i

LAPORAN PRAKTIKUM
PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

Oleh,
KELOMPOK 10
IMAM WAHYU DWI KARTASASMITA

B1D 012 133

IMAM MUNANDAR

B1D 2212 132

IMRAN

B1D 012 134

ILZA ADE PRATAMA

IDHAM HOLID
INE KARNI
HILIDA SUCI IRAWANI

B1D 012 125

HIKMAWATI
HIJRATUL KAHFI

FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS MATARAM
2013

ii

HALAMAN PENGESAHAN

Laporan Ini Disusun Guna Memenuhi Sebagian Syarat untuk Menyelesaikan

Mata Kutliah Pengantar Bioteknologi

Mataram, 23 Desember 2013

Mengetahui,

Co. Assisten,

Susila Wati

(Yendri Junaidi)
B1D 010 180

Ima Milawati

(Filman Hayadi)
B1D 010 225

iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur senantiasa terucapkan dari lisan kita kepada Allah SWT.
Tuhan Yang Maha Besar yang telah menciptakan ilmu yang berguna dalam hidup
dan kehidupan manusia. Dengan ridho dan pertolongan-Nya kami dapat
menyelesaikan penulisan laporan praktikum Pengantar Bioteknologi ini secara
berjamaah. Laporan ini berisi tentang cara-cara melakukan isolasi plasmid DNA
dari bakter E. Colly, cara-cara melakukan reaksi berantai polimerasi atau yang
sering disebut dengan PCR dan cara-cara melakukan elektroforesis protein dengan
tujuan untuk dapat mengetahui berat mulekul protein suatu bahan. Laporan ini
disusun guna memenuhi sebagian syarat dalam mengikuti mata kuliah pengantar
bioteknologi.
Terimakasih kami ucapkan kepada semu pihak dari dosen, Co. Assisten
dan rekan-rekan yang telah membantu dan membimbing dalam melaksanakan
praktikum.
Dalam penulisan laporan ini kami menyadari bahwa kami adalah manusia
biasa yang tidak terlepas dari kekurangan dan kesalahan karena tidak ada gading
yang tak retak, baik dalam penulisan maupun dalam isi laporan. Oleh karena itu
kami dari kelompok 10 sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun
dari semua pihak sebagai langkah untuk mendapatkan hasil yang lebih baik di
kemudian hari.
Akhirnya kami mengkarapkan semoga laporan ini dapat brmanfaat dan
dapat digunakan sebagai referensi tambahan bagi yang membutuhkan.

Mataram, 20 Desember 2013

Penyusun

iv

DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL............................................................................

KATA PENGANTAR .........................................................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN..............................................................

iii

DAFTAR ISI ........................................................................................

iv

ACARA I ISOLASI PLASMID DNA BAKTERI E. COLLY

BAB 1 PENDAHULUAN ...................................................................

1.1 Latar Belakang ...................................................................

1.2 Tujuan.................................................................................

BAB II TINJAUAN PUSTAKA..........................................................

BAB III MATERI dan METODE PRAKTIKUM ...............................

3.1 Materi Praktikum................................................................

3.2 Metode praktikum ..............................................................

3.3 Waktu dan Tempat Praktikum ...........................................

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN ................................................

4.1 Hasil Praktikum..................................................................

4.2 Pembahasan ........................................................................

BAB V PENUTUP ...............................................................................

11

5.1 Kesimpulan ........................................................................

11

5.1 Saran...................................................................................

11

ACARA II POLYMERASE CHAIN REACTION

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................

12

1.1 Latar Belakang ...................................................................

12

1.2 Tujuan.................................................................................

13

1.3 Kegunaan ............................................................................

14

BAB II TINJAUAN PUSTAKA..........................................................

15

BAB III MATERI dan METODE PRAKTIKUM ...............................

17

3.1 Materi Praktikum ...............................................................

17

3.2 Metode praktikum ..............................................................

18

3.3 Waktu dan Tempat Praktikum ...........................................

18

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN ................................................

19

4.1 Hasil Praktikum..................................................................

19

4.2 Pembahasan ........................................................................

19

BAB V PENUTUP ...............................................................................

22

5.1 Kesimpulan ........................................................................

22

5.1 Saran...................................................................................

22

DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................

23

LAMPIRAN .........................................................................................

24

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang.

Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (Deoxyribonucleic

Acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun
berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti
sel.
Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi
genetik artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku
umum bagi setiap organisme. Di antara pengecualian yang menonjol adalah
beberapa jenis virus (virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human
Immunodeficiency Virus).
Maka dari itu, DNA sangat berpengaruh pada bidang penelitian yang
menggunakan tehnologi dalam membantu umat manusia untuk memcahkan
berbagai maslah, telah banyak ilmuan yang telah menemukan cara penanganan
pada DNA yang mempunyai runtutan yang teratur, bicara teantang runtutan atau
langkah dalam perlakuan DNA ada satu materi yang mendasar yang harus
dikuasai oleh para peneliti baru yaitu, isolasi plasmid DNA.
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri
berutas ganda dan berbentuk sirkuler. Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil
dan terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel
eukariot tingkat rendah seperti khamir. Plasmid mengalami duplikasi sebelum
pembelahan sel inang.
Plasmid

biasanya

digunakan

dalam

teknologi

DNA

rekombinan

menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam rekayasa genetika,

plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Pada bakteri Eschericia coli, bahan genetik
utamanya terdiri atas sekitar 4.600 kb (4,6 x 106 bp). Plasmid dapat dijadikan
sebagai vektor karena dapat melakukan replikasi, terletak ekstra kromosom,
ditransfer secara stabil, berukuran kecil, susunan DNA sudah diketahui, harus

mempunyai jumlah salinan yang banyak di dalam sel inang, memiliki titil Ori,
memiliki marker seleksi, memiliki marker kedua yang berguna untuk tanda
apabila plasmid disisipkan gen asing dan memiliki situs retriksi yang unik sebagai
tanda untuk menyisipkan gen asing.
Pada dasarnya plasmid merupakan identitas genetik yang ditemukan secara
alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot. Dengan teknik
rekayasa genetik, sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial dengan cara
menggabungkan gen-gen dari plasmid alami maupun genom tertentu.
Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses isolasi plasmid,
elektroforesis, dan visualisasi menggunakan sinar ultraviolet (UV). Tahapan
pengendapan dalam isolasi plasmid adalah pemecahan sel, keluarnya plasmid dari
nukleus dan pengendapan atau presipitasi plasmid. Tahapan selanjutnya adalah
elektroforesis DNA yaitu, teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan
atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya dengan menggunakan
medan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA plasmid yang
bermuatan negatif. Gel yang biasanya digunakan dalam proses elektroforesis
adalah agarosae. Elektroforesis biasa digunakan untuk analisa ukuran dan
konfirmasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan ekstraksi DNA.

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari isolasi plasmid ini addalah untuk memisahkan
DNA plasmid dari bakteri E. Coli.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

DNA (deoxyribonucleic acid) adalah materi genetik yang terdapat di

dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu berbentuk seperti tangga. Bukan tangga
yang lurus, tetapi tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga dihubungkan oleh anak
tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak tangga, yaitu anak tangga yang
dibentuk oleh pasangan basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa GuaninCitosin (G-C) (Warta Medika, 2008).
DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu
DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel
berinti, seperti darah, semen, akar rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang
paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut
beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh. DNA dapat
diisolasi sekalipun dengan menggunakan bahan kering seperti, bercak
darah maupun preparat autan, selain itu DNA juga dapat diisolasi dari produk
olahan (Anonim, 2011).
Laju migrasi DNA tergantung dari ukuran, struktur, dan muatan total
molekul. Molekul DNA tidak bisa dilihat dengan mata telanjang, namun bisa
dilihat pada gel agarose melalui teknik pewarnaan dengan menggunakan pewarna
yang disebut etidhium bromida. Etidhium bromida merupakan agen interkalasi
yang menyisip ke antara busa-busa molekul DNA dan berfluoresensi (Standfield,
2006).
Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara
autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup. Di dalam satu sel dapat ditemukan
lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua
plasmid tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut.
Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan
pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali
normal, DNA plasmid dapat dibuang (Royston 1972).

