Ade Setiawan

A.1210190
Tugas mata kuliah budidaya pakan alami

Teknik Isolasi mikroalga

1. Mikro manipulasi
peralatan :

mikroskop terbalik atau mikroskop stereo dengan pembesaran hingga 200 x, walaupun 40100 x pun cukup dalam kebanyakan kasus. Fase kontras atau optik lapangan gelap adalah
keuntungan.
tabung kapiler atau tabung hematokrit dengan diameter 1 mm - 100 mm.
Bunsen dengan api yang kecil.

Tabung silikon sesuai dengan ujung tabung kapiler. Panjang sekitar 300-400 mm,

Pipet tetes (steril),karet atau silikon dot.

Hot plate untuk mengeringkan slide Kaca hingga bersih

Tempat Agar (1,5% Bacto-Agar, misalnya Difco Cat. No. 0140-01) disusun dalam cawan
petri piring (sekali pakai, 90 mm diameter.) Kultur jaringan.
Media steril, biasanya pada konsentrasi hara encer; misalnya F20, F50
Kultur jaringan steril cawan multi-well atau cawan petri steril (misalnya diameter 33 atau 55
mm)

metode:

Dengan api baik dari kompor panas Bunsen dan menarik keluar (memegang di
kedua ujungnya) tabung kapiler untuk membentuk dua micropipettes. Sempit end
harus sekitar dua kali diameter sel yang akan micromanipulated.
Dipanaskan suling air ke titik mendidih di atas hot plate. Ini digunakan untuk
mensterilkan mikropipet antara setiap transfer.
tetes Tempat media steril ke 1,5% agar piring dengan pipet pasteur steril. Atau
menempatkan tiga tetes pada slide kaca.
Dengan silikon tabung melekat mikropipet menyedot dan meniup dengan mulut
sedikit air suling panas. Ini mensterilkan mikropipet tersebut.
Cari sel alga menjadi terisolasi dalam setetes sampel pengayaan. Ketika
mengamati sel, menyedot ke dalam mikropipet tersebut.
Pindahkan sel untuk setetes media steril di piring agar-agar atau slide kaca.
Sterilkan mikropipet tersebut.
Ulangi proses ini untuk "mencuci" sel. Semakin sering sel dicuci kurang mungkin
adalah kontaminasi bakteri. Namun, risiko kerusakan sel meningkat dengan
jumlah waktu sel ditangani. Jumlah optimum dari mencuci akan tergantung pada
jenis ganggang.
Pindahkan sel untuk mencairkan menengah dalam piring kultur jaringan, piring
atau budaya petri tabung.

Tempat budaya kapal di bawah cahaya rendah pada suhu konstan yang sesuai.
Lihat mikroskopis untuk pertumbuhan atau menunggu sampai pertumbuhan
makroskopik dapat dideteksi (3-4 minggu setelah transfer).
Sebuah klonal budaya uni-alga harus hasil dari metode ini.

Untuk sel non-motil besar atau ketika waktu adalah pada premi metode alternatif
adalah untuk mengisolasi ke cawan petri bukan pada slide. Sel Beberapa dari populasi dengan
cepat ditransfer ke pelat bilas pertama dan kemudian dari sana semakin sedikit ke dalam
piring berikutnya. Karena relatif kurang perawatan diambil untuk menghindari perpindahan
sel non-target masing-masing bertindak cawan petri sebagai budaya pengayaan dengan
mudah-mudahan budaya relatif bersih di piring akhir (atau bahkan mungkin klonal). "Bersih"
piring kemudian dapat digunakan sebagai bekal untuk membuat isolasi klonal ketika waktu
memungkinkan.

2. Serial pengenceran
peralatan:
tabung Budaya, (steril) sekrup-capped atau steristoppered (lihat Catatan di bawah).
rak Test-tabung, jaring terbuka.
Media - biasanya encer mis f10, F20.
dispenser otomatis (steril) atau 10 ml pipet kaca steril.
pipet kaca 1 ml atau pasteur (steril), karet atau silikon dot.
Bunsen burner atau nyala api kecil.

metode:
Menggunakan teknik aseptik, mengeluarkan 9 ml media ke masing-masing sepuluh tabung

reaksi dengan dispenser otomatis steril atau steril 10 ml pipet. Label tabung 10-1 untuk 10-10
menunjukkan faktor pengenceran.
aseptik tambahkan 1 ml sampel pengayaan ke tabung pertama (01/10) dan campuran lembut.
Ambil 1 ml pengenceran ini dan menambah tabung berikutnya (10-2), campur dengan lembut.
Ulangi prosedur ini untuk tabung yang tersisa (1O-3 sampai 10-10).
Inkubasi tabung-tabung uji dalam kondisi suhu dan cahaya dikendalikan: (a) Suhu dan
penyinaran - sebagai dekat dengan lingkungan alam mungkin. (b) Cahaya intensitas - sedikit
lebih rendah dari lingkungan alam.
Periksa budaya mikroskopik setelah 2-4 minggu dengan menarik sampel secara aseptik kecil
dari masing-masing tabung pengenceran. Budaya unialgal dapat tumbuh di salah satu tabung
pengenceran yang lebih tinggi misalnya 10-6 untuk 10-10. Jika tabung berisi dua atau tiga
spesies yang berbeda maka mikromanipulasi dapat digunakan untuk memperoleh budaya
unialgal.

