Anda di halaman 1dari 35

Prinsip imunologi pada pemeriksaan

laboratorium klinik

Deparment of Histology and Cell Biology


Faculty of Medicine UGM

Dewi K Paramita

Prinsip imunologi pada pemeriksaan


laboratorium klinik
1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi pada
beberapa teknik pemeriksaan imunologi
2.Berbagai macam labeling dan deteksi pada
pemeriksaan dengan teknik imunologi
3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia dan
immunofluorescence assay

Teknik Imunologi (immunoassay)


Metode deteksi antigen / protein dalam sel, jaringan atau

protein terlarut oleh antibodi sebagai reagen spesifik


(interaksi antigen-antibodi) yang divisualisasi dengan
marker yang dilabel pada antibodi, misalnya pewarna
fluorescent, enzim atau partikel emas, dll.

Prinsip teknik imunologi


Deteksi

antigen/protein:
antigen
dikenali
oleh
antibodi
(Ab)
spesifik
sebagai probe

Molekul antibodi tidak


nampak divisualisasi
dengan label

Antibodi
Daerah pengenalan spesifik
terhadap antigen

Species specific

Sumber antigen/protein yang akan dideteksi

Sel
Jaringan
Protein terlarut (dalam darah blood, serum, cairan

tubuh)

Macam teknik pemeriksaan imunologi &


sumber antigen
Sumber antigen

Teknik imunodeteksi

Jaringan

Imunohistochemistry
(IHC)

Protein terlarut

ELISA
Immunoblotting
immunoprecipitation
FACS
IFA

Sel

Komponen penting pada teknik


imunologi
antigen
Antibodi primer
Antibodi sekunder (jika perlu)
Label : Enzim, fluorescence, dll
Larutan pewarna (kromogen) and substrat

Metode dasar pada teknik imunologi


Direct
Indirect
Sandwich

Direct method (metode langsung)


Label pada antibodi

primer
Keuntungan:
Cepat
Spesifik

Kerugian:
Perlu antobodi primer

dalam jumlah banyak

antigen

Indirect method (metode tidak langsung)


Label pada antibodi sekunder
Keuntungan
Lebih sensitif
Antibodi sekunder dapat

digunakan untuk bermacammacam immunoassay (jika


antibodi primer dari spesies
yang sama)
Kerugian:
Reaksi silang antibodi sekunder

dengan Ig endogenous pada


spesimen

antigen

Capture atau Sandwich (ELISA)


Untuk mendeteksi substansi
yang jumlahnya sangat kecil,
contoh: sitokin

Antibodi primer spesifik yang


mengenali antigen dilekatkan
pada plate

Faktor penting pada teknik imunologi


Pengenceran antibodi (konsentrasi antibodi)
Inkubasi antibodi
Waktu
Suhu
Enzim & substrat, fluorochrom & filter
Kontrol positif
Kontrol negatif

Label pada immunoassay


Label

Radioaktif
Coloidal gold
Virus particle
Ferritin
Fluorescent
Enzyme

Label pada immunoassay


Immunoassay

Label

Westernblotting

Enzim (HRP atau alkaline


phosphatase)

ELISA

Enzim, biotin/streptavidine

Immunofluorescence

Fluorescence dyes

Immunohistochemistry

Enzim, biotin/streptavidine

Flowcytometri

Fluorescence, dyes, tandem dyes

Pemilihan deteksi antibodi:


direct atau indirect

Pemilihan deteksi antibodi:


direct atau indirect

Direct:
label pada antibodi primer
Aplikasi : flow cytometri

Indirect:
Label pada antibodi sekunder

Keuntungan:

Aplikasi : imunostaining
Keuntungan:

Lebih spesifik
background staining lebih
sedikit

Lebih sensitif amplifikasi sinyal


signifikan
Aplikasi lebih felksibel label
dapat bermacam-macam

Label dapat berupa fluorescence,


biotin, atau enzim yang
dikonjugasi pada antibodi
sekunder.

Kerugian:

Background lebih tinggi


nonspecific binding dari antibodi
primer dan sekunder

Keuntungan & kerugian


Direct v.s. Indirect

Bagian dari antibodi yang di label


Gugus amin primer (-NH2) pada residu
lisin di daerah N terminus.