Keberadaan plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA

rekombinan. Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil
mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian
DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang
berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa protein. Pada praktikum ini
DNA plasmid diisolasi dari bakteri Escherichia coli, sehingga dengan
dilakukannya pengisolasian dan pemurnian DNA plasmid diharapkan dapat
memaksimalkan hasil DNA rekombinan dan rekayasa genetic dapat tercapai
(Sambrook& Russell 2006).
Menurut (Muladno, 1994) ada beberapa hal penting yang dapat
menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara
lain adalah :
a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya
lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi.
b. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama
diisolasi secara kimia.
c. Mempunyai

titik

ori

(origin

of

replication)

sehingga

dapat

memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi.

d. Jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam
sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah
diamplifikasi.
e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik
tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang
membawa gen tertentu.

BAB III
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

3.1.Materi praktikum

3.1.1 Alat praktikum

1. Mikropipet
2. Evendorf
3. Sentrifius
4. Sentrifius
5. Vorteks
6. Yelow tip
7. Es box
8. Gloves
3.1.2 Bahan praktikum
a) Larutan I
50 mM glucose
25mM tris-Cl (ph 8.0)
10 Mm EDTA (8.0)
b) Larutan II
0.2 NaOH (harus fresh)
1% SDS
c) Larutan III
5 M potasium acetate 60 ml
Acetic acid glacial 11.5 ml
H2O 28.5 ml
d) Pelet Bakteri e colli

3.2.Metode praktikum

Adapun langkah-langkah dalam melakukan melaksanakan pratikum

ini adalah sebagai berikut:
1. Meresuspensikan pellet dengan 100 l larutan I dingin, kemudian campur
dengan merata dengan menggunakan vortex
2. Menambahkan 200 l larutan II campur dengan merata dengan cara
membolak-balik tabung dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan
vortex !!!)
3. Menambahkan 150 l larutan III dingin. Vortex selama beberapa detik
kemudian

balikan

posisi

tabung

(inverced)

selama

10

detik.

Mengembalikan tabung ke posisi semula dan simpan dalam es selama 4-5

menit.
4. Melakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menitpada suhu 40C.
Setelah itu ambil supernatant dan dipindahkan kedalam tabung lain.
5. Menambahkan phenol:chloroform dengan perbandingan 1:1 dengan
jumlah supernatant yang diperoleh. Minsalnya volume supernatant yang
diperoleh adalah 300 l, maka tambahkan phenol: chloroform sebanyak
300 l.
6. Campur dengan merata menggunakan vortex kemudian melakukan
sentrifugasi (12000 rpm) selama 2 menit pada suhu 4 0C.
7. Setelah sentrifugasi, mengambil supernatant dan pindahkan kedalam
tabung lain.
8. Menambahkan

ethanol

(2

volume

supernatant)

unntuk

mempresipitasikan DNA. mencampur dengan vortex, kemudian biarkan

pada suhu kamar selama 2 menit.
9. Melakukan sentrifugasi 12000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 0C.
10. Membuang supernatant perlahan-laha. Balikkan tabung dan biarkan
kering udara selama beberapa menit.
11. Membilas DNA pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian
sentrifugasi seperti cara no 9

12. Membuang supernatant, balikkan tabung dan membiarkan kering udara

selama 10 menit.
13. Meresuspensi DNA dengan 25 l buffer TE (pH 8.0).

3.3. Tempat dan Waktu Praktikum

3.3.1 Tempat Praktikum

Praktikum ini diadakan di Labolatorium Mikrobiologi dan Bioteknologi,
Fakultas Peternakan, Universitas Mataram.

3.3.2 Tanggal Prktikum

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 9 Desember 2013, pukul
09.00 11.30 WITA.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Praktikum

Setelah melaukan isolasi plasmid DNA bakteri E. Coli makahasil yang
diperoeh adalah sebagai berikut :
Gambar 1 Plasmid DNA bakteri E. Coli

4.2 Pembahasan
Umumnya

prinsip yang digunakan dalam mengisolasi DNA plasmid

adalah sama dengan isolasi DNA/RNA dari suatu sel. Prinsip yang digunakan
adalah melakukan isolasi plasmid dengan sentrifugasi dan presipitasi. Hal ini

dilakukan dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan

terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian
ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung plasmid.
Langkah yang medasar untuk mendapatkan DNA plasmid adalah
menumbuhkan sel-sel bakteri (house) dalam sebuah media. Bakteri yang
digunakan adalah Escherichia coli sedangkan media yang digunakan adalah
media NB (Nutrien Broth). Bakteri Escherichia coli digunakan karena bakteri ini
mudah didapatkan. Selain itu, Escherichia coli dapat menghasilkan keturunan
yang banyak dalam waktu singkat. Kemampuanya berkembang biak dengan
fission binary (pembelahan sel) yang cepat, mampu tumbuh pada media yang
murah, pertumbuhan tidak rewel.
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen,
sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid
mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk
memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda
dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan
detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein
dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan
potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara
sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang
tersisa

dipisahkan.

