RANGKUMAN KIMNAL

refleksi

refraksi

SPEKTROFOTOMETRI
ISTILAH:
1. Spektroskopi
Ilmu yg mempelajari interaksi radiasi dan
materi
2. Spektrofotometri
Pengukuran kuantitatif dari interaksi
radiasi elektromagnetik pada 1 atau lebih
panjang gelombang dengan suatu detektor
3. Spectrum
Tampilan dari intensitas radiasi
teremisikan, absorbs, atau hamburkan oleh
sampel vs kuantitas energi foton (E),
panjang gelombang () atau frekuensi (v)
4. Radiasi elektromagnetik (RE)
Bentuk energi yg ditransmisikan melewati
ruang dengan laju yg besar bersifat
dualism (bisa sbg gelombang atau partikel
energi/foton)
Bisa disebut sbg cahaya dlm daerah uv-vis
Sifat sbg gelombang:
a. Memantul/ reflection
b. Membias/ refraction belok
c. Berinterferensi/ interference ganggu
d. Berdifraksi/ diffraction pecah

BAGAIMANA RADIASI DAN MATERI

BERINTERAKSI?
1. Merubah SPIN
a. NMR
b. ESR
2. Mengubah arah orientasi electron
Gelombang micro
3. Mengubah konfigurasi
IR
4. Mengubah distribusi electron
a. UV-VIS
b. X-Ray
5. Mengubah konfigurasi nuclear/ inti
G-ray
TIPE SPEKTROFOTOMETRI
1. Berdasarkan jenis radiasi
Sinar X, UV, VIS, IR, NMR
2. Berdasarkan interaksi
Asorbsi UV, VIS, AAS
Emisi flurometri, difraksi sinar X
PENYERAPAN SINAR

Po
p
T = P/Po
HUKUM LAMBERT-BEER
5. Panjang gelombang ()
Jarak antar dua puncak gelombang
6. Frekuensi (v)
Jumlah gelombang yg melintasi satu titik
tertentu selama waktu tertentu

makin kecil E makin besar Frekuensi

besar
INTERAKSI RADIASI DAN MATERI
Fenomena gelombang refraksi dan refleksi
Fenomena energi absorbs dan emisi
absorbs

transmisi

1 F24110096

emisi

A = absorbansi
a = absorptivitas
= absorptivitas molar = a x MR
b = tebal kuvet biasanya 1cm
PENYIMPANGAN HUKUM LAMBERT BEER
Ketidaklinearan hubungan konsentrasi
dengan serapan/ absorbansi
Penyebab :
1. Sebab kimia
a. Ionisasi
Hb H+ +BPencegahan : menggeser
kesetimbangan kea rah bentuk yg akan
diukur.
Jika yg diukur HB, maka larutan dalam
keadaan asam. Jika yg dikur B- maka
tambahkan basa. Karena OH dari basa

bereaksi dengan H+ akan membentuk

H2O yang tidak memberikan
absorbansi.
b. Hidrolisis
Pencegahan : menggeser
kesetimbangan kea rah bentuk yg
diukur. Misal dalam Cr2O7, maka
ditambahkan asam.
c. Pengompleksan

2. Sebab instrument
a. Radiasi tidak monokromatis
Jika nilai lebih dari 1 a beragam
b. Kelelahan alat
Kebanyakan dipake -______- #
3. Sebab nyata
a. Larutan terlalu encer
Efek penjenuhan sinar, shg radiasi tdk
terserap
b. Larutan terlalu pekat
Interaksi antar partikel kuat,
penyerapan terganggu
SPEKTRUM ABSORBSI DAN TRANSMISI

ASPEK
Saat
maks
Sumbu y

ABS
maksimu
m
A

%T
Minimum
%T

INSTRUMENTASI
Sumber sinar pemilih kuvet detector
pengolah sinyal skala/perekam/unit digital

WADAH CUPLIKAN
Material harus transparan, biasanya lebar/
diameternya 1cm.
Utk UV kuarsa
Vis kuarsa, kaca
IR NaCl, AgCl, KBr
PEMILIH PANJANG GELOMBANG
1. Filter optic radiasi yg tidak diinginkan di
blok memilih 1 utk diteruskan ke kuvet
a. Filter absorbs terbatas utk sinar vis,
menurunkan %T
b. Filter interferens %T tinggi, pita
sempit
2. Monokromator mendispersi radiasi dan
memiliki pita yg diinginkan
Bagian2nya :
a. Celah masuk mempersempit radiasi
yg masuk
b. Lensa kolimator mengubah sinar
menjadi berkas sinar sejajar
c. Media pendispersi prisma
(pembiasan) sinar dibiaskan
dengan kisi/grating (pemantulan)
d. Lensa fokus mefokuskan sinar ke
celah keluar
e. Celah keluar mengisolasi sinar yg
diinginkan utk melewat kuvet

3. Interferometer modulasi pd frekuensi

berbeda
Digunakan transducer/ detector yg
mengkonversi kuantitas fisik/ kimia
menjadi sinyal listrik, voltase, atau arus
Syarat tranducer:
a. Sensitivitas tinggi
b. Noise rendah
c. Respon besar
d. Output linear

TIPE SPEKTROFOTOMETER UV-VIS

1. Single beam

Sinar mengenai 1 sampel dalam kuvet

2. Double beam in space

SUMBER SINAR
utk UV-Vis deuterium, tungsten, atau Xe lamp.

