Anda di halaman 1dari 4

Hasil

Analisis M. tuberculosis khusus sitokin-mensekresi T


limfosit PBMC dari pasien dan individu kontrol dirangsang
dengan SEA, PPD, ESAT-6 / CFP-10 dan BCG atau kiri distimulasi selama 18 atau 72
jam dan kemudian analisis sel sitokin mensekresi dilakukan. Seperti ditunjukkan
dalam salah satu contoh perwakilan melaporkan frekuensi IFN- dan IL-2- sel
mensekresi (Gambar 1) dan rinci dalam gambar 2A, setelah 18 jam dari budaya
perbedaan yang nyata tetapi tidak signifikan secara statistik dalam jumlah sitokin
mensekresi sel T terdeteksi antara kelompok-kelompok dalam budaya dirangsang
dengan M. tuberculosis atau antigen BCG, tetapi tidak pada mereka dirangsang
dengan SEA atau kiri un-dirangsang. Karena waktu berkurangnya rangsangan in
vitro, adalah masuk akal untuk percaya bahwa sel-sel responden yang TEM.
Frekuensi sitokin mensekresi sel T meningkat ketika analisis dilakukan setelah 72
jam kultur (Gambar 1 dan 2A). Analisis statistik dari hasil menunjukkan bahwa
metode ini memungkinkan diskriminasi TB aktif dan infeksi TB laten dari individu
kontrol tetapi tidak di antara pasien TB aktif dan subyek dengan infeksi TB laten
pada M. tuberculosis-spesifik stimulasi. Karena kinerja terbaik dari tes diperoleh
setelah 72 jam, kami memutuskan untuk memusatkan perhatian kita pada titik ini
waktu untuk sisa penelitian.

fig1 Antigen sekresi sitokin spesifik di PBMC pasien TB aktif. PBMC dari subyek
kontrol dan pasien TB aktif dikultur selama 18 dan 72 jam setelah stimulasi dengan
SEA, PPD, ESAT-6 / CFP-10 dan BCG atau kiri un-dirangsang (tidak ada). Sel-sel
kemudian diperlakukan sebagaimana ditentukan dalam bagian M & M untuk analisis
sitokin disekresi (IFN- dan IL-2) dan dievaluasi CD16- sel terjaga keamanannya
oleh aliran cytometry. Data dari satu percobaan perwakilan dilaporkan. Angka
menunjukkan persentase sel positif di kuadran relatif.

Gating penduduk pada CD4 + dan CD8 + T sel memberi kesempatan untuk
menganalisis kontribusi mereka terhadap sekresi sitokin global setelah M.
tuberculosis-spesifik stimulasi. Analisis sekresi sitokin oleh subpopulasi sel T tunggal
mencerminkan analisis pada sel-sel T keseluruhan (Gambar 2A) dan antigen spesifik
sitokin mensekresi limfosit T hadir tidak hanya dalam + CD4 tapi menarik juga
dalam CD8 + subpopulasi (Gambar 2B). Meskipun kedua + CD4 dan CD8 + sel
mensekresi sitokin juga terdeteksi menggunakan metode deteksi sitokin
konvensional intraseluler (data tidak ditunjukkan), frekuensi lebih tinggi
menggunakan metode kami.
Analisis sekresi IFN- oleh M. tuberculosis-spesifik T-limfosit

Gambar 3A melaporkan distribusi IFN- mensekresi sel T dalam subyek kontrol dan
pasien dengan TB aktif atau infeksi TB laten pada stimulasi tertentu. Analisis
statistik dari hasil menunjukkan bahwa metode ini memungkinkan diskriminasi TB
aktif dan infeksi TB laten dari individu kontrol dengan semua rangsangan yang
digunakan. Namun, tes tidak memungkinkan diskriminasi antara pasien TB aktif dan
subyek dengan infeksi TB laten.

Fig2 Analisis sitokin-antigen spesifik yang disekresikan oleh sel T. A) Frekuensi


sitokin sel mensekresi setelah 18 (kiri panel) atau 72 (panel kanan) jam budaya
dengan kontrol SEA positif, PPD, ESAT-6 / CFP-10 atau BCG di PBMC kontrol (CTR,
bar hitam), pasien dengan TB aktif (TB Kis, bar putih) atau individu dengan infeksi
TB laten (TB Lat, bar abu-abu). Kolom mewakili nilai-nilai median standard error
dari frekuensi (%) dari total sitokin (IFN-, IL-2 dan IFN- / IL-2) mensekresi sel
dihitung pada sel T jumlah CD16-. Hanya (p-nilai <0,05) signifikan secara statistik
perbedaan antara populasi yang ditunjukkan dilaporkan. * Menunjukkan p <0,05;
*** Menunjukkan p <0,005. B) Frekuensi sitokin sel mensekresi antara + CD8 (panel
kiri) atau + CD4 (panel kanan) sel di PBMC kontrol (CTR), pasien dengan TB aktif
(UU TB) atau individu dengan infeksi TB laten (TB Lat) setelah 72 jam budaya
dengan PPD, ESAT-6 / CFP-10 atau BCG. Kolom mewakili nilai-nilai median
standard error. Perbedaan antara populasi ditunjukkan dianggap signifikan ketika pnilai yang <0,05. * Menunjukkan p <0,05; ** Menunjukkan p <0,01; ***
Menunjukkan p <0,005; n.s. = Tidak signifikan.

