PENGENALAN ALAT SPEKTROFOTOMETER UV-VIS, KALIBRASI DAN

PENGUKURAN PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM KLOROFIL DAUN

RAMA

I.

DASAR TEORI
Molekul-molekul

dapat

mengabsorbsi

atau

mentransmisi

radiasi

gelombang elektromagnetik. Berkas cahaya putih adalah kombinasi

semua panjang gelombang spektrum tampak. Perbedaan warna yang kita
lihat sebenarnya ditentukan dengan bagaimana gelombang cahaya
tersebut diabsorbsi dan ditransmisikan

(dipantulkan) oleh objek atau

suatu larutan.

Gambar 1. Pola difraksi cahaya polikromatik ( Sofyan, 2009)

Spektrofotometer digunakan untuk mengukur jumlah cahaya yang

diabsorbsi atau ditransmisikan oleh molekul-molekul di dalam larutan.
Ketika

panjang

gelombang

cahaya

ditransmisikan

melalui

larutan,

sebagian energi cahaya tersebut akan diserap (diabsorbsi). Besarnya

kemampuan molekul-molekul zat terlarut untuk mengabsorbsi cahaya
pada

pada

panjang

gelombang

tertentu

dikenal

dengan

istilah absorbansi (A), yang setara dengan nilai konsentrasi larutan

tersebut dan panjang berkas cahaya yang dilalui (biasanya 1 cm dalam
spektrofotometer) ke suatu point dimana persentase jumlah cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorbsi diukur dengan phototube.
Sebuah spektrofotometer memiliki lima bagian penting yaitu:

a) Sumber cahaya, untuk UV umumnya digunakan lampu deuterium

(D2O), untuk visible digunakan lampu tungstent xenon (Auc).
b) Monokromator, suatu alat yang berfungsi mengubah cahaya
polikromatik menjadi cahaya monokromatik
c) Sel penyerap / wadah pada sample, cell dalam spektrofotometer
disebut juga dengan kuvet.
d) Photodetektor berfungsi untuk mengubah energi cahaya menjadi
energi listrik
e) Analyzer (pengolah data), untuk spektrofotometer modern biasanya
dilengkapi dengan komputer.

Gambar 2. Skema Kerja alat Spektrofotometer UV-Vis ( Sofyan, 2009)

Suatu spektrometer UV-Vis biasanya bekerja pada daerah panjang

gelombang sekitar 200 nm (pada ultraviolet dekat) sampai sekitar 800 nm
(sinar tampak). Ketika sinar melewati suatu senyawa, energi dari sinar
tersebut digunakan untuk mendorong perpindahan elektron dari orbital
ikatan atau orbital non-ikatan ke salah satu orbital anti-ikatan yang
kosong. Pada tiap kemungkinan, suatu elektron tereksitasi dari orbital
yang terisi penuh ke orbital anti-ikatan yang kosong. Tiap lompatan
elektron memerlukan energi dari sinar dan lompatan yang besar pasti
membutuhkan energi yang lebih besar daripada lompatan yang kecil. Jika
besarnya energi tersebut cukup untuk membuat suatu lompatan, maka
panjang gelombang akan diserap dan energinya akan digunakan untuk
promosi satu elektron.Lompatan yang penting diantaranya:
a) Dari orbital pi ikatan ke orbital pi anti-ikatan;
b) Dari orbital non-ikatan ke orbital pi anti-ikatan;
c) Dari orbital non-ikatan ke orbital sigma anti-ikatan.

Penyerapan

sinar pada daerah antara 200 - 800 nm (pada daerah

dimana spektra diukur), suatu senyawa harus mengandung ikatan pi atau

terdapat atom dengan orbital non-ikatan. Orbital non-ikatan biasanya
mengandung pasangan elektron bebas, misalnya pada oksigen, nitrogen,
atau halogen. Bagian molekul yang dapat menyerap sinar disebut
sebagai gugus kromofor.
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UVVis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan
spektrofotometri visible karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi
senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan.
a.

Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis

Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah

tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan
dengan pereaksi tertentu.
b.

Waktu operasional (operating time)

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna.

Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil.

c.

Pemilihan panjang gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang

yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panjang gelombang maksimal,

dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang
dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.
d.

Pembuatan kurva baku

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi.

Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat

kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi (X).
e.

Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan

Absorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15%
sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa
kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik). (Gandjar &
Rohman, 2007).
Komponen-komponen peralatan spektrofotometer UV-Vis dijelaskan secara garis besar
sebagai berikut.
1.

Sumber Cahaya
Sebagai sumber radiasi UV digunakan lampu Hidrogen (H) atau lampu Deutirium (D).

Sedangkan sumber radiasi tampak yang juga menghasilkan sinar Infra Merah (IR) dekat
menggunakan lampu filament tungsten yang dapat menghasilkan tenaga radiasi 350-3500
nm.
2.

Monokromator
Radiasi yang diperoleh dari berbagai sumber radiasi adalah sinar polikromatis (banyak

panjang gelombang). Monokromator berfungsi untuk mengurai sinar tersebut menjadi

monokromatis sesuai yang diinginkan. Monokromator terbuat dari bahan optic yang
berbentuk prisma.
3.

Tempat Sampel
Dalam bahasa sehari-hari tempat sampel (sel penyerap) dikenal dengan istilah kuvet.

Kuvet ada yang berbentuk tabung (silinder) tapi ada juga yang berbentuk kotak. Syarat bahan
yang dapat dijadikan kuvet adalah tidak menyerap sinar yang dilewatkan sebagai sumber
radiasi dan tidak bereaksi dengan sampel dan pelarut.
4.

Detektor
Detektor berfungsi untuk mengubah tenaga radiasi menjadi arus listrik atau peubah panas

lainnya dan biasanya terintegrasi dengan pencatat (printer). Tenaga cahaya yang diubah
menjadi tenaga listrik akan mencatat secara kuantitatif tenaga cahaya tersebut.
(Sitorus, 2009).
Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari
batang, umumnya berwarna hijau dan terutama berfungsi sebagai

penangkap energi dari cahaya matahari melalui fotosintesis. Daun

merupakan organ terpenting bagi tumbuhan dalam melangsungkan
hidupnya karena tumbuhan adalah organisme autotrof obligat, ia harus
memasok kebutuhan energinya sendiri melalui konversi energi cahaya
menjadi energi kimia (Dwidjoseputro, 1994)
Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun.
Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang
gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. Daun juga
memiliki pigmen lain, misalnya karoten (berwarna jingga), xantofil
(berwarna kuning), dan antosianin (berwarna merah, biru, atau ungu,
tergantung derajat keasaman). Daun tua kehilangan klorofil sehingga
warnanya berubah menjadi kuning atau merah (dapat dilihat dengan jelas
pada daun yang gugur) yang dapat diketahui melalui analisis dengan
spektofotometer.

Oleh

sebab

itu

dilakukan

praktikum

ini

untuk

mengetahui panjang gelombang maksimum kandungan klorofil daun

Rama dengan menggunakan alat spektrofotometer.

II.

TUJUAN PRAKTIKUM
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui prinsip kerja, kalibrasi

dan penentuan panjang gelombang maksimum klorofil pada daun Rama

yang berada di lingkungan Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) dengan
spektrofotometer UV-VIS

III.

METODE PRAKTIKUM
III.1
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah Kuvet
Quarts, spektrofotometer Uv-Visible Lamda 25 Perkin Elmer,
tabung reaksi, penangas air, erlenmeyer.Bahan yang digunakan
pada percobaan ini adalah akuades, aseton, sampel daun.
III.2
Posedur Kerja
a) Preparasi sampel

Sampel daun dihancurkan dengan menggunakan mortar lalu

ditambahkan pelarut aseton, dan disaring kemudian diambil hasil
ekstraksinya
b) Kalibrasi alat spektrofotometer Uv-Vis
Dinyalakan alat spektrofotometer selama 15 menit untuk
menstabilkan cahaya dan fotodetektor. Disiapkan larutan blanko
(aquades), dimasukan kedalam kuvet yang telah dibersihkan
sebelumnya dengan tisue.