2 F24110096

Sinar akan mengenai beam splitter utk

dibagi cahanya dan mengenai reference

cell (blanko) untuk dideteksi oleh detector

yg berbeda dan dibaca di amplifier
3. Double beam in time

2. karena relative error diatas 80%T dan

dibawah 20%T itu besar banget
kesalahan pengukuran jg besar

Sinar akan dibagi di beam chopper,

kemudian akan mengenai reference cell
dan sampel cell, dan langsung dikoreksi
oleh hanya 1 detektor sebelum masuk ke
amplifier
4. Multichannel
BLANKO, ANALAT DAN STANDAR
Utk digunakan dalam mencari maks.
Dimana sinar akan terbagi menjadi
beberapa dengan grating, kemudian
dicari abs terbesar utk mengetahu
maksnya.
APLIKASI SPEKTROFOTOMETER UV-VIS
Analisis kualitatif tidak berguna karena pita
melebar info yg didapat sedikit
Analisis kuantitatif sensitifitas baik (limit
deteksi 10-4 sampai 10-6), selektif, speksifik,
ketepatan cukup baik, sederhana dan murah
Utk analisis kuantitatif HARUS KERJA DI MAKS!
respon sinyal (absorbansi) berada dalam
kondisi maks sensitifitas baik, limit deteksi
rendah, kesalahan tereduksi
*limit deteksi = konsentrasi terkecil yg dpt diukur/
dibaca oleh sebuah alat
*pengukuran ABS yg baik pada 20-80%T
KENAPA?
1. kalo diukur pd konsentrasi rendah
perubahan kecil konsentrasi menyebabkan
perubahan %T yg besar. sebaliknya kalo
pada konsentrasi yg gede, perubahan %T
nya kecil

3 F24110096

Blanko
-isinya pelarut dan pereaksi, tanpa analat
-diperlakukan sama
Abs analat sesungguhnya = Abs analat terbaca
Abs blanko
Analat
Zat yg dianalisis harus berwarna agar dapat
diukur di sinar tampak
Cara :
a. oksidasi reduksi
kayak titrasi pake KMnO4 dimana ketika
kelebihan pereaksi setetes dapat
menyebabkan warna pink hilang jadi tak
berwarna. Hal tsb karena MnO4- (pink)
berubah menjadi Mn2+ (tak berwarna)
b. kompleks
Fe+SCN- (FeSCN)2+ merah
Pd2+ + I- (PdI4)2- (kuning)
c. gabungan keduanya
Standar
Zat/ larutan yg mendapat perlakuan sama spt
analat, tp konsentrasinya sudah diketahui
Biasanya dibuat persamaan regresi dengan
memplotkan konsentrasi (sb x) dan absorbansi (sb
y)

alatnya udah cape, dan abs nya hrus

dikoreksi.

Kalo di kalkulator, b (slope/m), dan a (intercept)

Kurva standar yg baik biasanya dilihat dari nilai R
nya. Jika makin mendekati 1, maka semakin baik.

METODE PENGUKURAN
Metode
%T
serapan
20%-80%
normal
serapan
<20%
tinggi
pekat bgt
Renik
>>> 80%
encer bgt
ketelitian Sejumlah
tinggi
alat
menunjukk
an T atau A
sangat
berdekatan

blanko
0

C2

=0

=0

=0

r koefisien korelasi deviasi dari tiap titik

dengan titik pd garis lurus
R kuadrat dari koefisien korelasi kisaran 0-1
TIPE KALIBRASI
1. Kalibrasi eksternal
a. Dibuat std eksternal 2,5,10 ppm
kyk yg biasa kita lakuin di lab
b. Sensitivitas (sinyal/kosentrasi) std =
sampel
c. Sinyal hanya karena analat
d. Tidak memperhitungkan matriks
sampel (ada gangguan dr zat lain) dan
instrumental drift (kelelahan alat)

*metode ini udah jarang dipake, karena ribet.

Biasanya kalo %T nya ketinggian atau
kerendahan, bisa diencerkan atau dipekatkan aja.
TITRASI SPEKTROFOTOMETRI

2. Standar adisi
a. Ditambahkan sejumlah standar
kedalam sampel
b. Sinyal diukur sbg fungsi dari
konsentrasi std yg ditambahkan
c. Memperhitungkan matriks sampel, tp
gak instrumental drift
Jadi, absorbansi sampel sudah
terkoreksi karena std jg sudah
ditambhkan ke dalamnya.
Co/ mau ngukur kandungan Fe dalam
bayam, maka dibuat std Fe, dan
ditambahkan ke dalam sampel.
3. Standar internal
a. Senyawa lain ditambahkan ke dalam
std dan sampel secara kimia mirip
analat
b. Mengkoreksi drift dan efek matriks
Biasanya kalo udh tau absorbansi pada
waktu tertentu, misal 1 jam, kalo tiba2
pengukurannya ga segitu, berarti

