2.1.2.1 Alat
Sentrifuga
Vortex
Inkubator goyang
Pemanas air
Freezer
Tabung reaksi
Lampu Bunsen

Mikropipet
Tip
Eppendorf 1,5 ml
Cawan petri
Sengkelit
Erlenmeyer

2.1.2.2 Bahan
Bakteri Eschericia coli
Medium LB cair
PBS (Phospat Buffer Saline)

2.2 Cara Kerja

Aquabidest steril

- 2.2.1 Isolasi DNA Plasmid


-

2.2.1.1 Pembiakan dan Pemanenan Bakteri

Media LB cair yang sudah steril diberi antibiotik Kanamisin (konsentrasi akhir 25
g/ml).

Koloni tunggal bakteri E.Coli pET 30b diambil menggunakan jarum ose dari media
LB padat dalam petridish dan dibiakkan dalam 5 ml media LB cair yang sudah diberi
Kanamisin. Kemudian diinkubasi selama 18 jam suhu 37oC dalam inkubator goyang
dengan kecepatan 120 rpm.

Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan kedalam 3 tabung eppendorf 1,5 ml, lalu
disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12000 rpm, supernatan dibuang
dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik.

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk
mendapatkan pelet sel bakteri.

2.2.1.2 Isolasi plasmid

Pelet sel diresuspensi dengan 100 l solution I dengan cara memipet naik turun
beberapa kali hingga benar-benar tersuspensi lalu divortex.

Ditambahkan solution II (dibuat baru) sebanyak 200 l. Solution II dibuat dengan


memipet NaOH 20 l, SDS 100 l dan aquadest 880 l. Dihomogenkan dengan cara
tabung eppendorf dibolak-balikkan secara perlahan sebanyak 6-8 kali, kemudian
didiamkan selama 5 menit didalam box berisi es hingga lisat jernih. Tidak boleh
divortex.

Ditambahkan solution III sebanyak 150 l. Dihomogenkan dengan cara tabung


eppendorf dibolak-balikkan secara perlahan sebanyak 6-8 kali, kemudian didiamkan
selama 5 menit didalam box berisi es hingga lisat jernih. Tidak boleh divortex.

Campuran disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12000 rpm suhu 4 oC.
Diulangi sentrifugasi jika supernatan tidak jernih.

Supernatan dipindahkan kedalam tabung eppendorf baru, dilakukan dengan hati-hati


agar tidak ada endapan terikut.

-
Ditambahkan PCI sama banyak dengan volume supernatan (350 l), kemudian
divortex selama 3 menit dan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 12000
rpm.

Lapisan atas diambil (150 l) dan dimasukkan pada tabung eppendorf baru. Lalu
ditambahkan etanol pa dan Natrium asetat dengan perbandingan 2,5:0,1 (yaitu
875l:35l) dari volume supernatan.

-
Didiamkan dalam freezer (-20oC) selama 1 jam untuk mempresipitasi/mengendapakan
plasmid.

Setelah 1 jam presipitasi plasmid, eppendorf disentrifugasi selama 10 menit pada


kecepatan 12000 rpm suhu 4oC.

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% lalu disentrifugasi lagi
selama 5 menit pada kecepatan 12000 rpm suhu 4oC.

Pelet dikeringkan dengan divakum, kemudian diresuspensi dalam 20 l buffer TE dan


disimpan pada suhu 4oC untuk analisis selanjutnnya.

- 2.2.2 Isolasi DNA Kromosom


Koloni tunggal bakteri E.Coli diambil dari media LB padat dalam petridish dan
dibiakkan dalam 5 ml media LB cair dan diinkubasi selama 18 jam suhu 37oC dalam
inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm.

Sebanyak 1 ml biakan bakteri dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1,5 ml, lalu
disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm, supernatan dibuang
dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik.

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 3 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk
mendapatkan pelet sel bakteri.

Pelet sel yang diperoleh dicuci dengan 1 ml PBS steril kemudian disentrifugasi selama
5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Pencucian pelet sel dilakukan 3 kali.

Pelet sel yang diperoleh disimpan pada suhu -20oC selama 24 jam untuk ekstraksi
DNA genom.

DNA kromosom diekstraksi dengan mendidihkan pelet beku selama 4 menit,


kemudian dilarutkan dengan 50 l aquabidest steril dan diresuspensi dengan cara
mikropipet dan vortex.

Suspensi tersebut disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 13000 rpm suhu 4 oC.
Supernatan yang diperoleh dipindahkan dalam tabung eppendorf yang baru.

Supernatan tersebut mengandung DNA kromosom dan disimpan -20oC hingga


digunakan untuk analisis selanjutnya.