Kurva ROC digunakan dalam studi akurasi diagnostik untuk menggambarkan pola
kepekaan dan spesifitas diamati ketika kinerja tes dievaluasi di beberapa ambang
diagnostik yang berbeda dan untuk memastikan optimal cut-off dengan kombinasi
terbaik dari sensitivitas dan spesifisitas. Dalam rangka untuk menganalisis kinerja
pengujian kami, kurva ROC dibangun dengan berbagai cut-off dari persentase IFN-
mensekresi sel pada stimulasi dengan ESAT-6 / CFP-10 memilih M. tuberculosis
yang terinfeksi (TB aktif dan TB laten infeksi) dan individu yang sehat sebagai
kelompok pembanding. Kurva diposisikan dekat sudut kiri diinginkan atas ruang
ROC menunjukkan kinerja yang baik (p-value <0,0001) IFN- mensekresi
pencacahan sel setelah ESAT-6 / CFP-10 stimulasi dengan uji kami di diskriminasi
individu dengan Infeksi TB (Gambar 3B). Optimum cut-off (0,1537%) dipilih untuk
membandingkan nilai diagnostik sekresi IFN- dianalisis di tingkat sel tunggal pada
stimulasi dengan ESAT-6 / CFP-10 dengan standar Quantiferon (cut-off = 0,35 UI /
ml) . Pengujian kami mengidentifikasi 27 dari 31 M. tuberculosis yang terinfeksi
individu (87,1%), sedangkan Quantiferon TB Emas di tabung diidentifikasi 26 keluar
31 M. tuberculosis yang terinfeksi individu (83,87%).

FIG3 Identifikasi M. tuberculosis yang terinfeksi individu menurut sekresi IFN-. A)


Distribusi IFN- mensekresi sel T di PBMC kontrol (CTR), pasien dengan TB aktif (UU
TB) atau individu dengan infeksi TB laten (TB Lat) dirangsang selama 72 jam
dengan PPD, ESAT-6 / CFP-10 atau BCG. Garis horizontal menunjukkan median.
Perbedaan antara populasi ditunjukkan dianggap signifikan ketika p-nilai
(ditunjukkan dengan angka) yang <0,05. B) ROC kurva (di sebelah kiri) dihasilkan
merencanakan sensitivitas (%) dibandingkan 100% spesifisitas% untuk menguji
pengaruh yang berbeda cut-poin persentase ESAT-6 / CFP-10 spesifik IFN-
mensekresi sel T dalam pasien TB, terlepas dari stadium penyakit, dibandingkan
subyek kontrol. Kotak menunjukkan berbagai persentase nilai cut-off yang
digunakan untuk menghitung sensitivitas yang sesuai dan spesifisitas. Panah
menunjukkan optimum cut-off (0,1537%) dengan kombinasi terbaik dari sensitivitas
dan spesifisitas. Di sebelah kanan AUC dan signifikansi statistik dari kurva ROC dan
sensitivitas dan spesifisitas yang sesuai dengan optimal cut-off ditunjukkan.

Analisis IL-2 sekresi oleh M. tuberculosis spesifik T-limfosit Deteksi bersamaan dari
IL-2 dan IFN- pada sel T-TB spesifik M. memungkinkan identifikasi tiga populasi
yang berbeda: sel mensekresi IFN- hanya atau IL- 2, masing-masing, dan sel-sel
mensekresi kedua sitokin. Dalam rangka untuk mengevaluasi nilai diagnostik IL-2mensekresi pencacahan sel, kami menganalisis distribusi sel T, yang secara aktif
mengeluarkan IL-2 terlepas dari sekresi IFN- mereka, di antara kelompokkelompok. Menariknya, persentase IL-2- mensekresi sel T pada individu dengan TB
laten secara statistik lebih tinggi dibandingkan pada pasien dengan penyakit aktif
ketika PPD (p = 0,008) atau BCG (p = 0,015) digunakan sebagai rangsangan
(Gambar 4A). Untuk memvalidasi kemungkinan untuk membedakan orang dengan
infeksi TB laten dari kedua kontrol dan pasien dengan TB aktif menggunakan PPD
atau BCG-diinduksi IL-2 sekresi, kami membangun kurva ROC yang sesuai. IL-2mensekresi pencacahan sel setelah stimulasi PPD atau BCG dengan uji kami
dikaitkan dengan kinerja yang baik dalam diskriminasi individu dengan infeksi TB
laten dari kedua pasien TB aktif dan subyek kontrol (Gambar 4B).