4 F24110096

T = titran
A = analat
P = produk
Penjelasan :
a. Contohnya adalah titrasi KMnO4 dengan
asam oksalat. Awalnya, produk dan analat
tidak berwarna (=0) dan titran berwarna
(>0)

Ketika analat bereaksi dengan titran

membentuk produk tetap tidak
berwarna grafik absorbance lurus
Namun ketika di titik dimana semua analat
habis bereaksi, dan terjadi kelebihan titran
yg berwarna, grafik absorbance mulai naik
larutan akhirnya berwarna sesuai warna
titran.
b. Pada titrasi ini produk lah yg berwarna,
titran dan analat tidak berwarna. Sehingga
ketika titran dan analat bereaksi
menghasilkan produk, intensitas warna
terus naik. Hingga dititik dimana produk
tidak lagi dihasilkan, hanya ditambahkan
terus titran, intensitas warna akan stabil
(grafik lurus)
c. Pada titrasi ini, analat berwarna, produk
dan titran tidak berwarna. Sehingga
awalnya larutan berwarna dan intensitas
terus menurun karena terbentuknya
produk yg tidak berwarna. Intensitas warna
akan mencapai titik stabil ketika tidak ada
lagi produk yg dihasilkan.
d. Pada titrasi ini, produknya tidak berwarna,
namun titran dan analat berwarna. Hal ini
menyebabkan intensitas warna terus turun
hingga satu titik, lalu ketika tidak ada lagi
produk yg dihasilkan, grafik akan kembali
naik disebabkan penambahan warna dari
titran.
e. Pada titrasi ini, produk dan titran berwarna,
sementara analat tidak berwarna. Awalnya
intensitas warna akan terus naik seiring
dengan terbentuknya produk yg berwarna,
namun di suatu titik, warnanya akan naik
bukan karena warna produk, tp karena
warna titran. Dikarenakan T> p kurva
tittran lebih curam dibanding produk.
f.

Pada titrasi ini, produk dan titran berwarna,

analat tidak berwarna. Prinsipnya sama
dengan poin e, hanya saja p> T.
Sehingga kurva produk lebih curam
dibanding titran

SPEKTROSKOPI UV
ISTILAH:
1. Kromofor
Kelompok electron yg menghasilkan
serapan radiasi.

5 F24110096

2. Auxocrome
Substituent yang meningkatkan intensitas
absorpsi dan memungkinkan berubah.

PELARUT
Syarat :
1. Transparan thd yg digunakan
a. Harus diatas cut off air agar tidak
terganggu. Nilai yang menghasilkan
=1
b. Tanpa konjugasi
2. Pengaruh thd pita absorpsi dan maks

Perbedaan isooktana 3 puncak

Etanol 1 puncak
Akan lebih baik 3 puncak karena pita
absorpsi nya lebih sempit, dan maks
lebih akurat
3. Pengaruh maks
a. Blue shift : - *
b. Red shift : n- *
PENGARUH SUBSTITUSI
1. Efek bathokromik (red shift)
Pergeseran ke tingkat energi yg lebih
rendah nya naik
2. Efek hipsokromik (blue shift)
Pergeseran ke tingkat energi lebih tinggi
nya turun
3. Efek hiperkromik
Intensitas naik karena adanya substituent
auxocrome
4. Efek hipokromik
Intensitas turun
APLIKASI
1. Pemantauan hasil fraksinasi dengan
kromatografi
2. Analisis kuantitatif komponen
a. VIS : karoten, klorofil, gula, AA, dll
b. UV : senyawa aromatic, AA kedelai
c. Penentuan aktivitas enzi

KROMATOGRAFI
Artinya pemisahan komponen dalam contoh
dgn distriusi komponen pd 2 fase yg tdk saling
campur (fase diam dan fase gerak)
Kroma warna , graphy menulis
*Bagian A terdiri dari 4 spot, yakni 5, 2, 1, dan 3.
Klasifikasi kromtografi
Kemudian setelah elusi ke 2, terjadi pemisahan
1. Berdasarkan fase gerak dan fase diam
pada 3 -- 6 dan 14.
Fase diam
Fase gerak
Kromatografi*Bagian B terdiri dari 6 bagian pd elusi 1, dan 1
Padat
Cair
LSC
bagian yg terpisah pada elusi 2
Gas
GSC
*bagian C terdapat 7 spot pada elusi 1, dan 3 spot
cair
Cair
LLC
yg terpisah pada elusi 3
gas
GLC
2. Berdasarkan interaksi
a. Adsorbs
b. Partisi
c. Pertukaran ion
d. Permease/ filtrasi
3. Berdasarkan bentuk ruang penyangga
a. Planar : kertas, TLC
b. Kolom : KCKT, GC,
TUJUAN ANALISIS
1. Kualitatif ada std. yg dibandingkan Rf
(planar) Reterdation Factor, atau tR
(kolom) waktu retensi
2. Kuantitatif planar (spektro), kolom (luas
kurva)