Prosedur berikut diperlukan untuk menghilangkan bahan beracun dari tabung budaya
dan topi sekrup. Isi setengah tabung kultur dengan air suling. colokan dengan
steristoppers atau penyerap kapas. Autoklaf. Ambil sekrup-topi dari tabung budaya
dan tempat sisi terbuka di sebuah cawan petri kaca. Tuang air suling sekitar wadah,
ganti atas cawan petri dan autoclave. Dalam kondisi aseptik menghapus sumbat Steri
atau colokan kapas dan mencurahkan air suling. Tabung api dan mengganti
steristopper atau sekrupwadah.
3. Streak plating
Ini adalah metode yang cocok untuk spesies kecil (<10mm) atau ganggang yang tumbuh
dengan baik pada substrat.
peralatan:
cawan petri - steril, sekali pakai, diameter 90 mm
Media - mis f2
Agar - Bacto-Agar, Difco, Cat. Nomor 0140-01
Kawat pengulangan - nichcrome atau platinum
Bunsen burner atau nyala api kecil

 Parafilm
metode:
Siapkan cawan petri yang berisi media pertumbuhan dipadatkan dengan media agar 1-1,5%.
Agar harus -2/3 kedalaman hidangan.
Tempat 1-2 tetes campuran sampel fitoplankton di dekat pinggiran agar-agar. Api
mensterilkan lingkaran kawat. Menggunakan teknik aseptik menggunakan lingkaran steril
untuk membuat garis-garis paralel suspensi pada agar-agar. Perhatikan bahwa ada 16 coretan
(4 set 4) harus dibuat dan seluruh permukaan lempeng agar digunakan (lihat gambar di
bawah).
Tutup dan segel piring dengan parafilm. Invert dan menetaskan bawah cahaya rendah pada
suhu konstan.
Pilih koloni yang bebas dari organisme lain untuk isolasi lebih lanjut. Hapus sampel
menggunakan loop kawat disterilkan dan tempat dalam setetes media kultur steril pada slide
kaca. Periksa secara mikroskopis bahwa spesies yang diinginkan telah diisolasi dan unialgal.
Ulangi prosedur melesat dengan sel alga dari koloni tunggal dan lagi memungkinkan koloni
untuk berkembang. Goresan kedua ini mengurangi kemungkinan kontaminasi bakteri dan
koloni yang mengandung lebih dari satu spesies alga.
transfer yang dipilih koloni ke media cair atau agar.
Gambar Streak plating dengan lingkaran kawat

4. Density sentrifugasi
Dalam persiapan: penggunaan koloid silikon seperti Percoll

5.Antibiotik
Penggunaan antibiotik tidak dianjurkan saat mengisolasi strain yang akan digunakan untuk studi
fisiologis atau ekologi sebagai klon mutan dapat dihasilkan yang tidak mencerminkan populasi di
alam liar. Namun untuk spesies yang digunakan dalam budidaya, genetika populasi, biologi
molekuler, toksikologi atau bioproduk skrining mungkin perlu untuk bekerja dengan axenicstrains dan
kadang-kadang
ini
hanya
dapat
dicapai
melalui
menggunakan
antibiotik.
Pilihan antibiotik dibuat berdasarkan keberhasilan mereka melawan Gram (+) dan / atau Gram (-)
bakteri dan untuk modus tindakan, baik sebagai inhibitor sintesis dinding sel atau pertumbuhan sel
melalui penghambatan sintesis protein. Untuk inhibitor dinding sel menjadi benar-benar efektif

bakteri perlu secara aktif oleh karena tumbuh sangat disarankan untuk menambahkan sejumlah kecil
bahan organik untuk media pengobatan. Untuk alasan ini menambahkan antibiotik tambahan yang
pertumbuhan sel lambat mungkin kontra produktif maka pengobatan kaskade mana beberapa
antibiotik diberikan secara berurutan lebih efektif daripada pengobatan koktail di mana dosis
campuran tunggal diberikan. Inhibitor dinding sel umumnya berasal dari keluarga penisilin, seperti
Penisilin G yang bertindak terutama terhadap Gram (+) bakteri atau keluarga cephalosporin betalaktam yang mengganggu integritas dinding sel bakteri, sehingga lebih berpori dan termasuk
antibiotik spektrum luas seperti Imipenem. Aminoglikosida seperti gentamisin, kanamisin, neomisin
dan streptomisin menempel ribosom sel bakteri dan mengganggu produksi protein. Menggunakan Blaktam pertama untuk meningkatkan dinding sel porositas kemudian memungkinkan suatu bagian
lebih cepat dari aminoglikosida untuk kemudian mengganggu sintesis protein.
Agen antijamur termasuk cycloheximide (= acti-dion), nistatin atau amfoterisin B, Germanium
dioksida (GeO2) digunakan sebagai suplemen media dengan Lewin (1966) sebagai sarana untuk
menghilangkan diatom pada konsentrasi akhir dari 10 mg / L. Ini bertindak sebagai inhibitor
pembelahan sel daripada racun.
Konsentrasi yang disarankan bervariasi (https://listserv.heanet.ie/cgi-bin/wa?A2=ind9706&L=algael&T=0&P=270) dan Markham dan Hagmeier, (1982) menemukan konsentrasi serendah 0,045-0,179
mg / L yang cukup untuk membunuh diatom mencemari budaya rumput laut mereka. Di CCLM kita
menggunakan konsentrasi akhir dari 0,4-1 mg / L. Seperti GeO2 sulit untuk membubarkan,
konsentrasi stok awal yang lebih rendah meningkatkan pembubaran jadi kami membuat larutan stok
dari 2 mg GeO2 dalam 100 ml air MilliQ dan filter-mensterilkan. Kami menambahkan larutan stok
pada konsentrasi 1 - 2,5 ml per 50 ml media pengayaan. Jika menghapus diatom adalah tujuan maka
semua sumber silika harus dihapus dari lingkungan budaya karena itu larutan stok disimpan dalam
botol polikarbonat dan pengayaan atau isolasi budaya dilakukan dalam gudang budaya plastik.