III.

METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT

1. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur Bacillus
thuringiensis subsp. aizawai yang diperoleh dari IPB Culture Collection
(IPBCC) pada medium agar miring. Substrat yang digunakan adalah ampas
tahu dan limbah cair tahu yang diperoleh dari Industri Tahu Cibanteng. Kubis
yang digunakan diperoleh dari pasar-pasar tradisional dan super market. Serta
larva ulat Croccidolomia binotalis (ulat kubis) yang diperoleh dari Laboratorium
Fisiologi dan Toksin Departemen Hama dan Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian,
IPB.

Mineral

yang

digunakan

adalah

MgSO4.7H2O,

MnSO4.

H2O,

ZnSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, CaCO3, dan urea. Bahan-bahan yang digunakan

untuk analisa adalah nutrien agar (NA), nutrien broth (NB), HCl, NaOH,
CH3COOH, H2SO4 pekat, fenil, garam fisiologis, etanol 95 %, aqua destilata,
Pro-Stiker, dan spiritus.

2. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi autoklaf, pH-meter,
oven, lemari es, inkubator, neraca analitik, desikator, spektrofotometer, freezer,
loop inokulasi, dan alat-alat gelas lainnya seperti labu erlenmeyer, tabung
reaksi, pipet, bunsen, cawan petri, dan gelas piala.

B. METODE PENELITIAN

1. Penelitian Pendahuluan
a. Analisa Bahan Baku
Analisa ini bertujuan untuk mengetahui komposisi kimia ampas tahu
dan limbah cair tahu yang digunakan, yaitu analisis kadar air, kadar abu,
kadar lemak, kadar serat, kadar nitrogen, dan kadar karbon. Prosedur
analisis tercantum pada Lampiran 1.

18

b. Penyiapan Inokulum Bacillus thuringiensis subsp. aizawai

Inokulum (kultur bibit) kultivasi disiapkan secara bertahap mengikuti
metode Vandekar dan Dulmage (1982). Diagram alir persiapan inokulum
disajikan pada Gambar 6.
Satu loop biakan Bt subsp. aizawai

Inokulasi dalam 50 ml medium NB (labu pembibitan 1)

Inkubasi dalam rotary shaking incubator
30 0C ; 180 rpm ; 12 jam

Kultur digunakan untuk menginokulasi labu pembibitan II

(5 % dari volume media kedua)

Inkubasi dalam rotary shaking incubator

30 0C ; 180 rpm ; 12 jam

Inokulum / Starter
Gambar 6. Diagram Alir Pembiakan Inokulum

2. Penelitian Utama
a. Penyiapan Media Kultivasi
Susunan medium kultivasi yang akan dibuat dalam penelitian ini dapat
dilihat pada Tabel 4 yang dibuat dua kali ulangan.
Tabel 4. Perbandingan Medium Kultivasi
Sandi Medium

Perbandingan Medium

Ampas Tahu 20% : Limbah cair tahu 80%

Ampas Tahu 30% : Limbah cair tahu 70%

Ampas Tahu 40% : Limbah cair tahu 60%

19

Jenis dan jumlah mineral yang digunakan dalam penelitian ini sesuai
dengan yang digunakan oleh Dulmage dan Rhodes (1971), yaitu 0,3 g/l
MgSO4.7H2O, 0,02 g/l MnSO4. H2O, 0,02 g/l ZnSO4.7 H2O, 0,02 g/l
FeSO4.7 H2O, dan 1,0 g/l CaCO3.
Pembuatan media kultivasi yang dilakukan adalah sebagai berikut :
ampas tahu dan CaCO3 disterilkan secara terpisah dari urea, limbah cair
tahu, dan trace alement. Bahan-bahan medium yang lain dicampur diatas
pemanas berpengaduk. Setelah itu didinginkan sampai 50 0C dan pH
diatur hingga 7,2. Kemudian medium dibagi-bagi dalam beberapa labu
erlenmeyer. Ampas tahu + CaCO3 dan limbah cair tahu disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah steril dan dingin, ampas
tahu + CaCO3 dan limbah cair tahu dicampurkan menjadi satu sesuai
formulasi yang ditentukan kemudian ditambahkan bahan-bahan lain secara
aseptik.