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Deteksi dengan UV, dan dengan pereaksi
Peralatan tabung kromatografi, dan lempengan
Teknik ascending
Tujuan analitis, preparative, mencari eluen
terbaik
Eluen terbaik : menghasilkan spot terbanyak dan
terpisah

*Analitis identifikasi komponen

Preparative bagian dr isolasi dan pemurnian
komponen
KROMATOGRAFI PLANAR
Sistem terdiri dari:
1. Fase diam : kertas, lapis tipis
2. Fase gerak : tunggal, campuran
3. Jarak start finish
4. Waktu
5. Rf

Tahap pemilihan : eluen polar dan non polar

kesimpulan sifat zat campuran eluen
Adsorben :
1. Polaritas relative
Kekuatan utk mengadsorpsi spesies
tertentu

*dilakukan penjenuhan utk melancarkan gerak

eluen selama elusi cara ditutup rapat selama
10-15 menit

2. Kapasitas adsorbs
Jumlah gram solute yg dpt diadsorbsi per
gram alumina

KROMATOGRAFI KERTAS
-Mekanisme :
1. Adsorbs kertas
2. Partisi air air di kertas eluen
-Arahnya descending (turun) dan ascending (naik)
-Deteksi : pewarnaan (semprot, celup, uapi,
gabungan)
-Rf = jarak komponen/ jarak eluen

3. Jenisnya : anorganik dan organik

Alumina, kiesel guhr (asam silikat), fosfat,
kalsium sulfat, karbon aktif, selulosa, pati,
manitol, dekstran

6 F24110096

KROMATOGRAFI KOLOM
1. Mekanisme
a. Partisi
b. Adsorpsi

c. Eksklusi
d. Pertukaran ion
2. Sistem pemberian fase gerak
a. Frontal
Sampel kolom adsorben jenuh
+sampel kolom yg paling lemah
teradsorbsi, turun + sampel dst

-tidak memisahkan komponen

-memberikan gambaran afinitas
berbagai zat thd adsorben
b. Pergeseran
Fase gerak : larutan zat yg lebih kuat
teradsorbsi dibandingkan komponen
sampel
A digeser B, B digeser C, C digeser D
urutan keluar dr kolom a, B, C, dan D

Syarat :
1. Kolom tidak kelebihan beban solute
2. Efek difusi sekecil mungkin
a. Pengepakan kolom
b. Peningkatan laju
3. Adsorpsi dan desopsi dr fase diam hrus
cepat
4. Distribusi solute antara 2 fase berubah
linear
Sistem elusi
1. Elusi isokratik hanya 1 jenis
2. Elusi gradient berubah komposisinya

Parameter Kromatografi Kolom

1. Koefisien partisi (K) = Cs/Cm
Cs = [A]s
Cm = [A]m

c. Elusi

2. tR (waktu retensi)
waktu yg dibutuhkan molekul yg tertahan
pd fase diam utk mencapai detector
setelah injeksi
3. tm (waktu mati)

7 F24110096

waktu yg dibutuhkan molekul yg tidak

tertahan pd fase diam utk mencapai
detector setelah injeksi
4. Vr (volume retensi)
Volume fase gerak yg dibutuhkan utk
menggerakkan molekul dari injeksi hingga
detector
5. W (baseline width)
Lebar pita senyawa yg terukur pd garis
dasar

Biasanya terganggu karena:

1) Difussi eddy (a) ketidakterturan
kemasan, keragaman jalur partikel
dlm kolom
2) Difusi molekul (b) difusi zat dlm
carier gas pita melebar
efisiensi menurutn
3) Tahanan td alih massa (c) waktu
yg diperlukan utk kesetimbangan
zat dlm 2 fase

10. Resolusi

menggambarkan keterpisahan dua

buah pita atau puncak

R =1 3% overlap
R = 1.5 0.2% overlap
Panjang kolom jadi 2x lipat R jadi akar 2.

KROMATOGRAFI GAS
6. Rerata laju migrasi linear solute = V = L/tR
L = panjang kolom
7. Faktor kapasitas

menggambarkan laju migrasi

sampel/solut pada kolom

K = 1-5 jika k<1 maka elusi terlalu

cepat. K>1 elusi telalu lambat
8. Faktor selektivitas

kemampuan memisahkan komponen

dari suatu kolom (selektivitas kolom)

PRINSIP PEMISAHAN
Fase gerak
Fase diam
Gas inert
tidak terjadi
interaksi dgn
analat

Solid retensi
analat
tailing pd peak
Cair baik

Sampel berupa gas, senyawa volatile, atau zat yg

dapat diupkan, stabil panas, dan umumnya
nonpolar.

gambaran kuantitatif efisiensi kolom

untuk memisahkan komponen (jumlah
plat teoritis)
a. Jumlah lempeng teoritis (N)

8 F24110096

GLC

Prinsip : Partisi analat antara fase gerak gas

dengan fase diam berupa cairan yg diimobilisasi
pada permukaan solid yg inert

9. Efisiensi kolom

b. HETP / JSPT (Jarak setara dengan pelat

teoritis)
HEPT = L/N

Kromatogra
fi
GSC

Instrumentasi :
1. Gas pembawa

2.

