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REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

I.

II.

OBJETIVOS
Conocer la tcnica de PCR
Analizar e interpretar los resultados obtenidos por PCR
Describir el proceso de la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR.
Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.
INTRODUCCION

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica de biologa


molecular que permite la rpida replicacin del ADN. Con la PCR, cantidades
mnimas de material gentico pueden ser amplificadas millones de veces en
pocas horas permitiendo la deteccin rpida y fiable de los marcadores
genticos de enfermedades infecciosas, cncer y desrdenes genticos.
El uso de la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa ha
aumentado mucho la capacidad de los cientficos para estudiar el material
gentico. Desde su invencin por cientficos de Cetus Corporation en 1983, la
PCR ha cambiado la forma en la que se lleva a cabo la investigacin y
diagnstico mdico. La capacidad de producir rpidamente grandes cantidades
de material gentico ha permitido avances cientficos significativos, incluyendo
huella dactilar del ADN y la secuenciacin el genoma humano.
La PCR est diseada segn el principio natural de replicacin del ADN. Es un
proceso de tres pasos, designado como un ciclo, que se repite un nmero
especfico de veces. Un ciclo de PCR consiste en los siguientes pasos: 1.
Desnaturalizacin 2. Alineacin 3. Extensin Este proceso tiene lugar en un
termociclador, un instrumento que automticamente controla y alterna las
temperaturas durante perodos programados de tiempo para el nmero
apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos).
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente
forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora
nucletidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por
la unin de los cebadores al molde.

III.

METODOS Y PROCEDIMIENTO

IV.

RESULTADOS
AMPLIFICACION DEL GEN GAPDH POR PCR CONVENCIONAL
C(-DNA) GAPDH
Gel al 1%
Voltaje: 100V
Tiempo de Corrida: 35min
Gel teido con SYBR Safe 10,000X

V.

CONCLUSION

C(-Primer)

Gen GAPDH amplificado por PCR

CUESTIONARIO
1.-Si no se contara con un kit de diagnstico. Cmo podra identificar
malaria por PCR? Explique brevemente.
Se utiliza una tcnica de PCR mltiple que permite la deteccin del DNA
genmico de las cuatro especies parasitarias. La amplificacin por PCR permite
incluso la deteccin de 3-4 parsitos/ l (parasitemias de 0,0005 a 0,0015%),
as como la determinacin de infecciones mixtas. Al ser una tcnica
potencialmente cuantitativa, permite controlar la eficacia del tratamiento,
prediciendo las resistencias a los antipaldicos. Podra ser la tcnica de
referencia por su altsima sensibilidad y especificidad pero, aparte de no estar
comercializada, no est al alcance de todos los laboratorios y no se adapta al
diagnstico d urgencia individualizada.
2.- Qu consideraciones se debe tener a la hora de disear los
primers?

Temperatura de anillamiento (Ta)


Longitud del primer

Temperatura y tiempo de elongacin


Nmero de ciclos

3.-Para que se realiza la extensin final a 72 C, que pasara si no se


hubiera usado?
Extensin final a 72C por 10 mn (aunque no es estrictamente necesario este
ltimo paso, es slo para asegurar que los fragmentos incompletos se terminen
de sintetizar);
4.- Cuntos tipos de tcnicas de PCR existen?
aplicabilidad de la PCR en el diagnstico molecular

Cul

es

la

PCR anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es
utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores
que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando
tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo
una amplificacin dentro del amplicn inicial.
PCR de extensin solapada (Mutagnesis)
Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN.
Se requieren 2 cebadores (primmers) mutagnicos y otros 2. Se amplifica un
fragmento 5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutacin.
PCR in situ
La
PCR in
situ consiste
en
una
reaccin
de
PCR
en
secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden
visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas
en un portaobjetos.

PCR mltiple
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una secuencia. Para ello,
se combinan dos o ms pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el
resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes, para amplificar
simultneamente varios segmentos de ADN.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de
ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de
un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de
una RT-PCR sera:

1.er paso: retrotranscripcin a partir del ARN.