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Cara Kerja Deskritive Isolasi DNA Plasmid dan Kromosom Bakteri
-

Pertama , Media LB cair yang telah steril diberi antibiotik kanamisin .


selanjutnya mengambil biakan bakteri E.coli didalam petri disk dengan
menggunakan jarum ose . kemudian , media LB cair yang sudah diberi

biakan bakteri diletakkan pada shaker inkubator dengan kecepatan 120


rpm selama 18 jam .
-

Kedua , Biakan bakteri yang diletakan dalam shaker inkubator


selanjutnya dikeluarkan dan diambil 1,5 ml biakan bakteri dari Media
LB cair , kemudian dimasukkan kedalam tabung effendorf 1,5 ml lalu
disentrifugasi selama 2 menit denga kecepatan 12000 rpm , dan akan
didapatkan pelet . pada praktikum kali ini didapatkan 3 pelet dari 3
effendorf , kemudian ketiga pelet ini digabungkan dalam satu effendorf
dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12000 rpm .
setelah itu supernatan dibuang dengan cara membalikkan tabung dan
diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik .

Kemudian pelet ditambahkan dengan solution I sebanyak 100 l dan


diresuspensi dengan cara memipet naik turun campuran pelet dengan
solution I dengan menggunakan mikropipet selanjutnya di vortex.
Solution I ini berfungsi untuk meresuspensikan pelet sel bakteri setelah
pemanena menggunakan sentrifus EDTA . selanjutnya ditambah
solution II yang berfungsi untuk melisiskan sel dengan melarutkan
membran sel dan mendenaturasi DNA kromosom namun tidak
mendenaturasi DNA plasmid . sebelumnya solution II yang digunakan
harus fresh . cara membuat solution II yaitu memipet NaOH 20 l
ditambah dengan SDS 100 l dan aquadest sebanyak 880l . Tabung
effendorf yang telah diberi solution II tadi dibolak balik agar campuran
nya homogen , kemudian dimasukkan kedalam ice box selama 5 menit
maka akan terbentuk suatu lendir yang mengindikasikan bahwa
dinding sel dari bakteri E.coli telah lisis .

Selanjutnya ditambahkan Solution III sebanyak 150 l , seperti


sebelumnya yaitu dihomogenkan dengan cara membolak-balikan tabun
effendorf secara pelahan dan dimasukkan kembali kedalam ice box
selama 5 menit . setelah itu campuran disentrifugasi selama 5 menit

dengan kecepatan 12000 rpm dengan suhu 4oC . Solution III berfungsi
untuk menetralisir PH , menghentikan denaturasi DNA kromosom
sehingga terbentuk presitipasi DNA kromosom yang menembus debris
seluler dan memisahkan DNA plasmid yang larut didalam supernatan .
Setelah 5 menit , tabung effendorf diambil dan supernatan yang
dihasilkan diambil ( NB: jangan ada endapan yang terbawa ) . Volume
supernatan yang kelompok kami dapat yaitu 350 l dan selanjutnya
supernatan tersebut ditambahkan dengan menggunakan PCl 350 l ,
kemudian di sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000
rpm . pada tabung effendorf yang terbentuk akan terbentuk 2 lapisan ,
lapisan bagian atas diambil dengan volume 350 l dimasukkan dalam
tabung effendorfbaru dan ditambah dengan etanol 875 l dan
ditambahkan dengan Na-asetat 35l . setelah itu dimasukkan kedalam
freezer suhu -20oC selama 1 jam ,tujuannya yaitu untuk memperipitasi
plasmid , Setelah 1 jam , disentrifus kembali selama 10 menit dengan
kecepatan 12000 rpm . selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang
dan dimbil peletnya saja . Selanjutnya pelet dicuci dengan etanol 70%
1 ml . selanjutnya pelet disentifugrasi selam 5 menit dengan kecepatan
12000 rpmpada suhu 4oC . kemudian etanol dibuang , ditutup
menggunakan parafilm yang dilubangi dan di vakum Selama 10
menit .selanjutnya parafin ditambahkan dengan buffer TE sebanyak
20l lalu disimpan didalam kulkas dengan suhu 4oC .
-

Sedangkan cara kerja isolasi DNA kromosom adalah Cara kerja


deskritive isolasi DNA Kromosom seperti berikut, langkah pertama
yang dilakukan yaitu penanaman bakteri dengan cara mengambil
media LB cair dan ditambahkan antibiotik kanamisin 0,6 g dari
konsentrasi 25 g/ml .kemudiaan dihomogenkan. selanjutnya E.coli
ditanam sebanyak 2.05 secara aseptis didalam laminar air flow lalu
dihomogenkan kembali dan diletakkan dalam shaker inkubator dengan
posisi miring selama 18 jam pada suhu 37 oC dengan kecepatan 120

rpm . dilakukan pemiringan pada shaker inkubator ini bertujuan untuk


memperluas daerah aeresi sehingga kadar oksigen pada media LB
tinggi dan mikroba yang ditanam dapat tumbuh secara optimal .
-