3.

4.

5.

a. Inert helium, nitrogen, hidrogen

b. Ada filternya
c. Diatur oleh pressure regulator dan flow
controller
d. Pengukur laju alir gas itu rotometer
(terletak di colom head, dan soap
bubble meter/ flow meter yg terletak di
ujung kolom.
Sampel
a. Injeksi sampel dengan microsyringe
b. Volume sampel Kolom kapiler 10-3 L
Kolom biasa 10 sampai 20 L
Kolom
a. Ditempatkan di oven
b. Tipenya kolom kemas (koil, ukuran 60100 mesh, dibuat dr
gelas/alumunium/stainless steel/
tembaga)
c. kolom kapiler (2m-50m dibentuk koil
dari stainless steel, gelas, plastic,
alumunium, dan Teflon) WCOT (wall
coated open tubular) fase diam pd
dinding kapiler- dan SCOT (support
coated open tubular)-dinding kapiler
dilapisi support material dan fase diam
dilapiskan pada support material tsb
Fase diam
a. Volatilitas rendah
b. Td minimal 100oC atau diatas suhu
kolom
c. Stabil scr termal
d. Inert secara kimia
e. Memiliki k dan yg sesuai dgn solute
yg dipisahkan
f. Contohnya apiezon L, OV101 (dimetil
silicon), OV3, OV17 (50% phenildimetil
silicon), Desil 300, carbowax 20M
(polyetilen glikol)
Detektor
Karakteristik detector sensitive, stabil,
respon linier, suhu min dr suhu ruang
sampe 400oC, mudah dan hasil dpt
dipercaya
a. FID (flame ionization)
Effluent keluar kolom campur
hydrogen dan udara dibakar ion
nya pnya arus listrik
b. TCD (thermal conductivity)
Perubahan konduktivitas termal gas
analat ada!
c. SCD (sulfur chemiluminescence)
Reaksi sulfur dlm analat thd ozon.
Luminescence = [sulfur]
d. ECD (electron capture)
Penangkapan electron dr emitter analat
arus turun
e. AED (atomic emission)
Pengukuran spectra emisi molekul
sampel

9 F24110096

ASPEK KUALITATIF
1. Menentukan kemurnian senyawa organik
klo ga murni nnti ada peak tmbahan
2. Efektivitas prosedur permunian zat
3. Identifikasi komponen dlm campuran tR
ASPEK KUANTITATIF
1. Pake volume retensi

VM = tMF
V : Volume retensi
t : Waktu retensi R untuk spesi yang
ditahan, M untuk spesi yang tidak ditahan
F : Laju alir rata-rata volumetrik
2.

=
t RB =
=
tM (tR)B
KB
tRA -(tR)A
KA
tM
ELEKTROFORESIS
Adalah metode pemisahan berdasarkan laju
migrasi pada suatu medan listrik PEMISAHAN
FASE TUNGGAL
Dipengaruhi oleh :
a. Jumlah dan keadaan gugus yg dpt diionkan
b. pH lingkungan
c. keberadaan ion lain
Teknik
1. single phase

a. friksi molekuler
b. elektrostatis
2. dual phase
a. adsorpsi
b. solubilitas
c. pengikatan logan
d. interaksi ionic
Frictional force (gaya gesek) F (gaya
elektroforetik) > gaya gesek (fv) agar dpt
bergerak
Bergerak F>fv
Stesy state F=fv
Teori lapis ganda Helmholtz
Ion dalam larutan dikelilingi oleh ion yg berbeda
muatan.

F m.a

d 2V
dt 2

Eq
q
E konstan V
f
f
q

E = medan listrik (volt/cm)

q = muatan bersih partikel
f = koefisien hambatan massa bentuk
V = kecepatan molekul

Medan listrik
F=fze
z koefisien hambatan
F jari-jari bentuk molekul
Contoh untukmolekul yang bulat

10 F24110096

Hukum Stoke F = f = 6 R v
Peralatan pertama kal Tiselius tidak ada
pembentukan endapan pada elektroda
elektrolisis tidak lengkap (elektroforesis)
Tehnik elektroforesis zona :
1. medium kertas
a. selulosa biasa OH- pada kertas
cenderung menyebabkan air pada
buffer (medium) bermuatan positif
efek osmosis
menyebabkan pula molekul2 kecil yg
memerlukan voltase tinggi efek
panas buffer menguap mobilitas
berubah efek difusi
b. selulosa asetat
OH- nya diikat oleh asetat. Efek
osmosis hilang, efek difusi masih ada.
Sehingga diperbaiki dengan gel
2. gel
a. alami ukuran tidak seragam. Efek
difusi diatasi karena gel lebih kaku
b. buatan poliakrilamida, agarosa
jika [ ] tinggi ukuran pori kecil
Fungsi medium
a. reseptor spot dari zat terlarut
b. menyediakan jalur migrasi komponen
Sistem terdiri dari :
a. medium
b. buffer konduktor arus Jembatan
konduksi antara 2 elektroda shg
memungkinkan aliran medan listrik
Aplikasi contoh
a. cara kering spot baru basahi spot bisa
lebih kecil dan pekat
b. cara basah basahi dlu baru spot
jembatan konduksi sudah terbentuk
Faktor yg memperngaruhi pemisahan
1. voltase yg digunakan dan pengaruh termal
2. konsentrasi buffer jika [ ] buffer naik
mobilitas ion turun konduktivitas naik
pemanasan dan efek termal naik
pemisahan tidak baik
3. pH buffer
hati2 utk zat ampiprotik AA ketika
mencapai PI akan netral dan tidak
bermuatan
4. pengaruh elektrostatik
perbedaan muatan karena beda zat
5. pengaruh difusi
ketika ukuran besar, difusi lebih besar
ELEKTROFORESIS GEL DISKONTINU
1. dua konsentrasi gel
a. stacking gel atas, pori2 lebih besar,
poliakrilamida 5%