b. Kultivasi
Kultivasi Bt subsp. aizawai dilakukan secara curah dengan kondisi
kultivasi sebagai berikut : kultivasi dilakukan dalam labu erlenmeyer 250 ml
pada suhu 28 32 0C, pH awal medium diatur pada 6,5 7,5, volume
medium fermenntasi 50 ml, diinkubasi menggunakan rotary shaking
incubator dengan kecepatan 180 rpm, dan dipanen pada waktu inkubasi 30
jam dan 48 jam. Kultivasi dilakukan dua kali ulangan dengan kondisi
kultivasi yang sama antara ulangan I dan ulangan II.
Tabel 5. Perlakuan pada kultivasi Bta
Sandi
Medium
A

Sandi Medium
Kultivasi
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3

Jumlah Stater yang

Ditambahkan
10 % (v/w)
15 % (v/w)
20 % (v/w)
10 % (v/w)
15 % (v/w)
20 % (v/w)
10 % (v/w)
15 % (v/w)
20 % (v/w)

20

c. Pemanenan
Pemanenan (recovery) hasil kultivasi dilakukan pada waktu akhir
inkubasi, yaitu pada jam ke-30 dan jam ke-48. Kemudian dilakukan analisis
pH, total mikroba, jumlah spora hidup, total gula sisa, dan toksisitas.
Prosedur analisa dapat dilihat pada Lampiran 1.

Gambar 7. Diagram alir proses produksi bioinsektisida

d. Penentuan Toksisitas Produk (Bioassay)

Penentuan jumlah spora hidup yang terkandung dalam produk
bioinsekktisida atau campuran spora-kristal hasil kultivasi dan pengujian
toksisitasnya terhadap larva Croccidolomia binotalis yang dinyatakan dalam
LC50 dengan metode bioassay. LC50 dapat ditentukan dengan menggunakan
analisis probit program Probit Quant (software dari Steve Maund,
University of Wales, College of Cardiff, Inggris).

3. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial dengan dua kali ulangan. Rancangan
Acak Lengkap Pola Faktorial adalah rancangan acak lengkap yang terdiri dari
dua peubah bebas (Faktor) dalam klasifikasi silang yaitu faktor A (konsentrasi
ampas tahu dan limbah cair tahu sebagai substrat) yang terdiri dari 3 taraf dan
21

faktor B (konsentrasi starter yang digunakan) yang terdiri dari 3 taraf dan
kedua faktor tersebut diduga saling berinteraksi. Saling berinteraksi
dimaksudkan bahwa pengaruh suatu faktor tergantung dari taraf faktor yang
lain, dan sebaliknya jika tidak terjadi interaksi berarti berarti pengaruh suatu
faktor tetap pada setiap taraf faktor yang lain. Jadi bila tidak terjadi interaksi
antar taraf-taraf suatu faktor saling sejajar satu sama lainnya, sebaliknya bila
ada interaksi tidak saling sejajar
Model rancangan percobaan pada penelitian utama menggunakan dua
faktor yaitu faktor konsentrasi substrat yang terdiri dari 3 taraf, yaitu
perbandingan ampas tahu dan limbah cair tahu 20 : 80, 30 : 70, dan 40 : 60
serta faktor konsentrasi starter yang terdiri dari 3 taraf, yaitu 10, 15, 20 % (v/v)
dan kedua faktor tersebut diduga saling berinteraksi. Model yang digunakan
adalah sebagai berikut :

Yij

+ i + j + i j + ij (Hanafiah, 2005)

Keterangan :
Yij

Variabel respon karena pengaruh faktor konsentrasi gula taraf

ke i dan faktor konsentrasi starter taraf ke j

Efek rata-rata yang sebenarnya

Efek dari taraf ke i konsentrasi gula

Efek dari taraf ke j konsentrasi starter

ij

Efek dari interaksi antara taraf ke i konsentrasi gula dan taraf

ke j konsentrasi starter

Data yang diperoleh dari pengukuran parameter, masing-masing

dianalisis menggunakan analisis ragam uji F. Apabila hasilnya menunjukkan
perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil
(LSD).

22