Selanjutnya dilakukan pengambilan 1 ml biakan bakteri dimasukkan


kedalam tabung mikrotube 1,5 ml . kemudian disentrifugasi selama 5
menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4 oC . kemudian hasil
sentrifugasi supernatan dibuang , kemudian pelet diambil , dilakukan
sebanyak 3 kali . selanjutnya pelet dari ketiga replikasi tersebut
dijadikan satu pada satu tabung mikrotube . kemudian dicuci
menggunakan Pbs 1 ml yang selanjutnya disentrifugasi selama 5 menit
dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4oC . proses pencucian ini
dilakukan 3 kali , maka akan diperoleh pelet dan selanjutnya disimpan
dalam freezer dengan suhu -20oC . tetapi sebelum disimpan di dalam
freezer tabung mikrotube tersebut dilapisi dengan plastik wrap dan
dpat disimpan dalam freezer .pelet yang didapat ini akan digunakan
dalam praktikum selanjutnya .

4.2 Isolasi DNA Plasmid


Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti
sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula
bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga memiliki DNA
ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang
berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah
sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada
bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan
ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja tidak terdapat pada
bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan
hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang
dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik.

Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat
ditransfer ke bakteri lain dan memiliki ORI (Origin of replication)
sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom.
Replikasi dimulai dari titik ORI hingga semua plasmid tereplikasi. Plasmid
merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih
2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang
penting untuk pertumbuhan bakteri. Di alam, gen informasi ini sering
mengkode protein yang akan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik.
Plasmid mungkin merupakan hasil dari perkembangan heterotrop yang
tertutup. Bakteri sering tumbuh pada lingkungan yang sama dengan mold
dan fungi dan berkompetisi dengan mereka untuk mendapatkan makanan
(bahan

organik

kompleks).

Sebagai

hasilnya,

mold

dan

fungi

menghasilkan toksin untuk membunuh bakteri (dalam dunia kedokteran


sering

deisebut

dengan

antibiotik)

agar

supaya

menang

dalam

memperebutkan makanannya. Untuk menanggapi ini bakteri menghasilkan


plasmid untuk mempertahankan hidupnya. Plasmid adalah DNA untai
ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar DNA kromosomal
bakteria. DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara alamiah pada
bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik
maupun parasitik pada sel inang.
-

Pada praktikum kali ini kami melakukan isolasi dna

plasmid bakteri. Plasmid merupakan materi gen yang memiliki


kemampuan untuk melakukan replikasi secara otonom. Ukuran plasmid
antara 1 kb-200 kb. Berbeda dengan DNA genom, DNA plasmid biasanya
berbentuk sirkuler dan terdapat bebas di dalam sitoplasma bakteri.Selain
itu, DNA plasmid jika diberi penambahan kalium asetat maupun asetat
maka untai ganda DNA akan terlarut, dan pada kondisi Ph=12-12,5, DNA
plasmid akan mengalami denaturasi namun tidak mengalami fragmentasi.
Pada satu sel bakteri dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan
ukuran yang sangat bervariasi. Pada teknologi DNA rekominan, plasmid

digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan DNA yang siklon sehingga


perlu diperoleh plamid yang tidak terkontaminasi dengan kromosom.
Kami menggunakan isolasi DNA plasmid menggunakan metode kimiawi
yakni penambahan bahan-bahan mekanik seperti EDTA, buffer TE, etanol,
PCL(Phenol/chloroform/isoamilalkohol, potasium asetat. Setelah kami
melakukan tahapan kerja seperti pembiakan bakteri dan penanaman
bakteri kemudian kami melakukan isolasi DNA plasmid dengan metode
kimiawi. Isolasi DNA plasmid ini menghasilkan pelet yang dikeringkan
dan diresuspsnsi dalam 20 mikroliter bufer TE, kemudian pelet tersebut
disimpan pada suhu 4C yang disimpan hingga digunakan untuk praktikum
selanjutnya. Penyimpanan pelet dalam buffer TE ini berguna untuk
mencegah kontaminasi dari lingkungan sekitar agar DNA plasmid yang
akan telah diisolasi tetap dalam kondisi steril untuk digunakan kembali
pada praktikum berikutnya.
-