b. separation gel bawah, pori2 lebih

kecil, poliakrilamida 7,5%
2. terdapat 2 nilai buffer
a. gel atas 6,7
b. gel bawaqh 8,9
PROSES PEMISAHAN

1
2

_
_

4
_

+
43 21

SDS bereaksi dengan sisi hidrofobik protein

dengan perbandingan teratur
Sehingga molekul protein akan membawa
muatan yang berasal dari SDS, dengan
ekor molekul protein yang mempunyai
beragam BM
Sehingga dengan cara ini sampel akan
mempunyai muatan yang sama tetapi BM
nya berbeda. Dengan teknik ini kita dapat
memisahkan protein berdasarkan BM
~ massa dari protein
besar jalur migrasi pendek
kecil jalur migrasi panjang

Log BM

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI
Prinsip pemisahan
Fase gerak cairan
Fase diam cair/ padat
Berbeda karena:
1. Sensitive tinggi
2. Analisis kuantitatifnya akurat
3. Hasil pemisahannya baik

11 F24110096

Tehnik pemisahan yg mendasari HPLC

1. Partisi
Berdasarkan distribusi analat dalam fase
diam dan fase gerak
a. Normal phase
Fase diam polar
Fase gerak non
b. Reverse phase
Kebalikannya aja dr yg diatas ^^
2. Adsorbsi
Berdasarkan keterjerapan analat dalam
fase diam. Biasanya fase diam nya
alumina/ silica
3. Pertukaran ion
Co/ Asam amino, anion, kation sampel
hrus bisa mengion.
Fase diamnya resin penukar ion/ kation
4. Size exclusion
Dikenal dgn permeasi/ filtrasi gel, yaitu
misahin berdasarkan ukuran. Yg keluar
duluan yg gede, karena ga terjerap di gel
nya.
Instrumentasi
Fase gerak yg berupa cairan ada dalam botol2
reservoir, yang harus selalu penuh dan di
selangnya ga boleh keisi udara, karena kalo ada
udara akan merusak pompa.
Fase gerak tsb kemudian disedot dengan pompa,
lalu dialirkan ke pulse dump/ degasser untuk
menghilangkan gas2 terlarut dalam cairan.
Setelah itu dialirkan menuju filter untuk disaring,
masuk ke dalam kolom untuk melakukan
pemisahan, dan hasil peak nya dibaca di detector.
Reservoir
Dilengkapi dengan degasser untuk
menghilangkan gas terlarut. Gas perlu dihilangkan
agar tidak membentuk gelembung pada kolom,
tdk menyebabkan pelebaran kurva, dan tidak
menganggu detector.
Fase gerak
1. Elusi isokratik 1 jenis eluen
2. Elusi gradient ada komposisi eluen dgn
berbagai kepolaran, dan perbandingan
tertentu memperbaiki efisiensi
pemisahan
Pompa
Syarat :
1. Tekanan tinggi
2. Output tekanan bebas pulsa
3. Laju alir antara 0,1-10 mL/detik
4. Kontrol laju alir dan reproduktabilitas baik
5. Tahan korosi

Jenis pompa:
1. Resiprok gerakan maju mundur piston
Keuntungan : tekanan tinggi, bisa dipake
utk elusi gradient, laju alir konstan
Kekurangan : aliran memiliki pulsa
2. Displacement pump kayak syringe besar
(ada chamber dan penyedotnya)
Keuntungan : aliran bebas dr viskositas
eluen
3. Pneumatic pump/ pompa angin
Keuntungan: bebas dr pengaruh viskositas
eluen
Kerugian : ga bisa utk elusi gradient,
tekanan kurang dr 2000psi
Sistem injeksi sampel
Awalnya diinjeksikan dgn syringe melalui septum
elastomeric reproduktabilitasnya buruk!
digunakan sistem loop.
Kolom
1. Kolom kemas
2. Kolom kapiler
3. Kolom preparative
Guard kolom utk menyingkirkan kontaminan
dlm eluen dan matriks sampel yg tdk sesuai dgn
kolom. Bertujuan utk memperpanjang umur
kolom.
Thermostat kolom menjaga suhu operasi kolom
Detector
Syarat:
1. Sensitive
2. Stabil
3. Respon linier
4. Respon cepat dan terbebas dr laju alir
5. Mudah, hasil dpt dipercaya
Tipe detector:
1. Bulk property detector respon thd sifat
dr fase gerak (indeks refraktif, konstanta
dielektrik, dan densitas)
2. Solute property detector respon thd sifat
analat (absorbansi, fluorescence)
Contoh detector:
1. Detector absorbansi
a. UV berfilter dilengkapi filter panjang
gelombang
b. UV bermonokromator Ada gratting
c. IR
2. Detector fluoresen
3. Indeks refraktif
4. Elektrokimia Amperometri, polarografi,
kolorimetri, dan konduktometri
5. Spektroskopi massa (MS)
Ratio masa thd muatan suatu ion. Ketika
senyawa ditembakkan dan berubah

