10/09/2014

Mtodos de anlises
Microbiolgicas

Docente Responsvel: Msc. Melissa C. Campos

E-mail: melissa@unoeste.br

I - INTRODUO
Importncia das anlises microbiolgicas
1 - Avaliar o produto (produo, processamento, estocagem e
transporte)
2 -Vida de prateleira (alimento seguro)
3 - Atender a legislao
4 - Manter e atingir novos mercado

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I - INTRODUO
Para os resultados das anlises microbiolgicas reflitam fiel condies
microbiolgicas de um alimento:
1- Realizar as coletas corretamente
2 Transportar em condies seguras
3 Respeitar a cadeia de frio na estocagem
4 Utilizar mtodos de anlises confiveis (laboratrios credenciados)

II Coleta, transporte e amostragem

Lote: quantidade de um alimento produzido nas mesmas condies
em um determinado perodo de tempo.
Amostra do lote: frao do total produzido retirada ao acaso.
Grandes massas de alimentos sem embalagens individual, alicotas (n)
Plano de amostragem (ICMSF International Commission on
Microbiological Specifications) adotados pela Anvisa
- Plano de duas classes: aceitvel e no aceitvel
- Plano de trs classes: aceitvel, qualidade intermediria aceitvel e
inaceitvel.

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II Coleta, transporte e amostragem

- n: o nmero de unidades de amostra a serem colhidas adequadamente

de um mesmo lote e analisadas separadamente

- m: padro microbiolgico estabelecido para microrganismo
- M: limite tolervel, acima do padro que pode ser atingido por algumas

unidades (c), no pode ser ultrapassado

- c: dentre as n unidades de amostra que constituem a amostra

representativa do lote, c o nmero mximo de amostras que podem

ser aceitas acima de m, mas no acima M

II Coleta, transporte e amostragem

- Exemplo: Regulamento CE no. 1441/2007

Categoria da
amostra
Carne picada

Microrganismo

Plano de
amostragem

Limites

Nmero de colnias 5
aerbias

5 10
ufc/g

5 10 ufc/g

E. coli

50 ufc/g

500 ufc/g

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II Coleta, transporte e amostragem

Unidade analtica: quantidade de alimento efetivamente utilizada na
realizao de 1 ou mais ensaios da unidade de amostras.
Material necessrio: frascos, utenslios, reagentes, diluentes e
equipamentos
Coleta de amostras para anlise
- Embalagens individuais intactas
- Tanques ou grandes embalagens: pores representativas da massa total
para frascos e bolsas estreis (asspticas)

II Coleta, transporte e amostragem

Frascos e embalagens para coleta

- Bolsas ou *frascos estreis com tampa sem vazamento, no vidro,
tamanho adequado (3/4), esterilizar utenslios autoclave ou flambar.

Coleta de embalagens no individuais

- Misturar toda a massa do alimento de forma homogenia
(microrganismos), e assim retirar a amostra
- No possvel a mistura
1- p: coletar amostras em diferentes partes do tanque (caladores)
2- peas slidas: usar facas, pinas, frceps estreis para cortar pedaos
menores

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II Coleta, transporte e amostragem

3- blocos de alimentos congelados: utilizar furadeira eltrica

(broca esterilizada) com funil estril. Liga-se a broca e vai

recolhendo as raspas

4- Torneiras ou tubulaes: flambar e aps deixar escorrer uma

certa quantidade

5 Margarinas ou similares: remover a camada externa (3-5

mm), amostrado corer

II Coleta, transporte e amostragem

Coletas de alimentos envolvidos DTA`s
- Coletar o mais rpido possvel, em casa de no conseguir coletar
alimentos preparados sobre as mesmas condies
Coleta de amostras de gua
- Embalagem intacta de gua ou coletar gua em embalagens
maiores (homogeneizar a amostra, passar lcool 70% na boca antes
de abrir em condies asspticas)

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II Coleta, transporte e amostragem

Transporte e estocagem
1- Alimentos desidratados: estveis microbiologicamente

2- Alimentos congelados: transportados e mantidos congelados at a

anlise. Compendium (Midura e Bryant, 2001) -20C, ISSO 7218
(2007) -15C e -18C. Caixa de isopor, com gelo seco e vedada.

II Coleta, transporte e amostragem

3- Alimentos refrigerados: transportados e mantidos resfriados at
anlise. Compendium (Midura e Bryant, 2001) 0 e 4,4C (36 horas),
ISSO 7218 (2007) transporte entre 1-8C (36 horas), estocagem
de 3-2C. Espaamento duplo para gelo em gel.