4.3 Isolasi DNA Kromosom Bakteri


-

Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA kromosomal

bakteri Escherichia coli isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA


murni dari suatu sel. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein , lemak, dan karbohidrat.
Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA kromosom dari bakteri
Eschericia coli. Isolasi DNA kromosom diawali dengan memperbanyak
bakteri dengan cara menumbuhkan bakteri, pemanenan dan kemudian
dilakukan pemecahan dinding sel, selanjutnya dilakukan pemisahan DNA
kromosom dari komponen lain. Untuk memecah dinding sel bakteri, dapat
dilakukan dengan 2 cara, yaitu pemecahan secara fisik ( Freeze Thaw,
bead mill homogenization) dan secara kimia dengan menggunakan reagenreagen kimia seperti lisozim, EDTA, Tris HCL, atau dengan detergen
Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Pemecahan dinding sel dengan metode
diatas dapat merusak integritas barier dinding sel sehingga DNA
kromosom dapat keluar, kemudian pemisahan DNA dilakukan dengan

sentrifugasi. Pada praktikum kali ini dipilih metode Freeze Thaw yaitu
pemisahan secara fisik. Metode ini dilakukan dengan cara Heat Stock yaitu
dengan membekukan bakteri kemudian dipanaskan secara tiba-tiba,
sehingga diharapkan sel bakteri akan pecah kemudian DNA kromosom
akan keluar.
- Prinsip-prinsip pada isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan
persipitasi. Bakteri pada percobaan ini disentrifugasi dengan kecepatan
12.000 rpm selama 5 menit setelah dibekukan pada suhu -20 selama 24
jam, diaman didapat endapan putih ( pellet) yang terdapat pada bagian
bawah

tabung

sentrifuga. Hal

tersebut

dikarenakan prinsip

utama

sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul


dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih
berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Prinsip presipitasi adalah pengendapan DNA agar terpisah
dari zat lain yang terdapat dalam sel.
- Sentrifugasi merupakan salah satu metode dasar yang Sangat
penting dalam studi biologi sel maupun molekular. Sentrifugasi tidak
hanya berguna untuk memisahkan sel atau organel subselular, melainkan
juga digunakan untuk pemisahan molekular. Teknik sentrifugasi pada
pengisolasian DNA berfungsi untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam
sel berdasarkan berat molekulnya. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan
mengunakan alat yang berupa rotor yang digerakan oleh motor elektrik
yang merupakan tempat berpegangnya tabung yang akan disentrifugasi.
Pergerakan mesin sentrifugasi berhubungan dengan massa, kerapatan dan
susunan dari molekul yang disentrifugasi, serta massa , kerapatan dan
viskositas dari lingkungan larutan.
-

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah,


yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.
Dimana supernatan mengandung DNA kromosom sedangkan pelet

mengandung organel-organel dari bakteri serta dinding sel yang telah


pecah.
4.4 Titik Kritis
-

Titik kritis pada praktikum Isolasi DNA dan Kromosom Bakteri

adalah sebagai berikut:


a. Resuspensi dengan mikropipet
-

Proses resuspensi pada isolasi DNA bertujuan untuk menghomogenkan


pellet bakteri dengan Solution I, II, dan III. Pada saat proses resuspensi
harus dipastikan tidak ada gelembung udara didalam cairan, karena
gelembung udara berisi bakteri dan dapat menyebabkan kontaminasi.

b. Pengambilan Supernatan
-

Supernatan

yang

dihasilkan

dari

proses

sentrifugasi

setelah

penambahan Solution I, II, dan III berisi DNA plasmid, oleh karena itu
pengambilan supernatan dari tabung eppendorf harus hati-hati agar
tidak ada endapan yang ikut terambil.
-

BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
5.1.1

Bakteri

memiliki

DNA

kromosomaldan

DNA

ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal


-

yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal.


5.1.2 Pada praktikum ini, isolasi DNA plasmid dilakukan dengan
metode kimiawi menggunakan PCl, solution I, solution II dan

solution III.
5.1.3 Untuk memecah dinding sel bakteri pada isolasi DNA
kromosom, dilakukan pemecahan secara fisik ( Freeze Thaw, bead
mill homogenization) dan secara kimia menggunakan reagen-reagen
kimia seperti lisozim, EDTA, Tris HCL, atau dengan detergen

Sodium Dodecyl Sulfat (SDS).


5.1.4 Pada praktikum isolasi DNA kromosom kali ini dipilih metode

Freeze Thaw yaitu pemisahan secara fisik.


5.1.5 Titik kritis dalam praktikum ini terletak pada resuspensi
dengan pipet dan pengambilan supernatan.

DAFTAR PUSTAKA

Kimball. J. 2005.Biologi. ed. ke -5. jilid 1. terj dari Biology. 5th ed,
oleh Prof. DR. Ir. H. Siti Soetarmi T. Erlangga. Jakarta: xiii + 333 hlm.

Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta: xiii + 269


hlm

Yuwono,

Triwibowo.2006. Bioteknolgi

University Press. Yogyakarta


-

Pertanian. Gadjag

Mada