Kemudian

ditambahkan

RNase

dan

protese

untuk

mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi

menggunakan etanol.
Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial
bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali
menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya
akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan
berbagai enzim.

10

Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai
proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1- 20 g. Sedangkan
untuk jumlah yang lebih besar (100 200 g) dinamakan midi preparation dan
maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 g.
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel
sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal
serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus
dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya.
Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with
detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang
paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi
bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,
yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,
beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah
berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan
mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan
yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus
disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis,
remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel
dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan
fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan
dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari
protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu
ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang
telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat
dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

11

BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Dari hasil praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Plasmid adalah molekul DNA berbentuk sirkular (bundar), bereplikasi
sendiri dan membawa beberapa gen yang tidak terlalu penting.
2. Bakteri E. Coli merupakan bakteri yang paling mudah untuk diisolasi.
3. Isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga
semua organel sel dapat keluar

5.2 Saran

Kepada semua praktikan supaya melakukan praktikum lebih aktif.

12

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Polymerase chain reaction merupakan teknik yang sangat berguna dalam
membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA
tertentu di salin hingga jutaan kali untuk di perbanyak sehingga dapat di analisis,
atau di modifikasi secara tertentu.
PCR dapat di gunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau
untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat di
gunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sempel. PCR
memnfaatkan enzim DNA polymerase yang secara alami memang berperan dalam
perbanyakan DNA pada proses replikasi.
Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada tahun
1985. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April 1983, malam Jumat, saat
membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara
bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inspirasi yang bermakna
dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari
DNA. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific,
1990, yang memberinya peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel
dalam kimia atas penemuan PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow
fragmen E.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA
yang spesifik. Namun, enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi
dari PCR, sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap
siklus PCR. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis, khususnya pada
teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis.
Setiap siklus PCR terdiri dari tiga tahap, berikut adalah tiga tahap
bekerjanya PCR dalam siklus :
1. Tahap Peleburan (melting) atau Denaturasi
Pada tahapan ini berlangsung pada suhu 94 - 960 C. ikatan
hydrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berbekas tunggal.

13

Biasanya pada tahap awal PCR ini dilakukan beberapa lama (sampai
menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemesihan ini
menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template (patokan) bagi
primer. Durasi tahap ini 1- 2 menit.
2. Tahap Penempelan atau Anealing
Primer menempel pada bagian DNA templet yang komplementer
urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu 45 - 6000 C. penenmpelan ini
bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya
penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini
1- 2 menit.
3. Tahap Pemanjangan atau Elongasi
Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polymerase yang
di pakai. Dengan taq-polymerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu
760 C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Selain DNA template yang akan
digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang di butuhkan
adalah Primer, primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau
oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi
pemanjangan rantai atau polymerase DNA. dNTP ( deoxynucleos ide
triphosphate ) atau building blocks sebagai batu bata penyusun DNA
yang baru. Buffer, buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia
untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan
enzim DNA polymerase. Ion logam terbagi menjadi dua yaitu Ion logam
bivalen, tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekrja.
Sedangkan ion logam monovalen ( kalsium ).

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dilaksanakannya praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Untuk mengetahui teknik dan cara melakukan PCR
2. Untuk memperbanyak DNA yang di inginkan secara invitro atau
diluar sel.

14

3. Digunakan dalaam penelitian biolog seperti mengamati penyakit

keturunan dan identitas sidik jari.

1.2 Kegunaan Praktikum

Adapun kegunaan praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR.
2. Mahasiswa dapat mengetahui alat-alat yang di gunakan dalam
melakukan praktikum PCR.
3. Mahasiswa dapat mengetahui metode-metode yang digunakan
dalam PCR.