Tempo de anlise congelar exceo

bactrias lticas
Vibrios patognicos refrigerao branda
C. perfringens imediatamente
Campylobacter congelamento e perca de umidade
Aerbios psicrotrficos analisar no mximo em 6 horas

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II Coleta, transporte e amostragem

4- Alimentos comercialmente estreis em embalagens hermticas:
temperatura ambiente, no superior 40C. Embalagens estufadas (bolsas
plsticas) refrigerao (termfilos)
5- Amostras de gua: gua engarrafada na embalagem original, temperatura
ambiente
- Embalagens abertas ou transferidas para outros frascos, refrigerao,
intervalo de 8 horas (24 horas)
Recepo de amostras
- Observar as condies da embalagem e do transporte, antes da
aceitao do pedido
- Comunicar sobre as condies da amostra (embalagem aberta
ou com lacre rompido) proceder a anlise

III Segurana Laboratrio de

Microbiologia
1 - SEGURANA PESSOAL E COLETIVA
Jalecos de algodo ou tecidos pouco inflamveis;
Luvas de ltex ou resistentes ao calor quando necessrios;
Touca;
Mscaras de proteo quando necessrio;
Sapato fechado;
Pipetadores mecnicos e automticos;
No fumar, comer ou ingerir quaisquer espcies de lquido no laboratrio;
No participar do trabalho quando tiver ferida nas mos;
No tocar com as mos nos olhos, boca ou nariz;
Lavar as mos antes e depois do trabalho ou sempre que
suspeitar de contaminao;
Cuidado ao acender o *bico de bunsen (gs). Verificar
se no existem substncias inflamveis por perto;
Flambar alas, agulhas e pinas antes e aps o uso.

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III Segurana Laboratrio de Microbiologia

2 - SEGURANA EM OPERAES ESPECFICAS
2.1 Vidro
No trabalhar com material de vidro trincado, quebrado ou
pontas/arestas cortantes;
Vidros quebrados devem ser descartados adequadamente;
Usar luvas ou alas para manusear vidrarias quentes;
Colocar frascos quentes sobre tela e no diretamente na bancada;
2.2 Equipamentos eltricos
No utilizar equipamento eltrico em superfcie mida;
Verificar a voltagem correta entre equipamentos e circuitos
antes de lig-los;
No deixar equipamento eltrico ligado no laboratrio
fora do expediente de trabalho;
Quando no estiverem em uso, os equipamentos devem
permanecer desconectados.

III Segurana Laboratrio de Microbiologia

2.3 Balana
Verificar a capacidade da balana antes do uso;
Nunca pesar reagentes diretamente no prato da balana;
Verificar se a balana e redondeza esto limpos, aps o uso;
Deixar a porta da balana sempre fechada.
CONCEITOS IMPORTANTES
Cultivo artificial multiplicao de microrganismos fora do seu habitat
natural utilizando meios de cultura apropriados.
Esterilizao eliminao das formas vivas nos meios, utenslios e
instrumentos para que apenas os microrganismos em estudo se
desenvolvam.
Prticas Asspticas preveno do contato do material microbiolgico
com outras formas microbianas.

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IV Preparao da Amostra
Trs etapas: homogeneizao, retirada da amostra e primeira diluio
Cuidados:
- rea de trabalho limpa, portas e janelas fechadas
- Lavar as mos e desinfet-las e se necessrio luvas
- Desinfetar superfcie de trabalho-lcool 70%, hipoclorito
de sdio 200 ppm ou cloreto de benzalcnico 500 ppm)
- Assegurar que todo material necessrio esteja na bancada
- Cuidado ao abrir tubos/frascos aps agitar
- Pipetas e utenslios em bandejas de descarte
- Instrumentos e utenslios utilizados (esterilizar ou mergulhar em
lcool 70% e flambar no uso)
- Na abertura das embalagem passar lcool 70% e utilizar utenslios
desinfetados

IV Preparao da Amostra
Homogeneizao e retirada da unidade analtica
- Geralmente 25 gramas ou mililitros da amostra. ISSO 6887-1 (1999)
10 gramas slido e 10 ml para lquido (mnimo). O Compendium
(Midura e Bryant, 2001) 50 g para alimentos slidos e
10, 11 ou 50 ml para lquidos.

1 Produtos Lquidos
-Viscosidade menor que o leite: verter 25 vezes, esperar baixar a
espuma e retirar a unidade analtica, profundidade no maior que 2,5
cm da superfcie

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IV Preparao da Amostra
Homogeneizao e retirada da unidade analtica
2 - Produtos slidos ou lquidos concentrados
- Amostras congeladas: Compendium (Midura e Bryant, 2001)
descongelar (4,4C, mximo 18 horas) embalagem original, ou 40C mximo 15 minutos
com agitao. ISO 6887-4 (2003) descongelar
0-4C mximo 24 horas embalagem original.
Ou furadeira eltrica
- Amostra heterogenia (bolos, tortas, sobremesas...):

homogeneizar todo o contedo e retirar a unidade

analtica, liquidificador no superior 1 min. Ou
ento analisar camadas separadamente.