Dipilih menu aplikasi waveength

scan. Dimasukan range panjang gelombang, yaitu jika scan range

UV 400-200 nm, jika range Visible 800-400 nm Dilakukan kalibrasi
dengan menggunakan larutan blanko (minimal 2 kali dengan
menekan tombol autozero)
c) Penentuan panjang gelombang maksimum klorofil daun
Rama
Ditentukan range panjang gelombang yang akan digunakan.
Dimasukan sampel ekstrak daun kedalam kuvet yang kering dan
bersih. Dilakukan scanning panjang gelombang maksimum untuk
sampel daun hingga dihasilkan nilai lamda maksimun.
IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Prinsip dari spektrofotometer UV-Vis adalah penyerapan sinar tampak untuk ultraviolet

dengan suatu molekul dapat menyebabkan terjadinya eksitasi molekul dari tingkat energi
dasar (ground state) ketingkat energi yang paling tinggi (excited stated). Pengabsorbsian sinar
ultra violet atau sinar tampak oleh suatu molekul umumnya menghasilkan eksitasi elektron
ikatan, akibatnya panjang absorbsi maksimum dapat dikolerasikan dengan jenis ikatan yang
ada didalam molekul (Hendayana,1994).
Panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat
pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum
tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blanko
dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blanko ataupun
pembanding (Khopkar, 1990).
Pengukuran panjang gelombang maksimum pada sampel daun yang
memiliki

kandungan

klorofil

dilakukan

dengan

menggunakan

spektofotometer UV-VIS. Range panjang gelombang yang digunakan yaitu

400-800 nm dan blanko yang digunakan yaitu aseton karena aseton inilah

yang digunakan sebagai pelarut untuk mengekstraksi daun. Blanko yang

digunakan dalam spektrofotometer UV-VIS adalah akuades ataupun
pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi (Sofyan, 2009).

Gambar 3. Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum

Hasil pengukuran yang dilakukan diketahui ada dua puncak serapan,

serapan pertama memiliki panjang gelombang sebesar 662,17 nm dan
menyerap spektrum warna merah dan serapan kedua memiliki panjang
gelombang sebesar 432,03 nm dan menyerap spektrum warna biru
(Gambar 4) serta terdapat kandungan senyawa klorofil. Menurut Sofyan
( 2009)

pada panjang gelombang 625 740 nm menyerap spektrum

warna merah, dan pada panjang gelombang 425 500 nm menyerap

spektrum warna biru. Data yang diperoleh terdapat panjang gelombang 432.03 dan
661.93 nm yang mendekati literatur klorofil yang berwarna hijau karena menyerap cahaya
dengan kuat di daerah biru (430 nm) dan merah (662 nm) pada spektrum tampak. Panjang
gelombang maksimum bervariasi tergantung pada pelarut yang digunakan. (Gross, 1991)

Gambar 4. Spektrum absorpsi klorofil a dan klorofil b Sasmitamihardja (1990)