2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.

3.er paso: PCR estndar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)


Artculo principal: PCR en tiempo real
Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la
cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original, o para identificar con
una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de
su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting
temperature).
5.-comente un paper en el cual se haga diagnstico molecular de una
enfermedad infecciosa por PCR?
Enfermedad de chagas es causada por el parasito tripanosoma cruzi esta
enfermedad comprende una fase aguda, seguida de una fase crnica, con una
parasitemia escasa y una clnicaque va desde la ausencia de sntomas hasta
una cardiopata severa. El diagnstico presentalimitaciones, debido a la baja
sensibilidad de las tcnicas parasitolgicas y la baja especificidad de
lasinmunolgicas. Las tcnicas de PCR son una alternativa, pero estas deben
ser estandarizadas yvalidadas antes de su uso. El objetivo de este trabajo fue
validar las tcnicas de PCR para laamplificacin de ADN de minicrculo de
kinetoplasto (PCR-ADNk) y ADN satlite (PCR-ADNsat) de T,cruzi se utilizaron 29
muestras de sangre y 19 de suero de pacientes diagnosticados previamente y
3muestras de xenodiagnstico de un paciente en fase aguda, resultando
positivas por PCR-ADNk26/29 (89,7%) y por PCR-ADNsat 23/29 (79,3%),
mientras que utilizando suero resultaron positivaspor PCR-ADNk 5/19 (26,3%) y
por PCR-ADNsat 7/19 (36,8%). Las 3 muestras de xenodiagnsticoresultaron
positivas (100%) Adems, se analizaron 24 muestras de sangre y suero de
individuos,negativos para las tcnicas de diagnstico parasitolgico e
inmunolgico y sin factores de riesgo de laenfermedad, los cuales dieron
negativo por ambas PCRs. La muestra de eleccin result ser sangre yse
recomienda el uso de las dos tcnicas de PCR en conjunto, ya que todos los
pacientes conenfermedad de Chagas confirmada resultaron positivos (100%)
por lo menos en una de las PCRevaluadas en muestras de sangre.

TRABAJO ADICIONAL

1. Cuntas copias de un amplicn pueden obtenerse despus


de 35 ciclos de PCR?
2n=235=3.4 x 1010

copias

2. Veinte nanogramos de DNA genmico humano son necesarios


para una PCR. La
solucin stock del molde se encuentra a una concentracin
de 0.2mg DNA/mL.
Cuntos microlitros de la solucin stock deberan utilizarse?
0.2 mg = 200 000 ng
1 mL = 1000 L
200 000 ng

20 ng

1000 L
x

x = 0.1 L
Debe usarse 0.1 L de solucin stock para obtener 20 ng de DNA
genmico.
3. Partiendo de 600 molculas de DNA molde, cuntos
amplicones se generarn
despus de 25 ciclos de PCR?
2n x 600=225 x 600=2.01 x 1010

amplicones

4. Si la PCR mencionada en la pregunta 3 se lleva a cabo en


una reaccin de 100L,
cuntas molculas de producto amplificado estarn
presentes en 0.001L?
10

2.01 x 10 100 000 000 L


x0.001 L

x = 0.2013
Habrn 0.2013 molculas de producto amplificado en 0.001L
5. Un producto de PCR de 800bp que tiene un contenido de G +
C del 55% es
sintetizado en una reaccin que contiene 50mM KCl y 2.5mM
MgCl2. Cul es la Tm
del amplicn?

6. Un stock de cebadores que consiste en dos cebadores


necesarios para una PCR
tiene una concentracin de 25M. Qu volumen de stock de
cebadores debera
ser aadido a 100L de reaccin para que la concentracin de
cebadores en la
reaccin sea de 0.4M?
V x C = V x C
V x 25 M = 100 L x 0.4 M
V = 1.6 L
Se necesitan 1.6 litros de stock de cebadores para conseguir una
concentracin de 0.4 M