IV Preparao da Amostra
3 - Produtos com contaminao superficial - Tcnica Esfregao da
Superfcie
- Carcaas de bovinos,
sunos, aves, equinos e
Peixes. Utilizar utenslios e
equipamentos (bolsas estreis, swabs ou esponjas).

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IV Preparao da Amostra
3.1 Amostras com swab
- Tubos ou frascos com 10 ml de diluente,
Compendium (Midura e Bryant, 2001) gua
peptonada 0,1% ou tampo fosfato pH 7,2, e
ISSO 6887-1 (1999) gua salina peptonada
ou gua peptonada tamponada.
- Retirar o swab da embalagem estril
- Umedecer o algodo no diluente, comprimindo-o contra as paredes
- Delimitar rea (molde estril de 50 cm2)
- Aplicar o swab da esquerda pra direita e debaixo pra cima (rodar o algodo).
Quebrar a parte manuseada para fora do frasco.
* O liquido pode ser usado para quantificao quanto pra ausncia ou presena
microrganismos (1 ml = 5 cm). Pontos recomendados pela ISO 17604 (2003).

IV Preparao da Amostra
3.2 Amostras com esponjas
- Colocar 25 ml de diluente (swab) e massagear
a esponja
- Lavar bem as mos e com luvas retir-la
- Delimitar rea (molde estril de 10x10cm)
- Passar a esponja na carcaa em movimento da esquerda para direita e
de baixo pra cima (10x cada).
- Voltar a esponja pra bolsa e completar com 25 ml
O liquido pode ser usado tanto para quantificao

quanto pra ausncia ou presena microrganismos

(1 ml = 4 cm). Pontos recomendados pela ISO
17604 (2003). Ex. MEMO n. 381 CGI/DIPOA/2013

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IV Preparao da Amostra

IV Preparao da Amostra
4 Produtos com contaminao superficial - Tcnica Lavagem

Superficial
- Carcaas de aves inteira, cortes de aves, peixes, casca de ovos, gros,
sementes, castanha, amendoim e superfcie de embalagens, que podem
ser mergulhados em diluentes adequados.

4.1 Carcaas de aves (ISO 17604 e USDA/FSIS (2004))

- Drenar o excesso de lquido da carcaa
- Transferir para bolsa estril e pesar
- Adicionar na bolsa 400 ml (swab). Segurando a carcaa com uma das
mos e fechando a bolsa com a outra mo.
- Agitar 35 rpm, lavar toda superfcie externa e interna
* Cada ml do lavado corresponde ao peso da carcaa dividido por 400.

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IV Preparao da Amostra
4.2 Outros alimentos
- Transferir a amostra para bolsa estril e pesar
- Adicionar 1 ml diluente (swab) por grama da amostra
- Fechar a bolsa com uma mo e com a outra agitar e
massagear o alimento
- Em caso de gros utiliza-se fraco com diluente e agita por
10 min. em shaker.

* O liquido pode ser usado tanto para quantificao quanto pra ausncia ou presena microrganismos (1 ml=1g)

IV Preparao da Amostra
5 Contra amostras
- ISO 7218 (2007), depois da retirada da unidade analtica, o
material dever ser estocado nas mesmas condies antes das
anlises. Amostras perecveis precisam ser congeladas, e
quando utilizadas descongelar apenas a quantidade requerida.
- Amostras retiradas pela tcnica do esfregao de superfcie ou

lavagem superficial, congelar o diluente no utilizado.

- Tempo mnimo de guarda das contra provas definido pelo

laboratrio. Descarte final lixo ou autoclave (121C/30

min.) antes do descarte.

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IV Preparo da 1 diluio
- A unidade analtica deve ser diluda e homogeneizada com diluente

adequado (inoculao nos meios de cultura).

* Diluentes para ensaios gerais de quantificao

- Compendium (Midura & Bryant, 2001) recomenda gua peptonada 0,1% ou
tampo fosfato pH 7,0.
- Standad Methods for the Examination of Daily Products (Davis & Hickey, 2004)

recomenda para produtos lcteos, a soluo Ringer de concentrao, a gua

peptonada 0,1%, a gua salina peptonada, tampo fosfato pH 7,2 ou o tampo
fosfato cloreto de magnsio.