15

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah cara in vitro untuk

memperbanyak target sekuen spesifik untuk analisis cepat atau karakterisasi,
walaupun material yang digunakan pada awal pemeriksaan sangat sedikit. Pada
dasarnya PCR meliputi tiga perlakuan yaitu: denaturisasi, hibridisasi dari "primer"
sekuen DNA pada bagian tertentu yang diinginkan, diikuti dengan perbanyakan
bagian tersebut oleh Tag polymerase; dikerjakan dengan mengadakan campuran
reaksi dalam tabung mikro yang kemudian diletakkan pada blok pemanas yang
telah diprogram pada seri temperatur yang diinginkan (Prijanto, 1992).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan
untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000
pasang basa (bp) (Yuwono, 2005).
Laju migrasi DNA tergantung dari ukuran, struktur, dan muatan total
molekul. Molekul DNA tidak bisa dilihat dengan mata telanjang, namun bisa
dilihat pada gel agarose melalui teknik pewarnaan dengan menggunakan pewarna
yang disebut etidhium bromida. Etidhium bromida merupakan agen interkalasi
yang menyisip ke antara busa-busa molekul DNA dan berfluoresensi (Standfield,
2006).
Agarose yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar
struktur D-galaktosa dan 3,6 - anhidro L-galaktosa. Gel agarose mempunyai daya
pemisah lebih rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrilamid, tetapi
mempunyai rantang pemisahan lebih serius. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo
basa dapat dipisahkan denagn gel agarose dengan berbagai konsentrasi agarose.
Gel agarose biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan
medan listrik dan arah tetap (Sudjadi 2008).
Gel agarose dibuat dengan melelehkan agarose dalam buffer dan kemudian
dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarose

16

membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarose.

Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan
negatif pada pH netral akan bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan
oleh ukuran DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarose, dan besaran tegangan
yang digunakan (Sudjadi 2008).

17

BAB III
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

3.1. Materi praktikum

3.1.1

Alat praktikum
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah
sebagai berikut:

1. Mesin PCR
2. Sinar UV
3. Elektropolisis DNA
4. Mikro pipet
5. Efendorf

3.1.2

Bahan praktikum
Bahan yang dugunakan dalam praktikum ini adalah sebagai
berikut:
Campuran reksi terdiri dari :

1. Air steril

: 6,7 l

2. 10 x buffer taq

:1

3. 2,5 mMdNTP mix

: 0,4 l

4. 10 M primer forward

: 0,4 l

5. 10 M primer reverse

: 0,4 l

6. Template

:1

7. Enzim

: 0.1 l

10 l

Bahan gel elektroforesis DNA

Agarose

Buffer TAE

18

EtB (ethibium bromide )

3.2. Metode praktikum

Adapun langkah-langkah dalam melaksanakan praktikum ini adalah
sebagai berikut :
1) Mencampur bahan-bahan yang digunakan untuk melakukan PCR
a. Memasukkan air steril sebanyak 40 l ke dalam evendorf
b. Menambahkan 10 x buffer tag sebanyak 1 l ke dalam evendorf
c. Menambahkan 2,5 mM primer forward sebanyak 0,4 l
d. Menambahkan 10 M primer forward sebanyak 0,4 l
e. Menambahkan 10 M primer reverse sebanyak 0,4 l
f. Menambahkan template sebanyak 1 l
g. Menambahkan enzim sebanyak 0,1 l
2) Memasukkan tabung PCR ke dalam mesin PCR
3) Mengatur mesin PCR
4) Mencapur cairan PCR dengan buffer TAE kemudian memasukkan cairan
tersebut ke agarose
5) Melihat sample di bawah sinar UV

3.3.Tempat dan Waktu Praktikum

3.3.1 Tempat Praktikum

Praktikum ini diadakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi,
Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

3.3.2 Waktu Praktikum

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 9 Desember 2013,
pukul 09.00 11.30 WITA.