Menurut Sasmitamihardja (1990) dan Dwidjoseputro (1994) panjang

gelombang pada senyawa klorofil memiliki dua puncak serapan yang
berada pada panjang gelombang 662 nm untuk klorofil A dan 453 nm
untuk klorofil B (Gambar 5). Pigmen klorofil akan menyerap cahaya
dengan panjang gelombang dan cahaya yang diserap akan hilang dengan
melepaskan panas. Pigmen klorofil menyerap lebih banyak cahaya
tampak pada warna biru pada panjang gelombang 400-450 nm dan merah
pada panjang gelombang 650-700 nm.
Pengukuran panjang gelombang maksimum klorofil pada daun hanya memiliki rentang
daerah serapan, bukan suatu nilai yang diskrit. Hal ini dikarenakan adanya pengaruh pelarut
yang digunakan pada proses ekstraksi. Dengan bertambahnya kepolaran pelarut pada transisi
*, bentuk puncak bergeser ke panjang gelombang yang lebih pendek (pergeseran biru
atau hipsokromik), sedangkan jika bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang
(pergeseran merah atau batokromik). Pergeseran biru disebabkan bertambahnya solvasi
pasangan elektron hingga berakibat energinya turun. Pergeseran merah terjadi akibat
bertambahnya kepolaran pelarut (~ 5 nm), disebabkan gaya polarisasi antara pelarut dan
spesies, sehingga berakibat menurunnya selisih tingkat energi eksitasi dan tingkat tidak
tereksitasi (Kristianingrum,2014).
Spektrum penyerap warna untuk klorofil A dan B pada daun
menunjukkan keefektifan relatif panjang gelombang berbeda

yang

menggerakkan reaksi fotosintesis, karena cahaya dapat bekerja dengan

menyerap energi didalam kloroplas. Energi foton yang akan diserap akan
dirubah menjadi energi potensial elektron yang dinaikkan dari keadaan
dasar ke keadaan tereksitasi, tetapi keadaan eksitasi ini berlangsung
singkat dan elektron-elektron kembali ke tingkat energi semula dengan
melepaskan energi berlebihnya sebagai panas (Sofyan, 2009).
V.

KESIMPULAN
Kesimpulan yang didapat dalam praktikum ini adalah
1. Prinsip kerja pada spektrofotometer UV-VIS berdasarkan interaksi
materi dengan energi cahaya.
2. Mengkalibrasi spektrofotometer

UV-VIS

dengan

melakukan

scanning wavelength terlebih dahulu menggunakan pelarut

sampel daun yaitu aseton.

3. Panjang maksimum yang dihasilkan terdapat dua

puncak

serapan yaitu sebesar 662,16 nm dengan spektrum warna

merah dan 431,59 nm dengan spektrum warna biru dan
diidentifikasi terdapat kandungan senyawa klorofil.
4. Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan larutan blanko yaitu aseton, diatur nilai
absorbansinya 0 dan nilai transmitannya 100%.

VI.

DAFTAR PUSAKA
Adnan, Mochamad. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan.
ANDI.Yogyakarta.
Dwidjoseputro, D. 1994. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. PT. Gramedia Pustaka
Utama. Jakarta
Gandjar, I.G. & A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar.
Yogyakarta.
Gross, J. 1991. Pigment in Vegetables (Chlorophylls and Carotenoids). Van Norstran
Reinhold. New York. 775 pp.
Hendayana, Sumar. (1994). Kimia Analitik Instrumen. Semarang: Semarang Press.
Jatim, Sofyan. 2009. Spektometri Serapan dan Emisi Atom. Jakarta :
PT. Gramedia Jakarta.
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.
Kristianingrum, Susila. 2014. Handout spektroskopi ultra violet dan sinar tampak
(spektroskopi uv vis). Universitas Negeri Yogyakarta.
Pavia L. Donald, et
al.
1995, Introduction
to

Organic

Laboratory

Techniques, Saunders College, USA.

R.A. Day, JR and Underwood, 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Sitorus, M. 2009. Spektroskopi Elusidasi Struktur Molekul Organik Edisi Pertama.
Graha Ilmu. Yogyakarta.
Sasmitamihardja, 1990. Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan. Bandung:
ITB Bandung
Skoog, D.A. 1996. Fundamental of Analytical Chemistry, &nd ed. Sauders College
Publishing.
Willerd, H.H. et al. 1988. Instrumental Methods of Analysis,Wadsworth.