12 F24110096

menjadi ion, lalu dipilah berdasarkan BM

nya, dan akan menghasilkan spectrum
pada detector.
Perkembangan metode analisis
Utk memperbaiki efisiensi kolom
a. Memperpanjang ukuran kolom
b. Mengurangi partikel pengisi kolom (H
diperkecil)
c. Mengoptimalkan laju alir fase gerak
Tandem HPLC dengan MS
Karena info dari detector UV kurang akurat/
terbatas, senyawa nya juga yg bisa didetect
sederhana tehnik spektrometri yg melakukan
scanning cepat dan akurat thd molekul yg
dipisahkan spektrometri massa
Klo GC-MS kan mudah karena fase geraknya gas,
lah kalo di HPLC kan cairan, trus gimana?
digunakan kolom kapiler shg
fase gerak yg masuk ke dalam sumber ion sedikit.
Fase gerak masuk ke kolom interface (suhu
naik) diuapkan analat nya diionisasi diukur
di detector
*fase geraknya harus mudah disingkirkan di
interface dan stabil thd suhu agar tdk bereaksi
dgn komponen.
Sumber ion
1. Elektron impact (EI)
Dihasilkan filament panas bereaksi dgn
molekul analat ion analat yg tdk stabil
dipisahkan di spektrometri massa
2. Chemical ionization (CI)
Digunakan gas (metana/ isobutana) ion
gas menyerang molekul
3. Field ionization (FI)
Ionisasi pd daerah tsb.
Interface pada HPLC
1. Moving belt
2. Thermospray
3. Atmospheric pressure ionization
4. Electrospray
5. Particle beam
Aspek kualitatif
1. Digunakan utk menentukan kemurnian
suatu zat. Biasanya kalo ga murni ada
peak tambahan.
2. Mengukur efektivitas pemurnian zat
3. Identifikasi komponen dalam campuran
dgn tR
Aspek kuantitatif
1. Extra column band broadening

Pelebaran kurva karena perbedaan laju alir

antara bagian tengah dgn yg deket dinding
kolom
2. Efisiensi kolom
Diameter dikurangi, ukuran partikel fase
diam perlu dikecilkan tinggi pelat teoritis
makin kecil (H) jumlah pelat nya makin
banyak, laju alirnya makin tinggi KECE
PARAH! :3
N = 3500 L / dp
N = jmlh pelat teoritis
L = panjang kolom (cm)
dp = diameter partikel fase diam
(micrometer)
3. Resolusi komponen
Menggambarkan keterpisahan dua buah
puncak.

4. Faktor kapasitas

K = 1-5 jika k<1 maka elusi terlalu

cepat. K>1 elusi telalu lambat
5. Faktor selektivitas

3. Kolom kapiler nya itu silica, yg

permukaannya bermuatan negative
efek elektroosmotik
O

Si

Si

OH

OH

Si

Si
OH

Na
Na

OH

Cl

OH

Cl
Na
OH

Si

OH

Si

Si
OH

Na

Na
O

Si

Cl

Na

Na

Si

O
Na

OH

Na

Na
OH O

OH

Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
O Si O Si O
O
O
O
O
O
O
O

Karena silica negative, maka molekul2

analat yg paling cepet terpisah itu yang
positif. Kenapa? Karena kan molekul
positifnya udah berikatan tuh, nah kalo
berdasarkan prinsip double layer
Helmholtz, molekul positif yg udah nutupin
silica, harusnya iketan lg sama yg negative
(dr analat), makanya molekul negative
ketahan lebih lama, dan molekul positif
keluar lebih cepet.
Misal nih, kita punya muatan -1, -2, 0, +1,
+2, maka yang akan keluar duluan itu +2,
+1, o, -1, baru terakhir -2.
4. Sistem injeksi disini ada 2, yaitu:
a. Injeksi hidrodinamik bantuan
tekanan
Volume injeksi
PENTING NIH! Biasanya keluar di soal.
Hehe :3
Volume sampel yg diinjeksikan pd
sistem hidrodinamik dihitung dengan
cara :

ELETROFORESIS KAPILER
Merupakan gabungan GC dan elektroforesis
Dimana
P adalah perbedaan tekanan (Pa)
d adalah diameter kapiler bagian
dalam (m)
t adalah waktu menggunakan (det)
adalah viskositas buffer (kg m1s1),
L panjang tabung kapiler. The fact (m)
103 merupakan faktor konfersi m3 ke
liter.