Gugus sulfuhydril (-SH) pada residu


sistein terbentuk secara selektif pada
ikatan bisulfid di daerah hinge region

Residu karbohidrat yang mengandung cisdiol dapat dioksidasi (-CHO)


menjadialdehid aktif terlokalisasi pada
daerah Fc banyak ditemukan pada
antibodi poliklonal

Pemilihan tipe sinyal untuk deteksi:


substrat kolorimetrik atau fluorescence

Labeling dengan enzim

Keuntungan :
shelf life yang panjang
Sensitivitas tinggi
Visualisasi langsung tidak membutuhkan alat yang canggih (contoh alat:
spektrofotometer)
Dibanding label radioaktif tidak berbahaya
Label enzim yang kecil dapat melewati membran memungkinkan untuk
deteksi intraseluler
Visualisasi enzim dengan substrat dapat bertahan lama hingga bertahuntahun
Kerugian :
Melibatkan multiple assay steps
Kadang menggunakan sustrat yang berbahaya
Memungkinakan adanya gangguan dari enzim endogenus
Enzim memberikan resolusi yang buruk pada
Rekomendasi aplikasi : imunohistokimia, imunoblot dan immunoassay kuantitatif dan
kualitatif.

Labeling dengan enzim

Labeling dengan enzim:


HRP v.s AP
Horseradish peroxidase (HRP) v.s Alkaline phosphatase (AP)
HRP

AP

Ukuran

40 kDa

140 kDa

Harga

Relatif murah

Relatif mahal

Stabilitas
(penyimpanan)

Stabil pada suhu


< 0C

Tidak stabil pada


suhu < 0C

Macam substrat

Banyak

Sedikit/terbatas

Kinetika

Cepat

lambat

pH

5-7

8-10

Labeling dengan biotin


Biotin adalah vitamin dengan berat 244 dalton
Banyak ditemukan di jaringan dan darah
Mempunyai afinitas yang besar dengan protein

avidin, streptavidin ikatan terjadi cepat dan tidak


terganggu dengan perubahan pH extrem, pelarut
organik dan agen denaturasi lain.

Molekul kecil dapat dikonjugasi dengan banyak

protein tanpa mengganggu aktivitas protein


tersebut

Labeling dengan biotin:


IHC Avidin-biotin method
ABC method

LSAB method

Labeling dengan fluorescent


Molekul antibodi dapat

dilabel dengan berbagai


macam probe flourecent
Setiap probe fluorescent

mempunyai spektrum
sinyal eksitasi dan emisi

Contoh labeling dengan fluorescein


isothiocyanate (FITC)

Fluorescenct probes

The maximum excitation and


emission wavelength of
commonly used fluorescent
probes

Contoh metode imunohistokimia dan


immunofluorescence assay

EBNA1-IHC (OT1x Mab)

LMP1-IHC (OT21C Mab)

VCA-p18-IHC (OT15E Mab)

Contoh Prosedur imunohistokimia


LABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method
I. Deparafinisation

V. IHC staining proper

Xylene (2 x 10 mins)

Primary Antibody (variable)

Ethanol absolute (2 x 5 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

95% ethanol (2 x 5 mins)

Biotinylated Link Antibody (30 mins)

II. H2O2/ methanol (15 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

RINSE with DISTILLED WATER

Streptavidine-Peroxidase (30 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

III. Antigen Retrieval


Tris buffer wash (2 x 10 mins)

DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins)


Rinse with water
Hematoxyline

IV. Blocking solution (10 min)


(Normal non-immune serum)

Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Mounting

Meminimalisir background staining


Bloking aktivitas endogenous peroxidase
peroxidase dan pseudo-peroxidase pada jaringan normal
dan tumor

Contoh Prosedur imunohistokimia


LABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method
I. Deparafinisation

V. IHC staining proper

Xylene (2 x 10 mins)

Primary Antibody (variable)

Ethanol absolute (2 x 5 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

95% ethanol (2 x 5 mins)

Biotinylated Link Antibody (30 mins)

II. H2O2/ methanol (15 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

RINSE with DISTILLED WATER

Streptavidine-Peroxidase (30 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

III. Antigen Retrieval


Tris buffer wash (2 x 10 mins)

DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins)


Rinse with water
Hematoxyline

IV. Blocking solution (10 min)


(Normal non-immune serum)

Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)

Tris buffer wash (2 x 10 mins)

Mounting

Meminimalisir background staining


Bloking non-specific background staining
Paling sering terjadi: Protein melekat pada kolagen &

jaringan ikat diatasi denga pemberian non-immune


serum
Sebab lain : pengenceran antibodi yang tidak tepat
(terlalu pekat), langkah pencucian yang tidak tepat,
langkah deparafinisasi yang tidak tepat.

Immunoassay with fluorescence labeled

Immunofluorescence assay (IFA): teknik imunostaining

dengan label fluorescence pengamatan dengan


mikroskop fluorescence

Floocytometri

Immunofluorescence Assay
Labeled antibody with a

fluorescence visible marker:

i.e. Fluorescein isothianate


(FITC)

Disadvantage:

Limited to frozen sections


Requires special microscopy
Poor morphologic resolution
Fluorescence is ephemeral,
result have to be photographed

TERI MA KASIH
deardesay@yahoo.com