Analisis IL-17 dan IL-10 sekresi berikut stimulasi dengan antigen M. tuberculosis
Untuk menguji kontribusi yang mungkin dari IL-17 sekresi dalam diagnosis berbagai
bentuk TB, kami mengukur isi sitokin ini di supernatan dari 72 jam budaya dari
dirangsang PBMC dari 14 pasien TB aktif dan 6 kontrol yang sehat. Perbedaan
sekresi IL-17 dengan atau tanpa stimulasi dengan SEA (kontrol positif) adalah
signifikan secara statistik (p <0,01), tetapi perbedaan sekresi IL-17 antara kontrol
dan pasien TB yang tidak signifikan (Gambar 5A). Juga, tidak ada perbedaan
signifikan yang diamati antara kontrol dan TB aktif

pasien dirangsang dengan PPD dan ESAT-6 / CFP-10 (Gambar 5A). PPD-induced IL-17
sekresi lebih tinggi daripada kelompok kontrol yang sehat dalam tiga (rata-rata 104
pg / ml) dari 14 pasien, tapi kami tidak bisa mengidentifikasi karakteristik klinis dari
mata pelajaran ini berhubungan dengan peningkatan rilis IL-17. Kami juga
mengevaluasi frekuensi IL-10 memproduksi sel dengan sitometri dan IL-10
konsentrasi dengan ELISA pada stimulasi dengan sama M. antigen tuberkulosis dan
BCG. IL-10 memproduksi sel tidak terdeteksi di salah satu mata pelajaran diperiksa
oleh aliran cytometry (data tidak
ditunjukkan) dan tidak ada sekresi IL-10 terdeteksi dalam budaya PBMC dari subyek
kontrol atau pasien TB aktif dirangsang dengan PPD, ESAT-6 / CFP-10 atau BCG
(Gambar 5B). IL-10 hanya terdeteksi pada supernatan dari PBMC dirangsang
dengan SEA tetapi tidak ada korelasi dengan superantigen tergantung IL-10 sekresi
dan TB infeksi diidentifikasi.

fig4 Identifikasi laten M. tuberculosis yang terinfeksi individu sesuai dengan IL-2
sekresi pada stimulasi dengan PPD dan BCG. A) Distribusi frekuensi (%) dari IL-2
mensekresi sel T dalam PBMC pasien dengan TB aktif (UU TB) atau individu dengan
infeksi TB laten (TB Lat) dirangsang selama 72 jam dengan PPD, ESAT-6 / CFP -10
atau BCG. Garis horizontal menunjukkan median. Perbedaan antara populasi
dianggap signifikan ketika p-nilai (ditunjukkan dengan angka) yang <0,05. B) kurva
ROC (di sebelah kiri) yang dihasilkan merencanakan sensitivitas (%) dibandingkan
100% spesifisitas% untuk menguji pengaruh yang berbeda cut-poin persentase
PPD-spesifik (di atas) atau BCG-spesifik (di bagian bawah ) IL-2 mensekresi sel T
pada individu yang terinfeksi secara laten terhadap kedua subjek kontrol dan pasien
TB aktif. Kotak menunjukkan berbagai persentase nilai cut-off yang digunakan untuk
menghitung sensitivitas yang sesuai dan spesifisitas. Panah menunjukkan cut-off
yang optimal (0,35% dan 0,25% untuk PPD dan BCG, masing-masing) dengan
kombinasi terbaik dari sensitivitas dan spesifisitas. Di sebelah kanan yang sesuai
signifikansi AUC dan statistik kurva ROC dan sensitivitas dan spesifisitas yang
sesuai dengan celana optimal ditunjukkan.

fig5 Sekresi IL-17 dan IL-10 oleh PBMC dirangsang dengan antigen M. tuberculosis.
PBMC kontrol (bar hitam, n = 6) atau pasien dengan TB (bar putih, n = 14) yang
diaktifkan dengan SEA, PPD atau ESAT-6 / CFP-10 atau kiri un-dirangsang (Tidak).
Setelah 72 jam supernatan dikumpulkan dan diperiksa untuk A) IL-17 dan B) IL-10
konten dengan ELISA. Limit deteksi alat tes adalah 15 pg / ml. Histogram mewakili
nilai median dari sekresi sitokin setelah setiap stimulus dinyatakan dalam pg / ml.