Penjelasan:
1. Komponen dalam campuran ada di tabung
kapiler (yg warna biru terang), ada
potensial DC juga yg ngalir sepanjang
tabungnya.
2. Molekulnya gerak, dimana ukuran, muatan,
dan bentuk molekul analat yg kita pisahin
berpengaruh thd mobilitas elektroforetik

13 F24110096

b. Injeksi elektrokinetik bantuan arus

listrik
Mol solute yg diinjeksikan pada sistem
elektrokinetik

Dimana
C adalah konsentrasi solut
t adalah waktu medan listrik
diaplikasikan

r adalah jari-jari kapiler

ep adalah mobilitas elektroforetik
solut eof adalah mobilitas
elektroosmotik
E adalah medan listrk yang digunakan
Kbuf adalah konduktivitas buffer.

5.

b. +2 gerakan eof dia akan searah

dengan arah ep nya.

eo
f

ep

Karena kan dia (+), maka keluar lebih

cepet jadi eap nya dia akan lebih
besar, karena gak kepake dulu utk
saling tarik menarik.
Kalo bingung coba liat gambar ini

Digambar yg diatas, ada 3 istilah yg

ada:
*eof : mobilitas Elektroosmotik (EOF)
yang bertambah secara vektorial
efek elektroosmotik, jadi gerakan
molekul analat karena kolom kapiler
silica.
*ep: mobilitas analat atau mobilitas
elektroforetik (EMF) ini gerakan
selalu kearah katoda. Kenapa? Gue jg
gtw -_______-a
*eap: mobilitas aktual= ep + eof
ini gerak actual. Kasarnya nih, kalo gue
punya 2 molekul berbeda muatan.
Misal:
a. -3 gerakan eof dia akan
berkebalikan dengan arah ep nya.

eof

ep

Karena kan dia (-), maka keluar lebih

lama dibanding yang (+) jadi eap
nya dia akan lebih kecil, karena kepake
dulu utk saling tarik menarik. *kalo ga
ngeh dateng pas belajar bareng aja

14 F24110096

*gambar yg diatas itu menunjukkan

perbedaan arah/ kesamaan arahnya
*gambar yg kedua itu kayak ngasih tau
selisihnya. Yg (+) lebih panjang, artinya
nyampe detector lbh cepet dibanding
yg (-).
6. Intinya ngomongin yg poin 5 adalah?
Elektroforesis itu bisa misahin muatan (+),
(-), dan netral dalam 1 kali injeksi. Dimana
analisisnya bisa dibantu sama marker
(penanda) yg netral.
Syarat marker:
a. inert thd dinding kapiler, buffer, dan
molekul cnth
b. cnth marker: aseton, metanol
7. Parameter identifikasi

Analisis
kualitatif:
Waktu migrasi
(tM atau Mt)
tM = L
L=
panjang tabung
kapiler
v tot
v

Analisis kuantitatif luas are dibawah

kurva

tot = mobilitas
total

a. Efisiensi

D= koefisien difusi
b. Selektifitas

c. Resolusi

HPCE
1.
2.
3.

(elektroforesis kapiler kinerja tinggi)

Konsentrasi sampel rendah
Kurva berkitan dgn difusi elektromigrasi
Ditentukan kecepatan gerak partikel

Kelebihannya efek termal bisa diatasi dgn :

a.
b.
c.
d.

Mengurangi diameter kapiler

Mengurangi kuat medan listrik
Mengubah komposisi buffer yg lbh rendah
Gunakan sistem kontrol suhu yg efisien

*problem alat kalor menyebabkan interaksi

analat dan dinding kapiler meningkat Turbulensi
lokal dsorbsi analat pd dinding kapiler kurva
melebar

= (ep + eof)
xE
E=
medan listrik

Utk mengurangi interaksi: EMF dikurangi

a. Gunakan buffer ph ekstrem, konsentrasi

tinggi
b. +addtictive surfaktan, garam alkali,
etilen glikol, dll
c. Kapiler dilapisi

CGE (ELEKTROFORESIS KAPILER GEL)

-Tabung kapilernya diisi gel polimer
-biasanya dilakukan jika solute yg berbeda
memiliki mobilitas elektroforetik yg sama
M DNA dengan panjang berbeda
-contoh fragmen
memiliki ratio muatan dan ukuran yg sama. Kalo
pake CE susah, jadi pake CGE lebih mudah
berdasarkan bobot molekul.

t = lL
L=
panjang tabung
kapiler
ep V
l
= panjang
kapiler efektif
V=
Tegangan listrik

ALHAMDULILLAH :3
SEMANGAT UAS ITP 48
FIGHT FOR A!!!
-Amalia Khoirun NisaF24110096

Catatan: jangan
tertukar v
(mobilitas)
dengan V
(tegangan)

15 F24110096