Anda di halaman 1dari 11

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI FLAVONOID PADA DAUN KATU (Sauropus androgynus (L.

)
Merr)
-Sejumlah 1 gram serbuk bahan ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan
disaring, filtrat digunakan sebagai larutan percobaan. Ke dalam 5 ml larutan percobaan
ditambahkan sedikit serbuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil-alkohol, dikocok
dengan kuat dan dibiarkan memisah. Terbentuknya warna jingga atau merah jingga pada
lapisan amil-alkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid [1,9].
-Ekstraksi dilakukan secara maserasi bertingkat dengan menggunakan pelarut mula-mula nheksana kemudian etanol 95%. Sejumlah 1 kg serbuk kering daun katu pertama-tama diekstrasi
dengan n-heksana berkali-kali sampai filtrat jernih. Ampas dikeringkan kemudian diekstraksi
dengan etanol 95% berkali-kali hingga filtrat jernih. Masing-masing ekstrak dipekatkan dengan
penguap putar vakum sehingga diperoleh ekstrak kental [10]. Pada penelitian ini yang
digunakan adalah ekstrak etanol. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 1.
-Isolasi senyawa flavonoid dikerjakan dengan metode Charaux-Paris. Ekstrak pekat etanol dilarutkan
dalam

air

panas,

disaring

kemudian

diekstraksi

dengan

n-heksana,

fraksi

n-heksana

dikumpulkan dan di pekatkan, diperoleh fraksi n-heksana pekat. Fraksi air diekstraksi dengan
kloroform, fraksi kloroform dikumpulkan dan dipekatkan diperoleh fraksi kloroform pekat. Fraksi
air diekstrasi lagi dengan etil asetat, fraksi etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan, diperoleh
fraksi etil asetat pekat. Kemudian fraksi air diekstraksi dengan n-butanol, fraksi n-butanol
dikumpulkan dan dipekatkan, sehingga diperoleh fraksi n-butanol pekat. Ekstraksi dengan nbutanol dilakukan 3 kali, setiap kali dengan pelarut n-butanol yang baru, sehingga diperoleh
fraksi n-butanol I, fraksi n-butanol II dan fraksi n-butanol III. Bagan fraksinasi dapat dilihat pada
Gambar 2.

Untuk melihat profil kromatografi dari setiap fraksi. digunakan cara kromatografi kertas.
Masing-masing fraksi ditotolkan pada kertas Wathman no. 1, dielusi menggunakan cairan
pengembang n-butanol - asam asetat air (60 : 22 : 1,2 ) [1,9,11].
Setelah diketahui bahwa fraksi yang mengandung jenis flavonoid terbanyak adalah fraksi
n-butanol I, maka dilakukan isolasi senyawa flavonoid dengan cara kromatografi kertas preparatif.
- Cairan pengembang yang digunakan : n-butanolasam asetatair (4:1:5)
- Jarak rambat : 40 cm
- Teknik pengembangan : Menurun.
- Penotolan : Bentuk pita.
- Pendeteksi : Sinar UV 254/ 366
Masing-masing pita kromatogram dipisahkan, dipotong kecil-kecil dan diekstraksi dengan
metanol. Untuk pemurnian isolat dilakukan pengembangan kedua secara kromatografi kertas
preparatif.
- Cairan pengembang : Asam asetat 2 % dalam air
- Jarak rambat : 20 cm
- Teknik pengembangan : Menurun
- Penotolan : Bentuk pita
- Pendeteksi : Sinar UV 254/366
Setiap pita kromatogram yang diperoleh kemudian diekstraksi dengan metanol, sehingga
diperoleh beberapa isolat dari senyawa flavonoid. Identifikasi senyawa golongan flavonoid

dilakukan dengan mengamati warna fluoresensi di bawah sinar ultraviolet sebelum dan sesudah
penambahan uap amonia terhadap bercak isolat yang diperoleh [3,8]. Kemudian dengan
menggunakan spektrofotometer ultraviolet dilihat geseran batokromik setelah setiap isolat dalam
larutan metanol diberikan pereaksi geser natrium hidroksida, aluminium klorida, asam klorida,
natrium asetat, dan asam borat secara bergantian. Dengan melihat geseran batokromik tersebut
dapat diidentifikasi jenis flavonoid [3,8]. Dilakukan juga pembuatan spektrum derivatisasi dengan
menggunakan spektrofotometer UV dan dibuat spektrum inframerah terhadap 2 (dua) isolat untuk
lebih meyakinkan hasil identifikasi.

Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dalam Rimpang Temu


Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb.)

1 g rimpang temu
ireng

dimasukkan ke dalam erlenmeyer

ditambahkan etanol 25 ml

dipanaskan sampai mendidih

disaring

Filtrat

Ampas

diuapkan sampai volumenya tinggal setengahnya

adanya flavonoid diuji dengan Shinda Tes

Hasil

Tahap selanjutnya adalah mengangin-anginkan rimpang temu ireng pada suhu kamar sampai kering.

Rimpang

Soxhlet

dihaluskan, dimasukkan ke alat ekstraktor

diekstraksi secara berurutan menggunakan

petroleum eter, kloroform, n-butanol, dan


metanol masing-masing selama 8 jam
Hasil

Hasil ekstraksi berupa ekstrak petroleum eter, kloroform, n-butanol dan metanol
masing-masing dilakukan uji warna untuk flavonoid. Ekstrak yang positif
mengandung flavonoid kernudian ditentukan eluen yang sesuai untuk langkah
selanjutnya yaitu kromatografi kolom.
Penentuan eluen pada ekstrak petroleum eter (PE) dilakukan dengan menggunakan
eluen PE kloroform pada berbagai perbandingan volume. Untuk ekstrak kloroform,
eluen yang digunakan adalah kloroform-etil asetat pada berbagai perbandingan

volume. Sedangkan pada ekstrak n-butanol digunakan eluen etil asetat-metanol


pada berbagai perbandingan volume. Ekstrak metanol tidak dicari eluen yang sesuai.
Persiapan pertama kromatografi kolom adalah memanaskan silika gel pada suhu
1600C selama 3 jam kemudian didinginkan. Setelah dingin, silika dibuat bubur dan
dimasukkan dalam kolom, lalu dibiarkan semalam.
Ekstrak pekat dilarutkan dalam eluen yang kurang polar dan dimasukkan kolom
menggunakan pipet. Sampel dibiarkan turun sampai permukaannya hampir
terbuka, kemudian ditambah eluen pelan-pelan sampai mendapat eluen yang tidak
berwarna pada permukaan penyerap. Langkah selanjutnya ditambah eluen, dengan
laju elusi 20 tetes/menit. Setiap 2 mL eluat, ditampung dalam botol sampel.
Untuk pembagian fraksi, masing-masing botol dianalisis secara fisika menggunakan
sinar UV-VIS pada " = 254 nm dan " = 366 nm dan TLC, serta secara kimia
menggunakan uji warna. Fraksi tunggal yang mempunyai harga Rf sama dan uji
fisika serta kimia sama dikumpulkan, dan pelarutnya diuapkan. Selanjutnya
dilakukan identifikasi struktur untuk menggunakan spektrofotometer UV-VIS, IR dan
GC-MS.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID


DALAM DAUN BELUNTAS (Pluchea indica L.)
Cara Kerja
Sebanyak 50 gram serbuk simplisia daun beluntas dimasukkan ke dalam Erlenmeyer (500 ml) kemudian
direndam dengan 250 ml pelarut etanol 96% p.a, ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 7
hari, sambil sesekali dikocok. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary
evaporator pada suhu 70oC sehingga diperoleh ekstrak pekat daun beluntas. Ekstrak pekat daun beluntas
dicampurkan dengan etanol 96% p,a kemudian dipartisi dengan n-heksana. Ekstrak yang diperoleh
dilakukan uji fitokimia flavonoid.
50 g serbuk daun
beluntas

96% p.a

dimasukkan ke dalam erlenmeyer

direndam dengan 250 ml pelarut etanol

ditutup dengan aluminium foil

dibiarkan selama 7 hari, sambil dikocok

sesekali
Ekstrak

dipekatkan dengan menggunakan vacum

rotary evaporator pada suhu 70oC


Ekstrak

dicampurkan dengan etanol 96% p.a

dipartisi dengan n-heksan

ekstrak yang diperolh dilakukan uji fitokimia flavonoid

Hasil

Ekstrak yang positif mengandung flavonoid dilanjutkan untuk di isolasi dan pemurnian dengan teknik
kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase diam GF254 dengan ukuran 20 cm x 20 cm dan fase
gerak campuran dari n-butanol-asam asetat-air (BAA) (4:1:5). Selanjutnya isolat relatif murni
diidentifikasi menggunakan spektrofotometer Ultra Violet Visibel.

Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan komponen yang diinginkan dari penyusun-penyusun
lain dalam suatu campuran berdasarkan kelarutan komponen tersebut terhadap pelarut yang
digunakan. Pemilihan metode ekstraksi yang tepat tergantung dari tekstur, kandungan air,
bahan tumbuhan yang akan diekstraksi dan jenis senyawa yang akan diisolasi. (Padmawinata,
1996). Ekstraksi biasanya menggunakan pelarut organik secara berurutan dengan kepolaran
yang semakin meningkat. Kepolaran pelarut tergantung dari nilai konstanta dielektriknya.
Nilai konstanta dielektrik beberapa pelarut dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Nilai konstanta dielektrik beberapa pelarut

Sumber : Stahl, 1985


Metode ekstraksi yang biasa digunakan antara lain :
1. Sokhlet
Sokhlet merupakan proses pemisahan berulang dengan sampel berupa padatan. Sampel yang
akan diekstrak biasanya padatan yang telah dihaluskan. Padatan ini lalu dibungkus dengan
kertas saring lalu dimasukkan dalam alat sokhlet. Alat ini pada bagian atas dihubungkan
dengan pendingin balik sedangkan bagian bawah terdapat labu alas bulat sebagai tempat
pelarut. Pemanasan dengan suhu tertentu akan menguapkan pelarut. Uap akan naik ke atas
mengalami proses pendinginan. Ruang sokhlet akan dipenuhi oleh pelarut yang telah
mengembun hingga batas tertentu pelarut tersebut akan membawa solut dalam labu. Proses
ini berlangsung terus menerus. (Rusdi, 1990). Keuntungan metode ini adalah ekstraksi
berlangsung cepat, cairan pengekstraksi yang dibutuhkan sedikit, dan cairan pengekstraksi
tidak pernah mengalami kejenuhan.
2. Maserasi
Maserasi merupakan cara ekstraksi paling sederhana yang dilakukan dengan merendam
serbuk kasar simplisia dengan cairan pengekstraksi selama 4-10 hari dan disimpan terlindung
dari cahaya langsung (mencegah reaksi yang dikatalisis cahaya atau perubahan warna).
Keuntungan dari maserasi adalah hasil ekstraksi banyak serta dapat menghindarkan
perubahan kimia terhadap senyawa-senyawa tertentu oleh karena pemanasan namun
demikian proses maserasi membutuhkan waktu yang relatif lama. Kerugian cara maserasi
adalah penyarian kurang sempurna karena terjadi kejenuhan cairan penyari dan
membutuhkan waktu yang lama. (Hargono, 1997). Walaupun demikian, maserasi merupakan
proses x ekstraksi yang masih umum digunakan karena cara pengerjaan dan peralatannya
sederhana dan mudah.
Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Kromatografi cair vakum merupakan salah satu kromatografi vakum khusus yang biasanya
menggunakan silika gel sebagai adsorben. Kelebihan KCV jika dibandingkan dengan
kromatografi kolom biasa terletak pada kecepatan proses (efisiensi waktu) karena proses
pengelusian dipercepat dengan memvakumkan kolom selain itu KCV juga dapat memisahkan
sampel dalam jumlah banyak.
Pemilihan jenis silika gel yang tepat merupakan faktor yang sangat penting untuk
mendapatkan hasil pemisahan yang baik. Ukuran partikel silika gel yang terlalu kecil akan
menyebabkan proses elusi berjalan sangat lambat. (Peddersen, 2001).
Pemilihan sistem pelarut untuk kromatografi kolom vakum cair dapat dilakukan dengan 3
pendekatan, yaitu: penelusuran pustaka, mencoba menerapkan data KLT pada pemisahan
dengan kolom, dan pemakaian elusi landaian umum dari pelarut non polar yang tidak
menggerakkan zat terlarut sampai pelarut polar yang menggerakkan zat terlarut
(Padmawinata, 1991). Sistem elusi dapat dilakukan dengan metode gradien pelarut atau
dengan sistem isokratik. Elusi gradient (variasi kepolaran pelarut) dilakukan jika campuran