19

BABA IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.2 Pembahasan

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Teknik ini

merupakan teknik perbanyakan DNA secara in vitro. Dalam sistem kerjanya, PCR
dilandasi oleh struktur DNA. Dalam keadaan nativenya, DNA merupakan double
helix, yang terdiri dari dua buah pita yang berpasangan antiparalel antara satu
dengan yang lain dan berikatan dengan ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen terbentuk
antara basa-basa yang komplementer, yaitu antara basa Adenin (A) dengan
Thymine (T), dan Guanine (G) dengan Cytosin (C) (Muladno 2002). Diamana
pada alat ini kami memasukan hasil isolasi dari DNA bakteri E.Coly.
PCR

memiliki

beberapa

komponen,

diantaranya

yaitu

enzim

Taqpolymerase, primer, dNTP dan buffer. Enzim Taq polymerase memiliki

keaktifan dalam suhu tinggi, oleh karena itu penambahan enzim tidak perlu
dilakukan dalam setiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin.
Pemakaian Taq polymerase dalam konsentrasi yang terlalu besar akan
mengakibatkan munculnya background produk non-spesifik. Sebaliknya, bila
konsentrasi Taq polymerase terlalu rendah, maka proses amplifikasi berlangsung

20

secara inefisien, dan produk amplifikasi yang diperoleh akan mempunyai

konsentrasi yang relatif rendah. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau
oligonukleotida

pendek

yang

menginisiasi

sekaligus

membatasi

reaksi

pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Fungsi dari primer yaitu menghindari
adanya polipurin atau polipirimidin dan menghindari adanya struktur sekunder.
Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template,
jadi dirancang agar menempel dan mengapit daerah tertentu yang diinginkan.
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan
keberhasilan reaksi PCR. dNTP sebagai penyusun DNA yang baru yang terdiri
atas 4 macam, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Buffer untuk mengkondisikan
reaksi agar PCR berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase
(Innis et al. 1990).
Dalam kegiatan praktikum biologi molekuler, elektroforesis merupakan
salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk
PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya
berdasark anmigrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi
DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan,
maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida

(EtBr),

kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap
sinar ultraviolet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat
molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas
sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila
diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh: 1) ukuran molekul DNA, 2)
prosentase atau kerapatan gel yang dilalui DNA, 3) arus listrik yang diberikan
untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin
cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi
prosentaseny, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus
yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi.
Gel

elektroforesis

digunakan

untuk

memisahkan

fragmen

DNA

berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul

21

menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan

molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil
keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika
diletakkan didalam medan listrik, molekul DNA menuju kekutub positif (anoda)
dan menjauhi kutub negatif (katoda).
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus
ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk 1) menambah densitas,
sehingga DNA akan selalu berada didasar sumur, 2) pewarna untuk memudahkan
meletakkan sampel DNA kedalam sumur, 3) agar dapat bergerak ke arah anoda
dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda
migrasi

DNA.

Pewarna

yang

biasa

digunakan

adalah

bromophenol

bluedanxylenecyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA didalam gel yang telah
diwarnai dengan ethidium bromida diatas lampu UV yang dibandingkan dengan
DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA
(Suharsono dan Widyastuti, 2006).

22

BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan

5.2 Saran

23

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. ht tp://www. scribd. com/doc/302 75768/LaporanPraktikum

Bioselmol-Isolasi-Dna-Plasmid Diakses tanggal 20 Desember 2013.
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White JT. 1990. PCR Protocols, A guide to
Metods and Applications. Sanm Diego: Academic Press Inc.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka
Wirausaha Muda.
Prijanto, Muljati. 1992. Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis
Human
Royston C Clowes. 1972. Molecular Structure of Bacterial Plasmids.
Bacteriological Reviews
Sambrook, Russell. 2006. The Condensed Protocols From Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press
Standfield W.D, Jaime S.C Raul J.C. 2006. Schaums Easy Outline Biologi
Molekuler dan sel. Penerjemah: Varian Fahmi, terjemahan dari:
Schaums Easy Outline Molecular and Cell Biology. Jakarta: Erlangga.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.
SuharsonodanWidyastuti,U.

2006.PenuntunPraktikum

Pelatihan

Teknik

Pengklonan Gen . Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan

Bioteknologi, IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika.
Warta Medika. 2008. Sidik DNA. (http://www.wartamedika.com/2008/07/sidikdna.html). Diakses 20 Desember 2013.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlang.

24

LAMPIRAN

FOTO-FOTO PRAKTIKUM
Gambar 1 Vortex

Gambar 2 Yellow Tip

Gamabar 3 Sentrifuse

Gambar 4 Micro Pipet