- Standad Methods for the Examination of Water Wasterwater (Hunt & Rice, 2005)

recomenda gua peptonada 0,1% ou tampo fosfato cloreto de magnsio (gua

de diluio)

- ISO 6887-1 (1999) recomenda gua salina peptonada e gua peptonada

tamponada

IV Preparo da 1 diluio
Primeira diluio 1:10 (10)
- m a g ou ml amostra, 9 x m a quantidade do

diluente. Ex. 25 g de amostra, 9x25 ml de

diluente 225 ml.
Diluio diferente de 1:10
- 1:k da amostra, v=[(k.m)-m]. Ex. diluio 1:50 de unidade

analtica de 10 g, (50x10)-10=490 ml de diluente.

Primeira diluio amostras lquidas

-Transferir a amostra para um tubo de ensaio contendo o diluente

e verter 25 vezes.

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IV Preparo da 1 diluio
Primeira diluio amostras slidas ou lquidas concentradas

- Transferir a amostra para bolsas ou frascos

estreis e tarados
- Adicionar a quantidade de diluente necessrio
- Agitar em Stomacher 1-2 ou liquidificador
alta rotao primeiros segundos e alta depois, no ultrapassar
2.
Primeira diluio amostras de esfregao de superfcie ou

lavagem superficial
- O diluente no qual foi recolhida a contaminao j a
primeira diluio, como no padro considerar essa
diferena 1:10 no calculo final dos resultados.

V Diluio decimal seriada

Ensaios quantitativos: reduzir o nmero de microrganismos por unidade
de volume (contagem decimal). O nmero de diluies deve permitir
abter placas com nmero de colnias entre 25 e 250 ou 10 e 150 na
contagem de bolores e leveduras.
Compendium (Swanson et al., 2001): segunda diluio logo aps a
primeira, e o trmino de tudo, at a inoculao dos meios de cultura,
mx. 15 min. Compendium (Beauchat & Cousin, 2001): Bolores e
Leveduras , alimentos duros sejam mantidos de molho no diluente.
Compendium (Hartman et al., 2001): enterococcos, diluio 1:1, com
perodo de repouso de 1 h, antes da diluio 1:10 e subsequentes.
ISO 6887-1 (1999): o intervalo entre o fim da primeira diluio e o
incio da segunda no exceder 30 min., durao mx. de 45 min.

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V Diluio decimal seriada

ISO 6887-4 (2003/Cor:1:2004): alimentos desidratados
(exceto leite em p, ovo em p e fermento vivo em p)
primeira diluio repouso 30(-/+5) min. em temp. ambiente
(25C) antes de transferir para segunda diluio.

ISO 8261 (2001): produtos lcteos submetidos a tratamento

trmico ou acidificao a primeira diluio repouso 45 min.
Temp. ambiente (20-25C) antes de transferir para segunda
diluio.

V Diluio decimal seriada

Segunda diluio
- Transferir assepticamente 1 ml da primeira diluio(10)
para 9 ml de diluente. No mergulhar a pipeta em
profundidade superior a 1 cm.
Diluies subsequentes
- Proceder de maneira similar. Antes de retirar

o volume a ser transferido, agitar o tubo

(invertendo 25 vezes em arco de 20 cm 7 s)
ou vortex.

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VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrficos e Bolores e
Leveduras em Placas
Utilizada para contagem de grandes grupos (mesfilos,
psicrotrficos, clostrdios sulfito redutores, enterococos, bactrias
lticas, bolores e leveduras desde S. aureus, Bacillus cereus e
Clostridium perfringens)
Cada clula microbiana presente em uma amostra, ir formar uma
colnia visvel, isolada e fixada em meio de cultura. UFC (unidades
formadoras de colnia)

VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrfilos e Bolores e
Leveduras em Placas
Material requerido
- 225 ml de gua peptonada 0,1%, 3-5 tubos de
ensaio com 9,0 ml H0 p cada, e 3-5 pipetas
de 1,0 ou 2,0 ml
1) - Contagem total de microrganismos aerbios mesfilos em
profundidade
- 3-5 placas de petri estreis
- 200 ml de gar Padro para contagem (PCA)
- Estufa: 35C