senyawa cukup komplek sedangkan elusi isokratik dilakukan jika campuran senyawa yang
akan dipisahkan sederhana.
Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai atau sampel dibuat serbuk bersama adsorben
(impregnasi) dan dimasukkan ke bagian atas kolom kemudian dihisap perlahan-lahan. Kolom
selanjutnya dielusi dengan pelarut yang sesuai, dimulai dengan yang paling non polar. Kolom
dihisap sanpai kering pada setiap pengumpulan fraksi. Pada kromatografi cair vakum, fraksifraksi yang ditampung biasanya bervolume jauh lebih besar dibandingkan dengan fraksifraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom biasa. Langkah pemisahan menggunakan
kromatografi cair vakum biasanya dilakukan pada tahap awal pemisahan (pemisahan
terhadap ekstrak kasar yang diperoleh langsung dari proses ekstraksi).

Isolasi Glikosida Steroid dari Daun Andong (Cordyline terminalis


Kunth)

Serbuk daun andong


0,5kg

Ekstrak n-heksan
mengandung lipid

dimaserasi dengan n-heksana 24 jam

Residu/ ampas

dikeringkan, ditimbang,

dimaserasi dengan metanol


Ekstrak metanol

diuapkan dengan rotavapor

Ekstrak metanol

Fraksi air

dipartisi dengan air dan n-

butanol

Fraksi n-

diuapkan, dicuci dengan dietil eter

dilarutkan dalam metanol

ditambahkan dietil eter berlebih, disaring

Fraksi

Endapan
glikosida

Senyawa
glikosida

di KLT, KK, KLT 2 arah

Bagan alir isolasi flavonoid dalam rumput teki


Rumput teki
segar digiling dan

diekstraksi pertama dengan MeOH : H2O

(9:1), ekstraksi 2 dengan MeOH : H2O (1:1)


Bubur

dibiarkan selama 6-12 jam

disaring dengan corong Buchner

Ekstrak metanol

diuapkan hingga kering sampai 1/3

volume awal

diekstraksi dengan n-heksan/ CHCl3

Lapisan
air

Lapisan nheksan/ CHCl3

diuapkan sampai kering dengan rotavapor

ekstrak air di KKt kualitatif

Ekstrak

Kromatogr

diKKt preparatif

diKKt 2 arah

Isolat/

Flavonoid

Jenis flavonoid

dianalisa dengan pereaksi geser

Cara Pengemasan Kolom pada Kromatografi Kolom


I.

Cara Basah
1.

Selapis pasir dimasukkan ke dalam kolom, bisa juga dipakai kapas atau gelas wool

2.

Tabung diisi 2/3 nya dengan pelarut. Pelarut yang dipakai pada proses penngemasan
mungkin sama dengan yang dipakai untuk kromatografi dan bisa juga pelarut dengan
kepolaran yang lebih rendah

3.

Penjerap dibuat lumpuran pada wadah lain

4.

Lumpuran dituangkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit dan dibiarkan memadat

5.

Selama proses pengendapan tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahanlahan agar diperoleh lapisan yang seragam

6.

Jika pelarut yang dipakai berbeda dengan pelarut untuk kromatografi pelarut lumpuran harus
didesak keluar dengan pelarut pengelusi sebelum cuplikan ditambahkan

7.

Selanjutnya kolom dibiarkan atau dikondisikan paling sedikit selama satu jam dan paling
lama 24 jam.

II.

Cara Kering
1.

Selapis pasir diletakkan pada bagian dasar kolom, bisa juga kapas atau glass wool

2.

Penjerap dituangkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit

3.

Setiap penambahan permukaan diratakan dan dimampatkan sampai 2/3 bagian dari kolom

4.

Setelah semua penjerap dimasukkan, di atasnya diletakkan kertas saring dan ditambahkan
lagi selapis pasir sehingga jika ditambahkan pelarut, permukaan penjerap tidak terganggu

5.

Kemudian pelarut pengelusi dibiarkan mengalir ke bawah melalui penjerap dengan keran
terbuka sampai permukaan pelarut tepat sedikit di atas bagian atas kolom

6.

Selama proses pengendapan tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahanlahan agar diperoleh lapisan yang seragam

7. Selanjutnya kolom dibiarkan atau dikondisikan paling sedikit selama 1 jam atau paling lama
24 jam, sesudah itu kolom baru dapat dipakai