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VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrfilos e Bolores e
Leveduras em Placas
2) - Contagem total de microrganismos psicrotrficos em superfcie
- 3-5 placas de petri estreis com gar Padro de Contagem (PCA),
- 1 ala de Drigalski (etanol 70%) e estufa 7C
3) - Contagem de bolores e leveduras em superfcie
- 3-5 placas com gar Padro de Contagem suplementado com 100
mg/l de cloranfenicol (PCA-cloranfenicol) ou gar Diclosan Rosa de
Bengala Cloranfenicol (DRBC) ou gar Batata Dextrose acidificado
(PDA acidificado) ou gar Batata Dextroses com antibiticos (PDAantibitico)
- Soluo cido tartrico 10% esterilizada por filtrao para PDA
acidificado, soluo de cloranfenicol para PCA cloranfenicol, soluo
de antibitico para PDA-antibitico
- 1 ala de Drigalski (etanol 70%) e estufa 25C

VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrfilos e Bolores e
Leveduras em Placas

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VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrficos e Bolores e
Leveduras em Placas
Contagem pelo Mtodo de Plaqueamento em Profundidade

1 - Preparao das amostras e diluies

2 - Inoculao: inocular 1,0 ml das trs diluies (nvel de
contaminao), em placas de petri estreis (3 cada), longe do centro
placa (bico de bulsen ou capela de fluxo laminar), com pipetas de
mximo 2 ml
3 Adio ao meio de cultura: verter na placa15-20 ml de PCA,
previamente fundido e resfriado (45C). Realizar a mistura, superfcie
plana, movimentos em 8 ou circulares, de 8-10 vezes sentido horrio e
depois anti-horrio.

VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrficos e Bolores e
Leveduras em Placas
4 Incubao: aguardar solidificao do meio. Inverter as placas e
incubar 35C/48 horas. Produtos lcteos 32C por 48 horas.
Produtos vegetais fermentados ou acidificados no
comercializados estreis, incubar 32C/3 dias.

5 Contagem colnias e clculos: selecionar as placas com 25-250

colnias e contar com lupa e contador. Calcular UFC/g ou ml =
No. de colnias/diluio. Usar notao exponencial e apenas 1
casa depois da virgula

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VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrficos e Bolores e
Leveduras em Placas
Contagem pelo Mtodo de Plaqueamento em Superfcie

1 - Preparao das amostras e diluies (molho)

2 Preparao placas 15-20 ml do meio adequado, Mesfilos e
psicrotrfico - PCA. Bolores e leveduras - gar Diclosan Rosa de
Bengala Cloranfenicol (DRBC) ou gar Batata Dextroses com
antibiticos (PDA-antibitico). Secar a superfcie do meio em
estufa (50C/2 h ou 30-35C/1 noite tampas fechadas) ou
cabines de fluxo laminar (0,5-1 h - tampas parcialmente abertas)

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VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrficos e Bolores e
Leveduras em Placas
3 Inoculao: 3 diluies e inocular 0,1 ml de cada na superfcie das
placas, espalhar o inculo com ala de Drigalski por toda superfcie at a
absoro

4 Incubao: aguardar mnimo 15, inverter e incubar. Mesfilos 35C

por 48 horas. Produtos lcteos 32C. Psicrotrficos 7C/10 dias ou
17C/16 h seguidas de 7C/3 dias. Bolores e leveduras: 25C/5 dias,
placas no invertidas (3 dias, +2 dias)
5 Contagem colnias e clculos: idem ao plaqueamento por
profundidade, porm multiplicar o resultado por 10. Bolores e leveduras
contar placas com 10-150 colnias. Calcular UFC/g ou ml = No. de
colnias x 10/diluio.

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VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrficos e Bolores e
Leveduras em Placas
Contagem pelo Mtodo de Plaqueamento em Gotas

1 Preparao das amostras e diluies seriadas: idem aos anteriores,

porm suplementar o diluente com 0,1% de gar.
2 Preparao das placas: idem ao plaqueamento em superfcie, porm
com uma secagem rigorosa da superfcie 24 h/30-35C antes de usar.
3 Inoculao: dividir a placa em 9 setores, utilizar pipetas graduadas
de 0,1 ml ou pipetadores de ponteiras descartveis, inocular 3 gotas de
0,01 ml de cada diluio em trs quadrados adjacentes da placa
(triplicata), cuidado para no escorrer. Deixar secar em superfcie plana
(30 min.)

VI Contagem Total de Microrganismos Aerbios

Mesfilos, Aerbios Psicrotrficos e Bolores e
Leveduras em Placas
4 Incubao: aguardar a absoro das gotas e incubar idem ao
plaqueamento em superfcie.
5 Contagem das Colnias e Clculos: contar as colnias das
gotas com no mximo 30 colnias. Fazer uma mdia do nmero
de colnias das trs gotas da diluio inoculada e multiplicar pelo
inverso da diluio e em seguida por 100. Calcular UFC/g ou ml
= No. de colnias x 100/diluio.

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VIII Controle de qualidade microbiolgico

na Industria de Alimentos

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