Manual de Inocuidad Microbiana de Los Alimentos

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
MANUAL DE LABORATORIO
INOCUIDAD MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS
AUTORES:
M. en C. JUAN CARLOS BENITEZ SERRANO.
M.S.P. CARLOS CABRERA MALDONADO.
D en C. ANA MARTA DE LOS ANGELES LOBO SANCHEZ.
M.S.P. JESUS LUZURIAGA GALICIA.
D. en C. FAUSTO TEJEDA TRUJILLO.
M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA.
2013

NDICE
NMERO DE
TTULO
PGINA
PRCTICA
Prctica 1
Fundamentos del Lab. de Inocuidad Microbiana de los

Alimentos
Prctica 2
Preparacin de medios de cultivo
Prctica 3
Preparacin de diluciones
11
Prctica 4
Recuento de bacterias mesoflicas aerobias por la tcnica
14
vaciado en placa
Prctica 5
Recuento de bacterias coliformes totales por la tcnica de
18
vaciado en placa
Prctica 6
Recuento de bacterias lcticas por vaciado en placa
21
Prctica 7
Recuento de hongos y levaduras por vaciado en placa
24
Prctica 8
Recuento de Staphylococcus aureus por la tcnica de
27
extensin en superficie
Prctica 9
Cuantificacin de Bacillus cereus
30
Prctica 10
Determinacin de bacterias coliformes totales en agua e
33
investigacin de E. coli en alimentos por la tcnica del

nmero ms probable (N.M.P.).
Prctica 11
Investigacin de Salmonella spp
36
Prctica 12
Cuantificacin der Clostridium perfringens
41
Prctica 13
Investigacin de Vibrio cholerae O1
44
Prctica 14
Determinacin de Vibrio parahaemolyticus por la tcnica
46
de N.M.P.
Prctica 15
Determinacin de Listeria monocytogenes
48
Prctica 16
Anlisis microbiolgico de alimentos enlatados
52
Bibliografa
57

Prctica No. 1
Fundamentos del laboratorio de Inocuidad Microbiana de los Alimentos
Introduccin.
La Inocuidad Microbiana de los Alimentos es una rama de la Ciencia de los Alimentos, cuyo
objetivo es ayudar a la elaboracin de alimentos sanos inocuos o de buena calidad sanitaria,
considerando sus caractersticas generales, su ecologa, su resistencia al medio ambiente, su
capacidad para sobrevivir y desarrollar en los propios alimentos, las consecuencias de ese
desarrollo y los factores que influyen en todo esto. Actualmente son cuatro los grupos de inters
sanitario, los que llenan el campo de accin de la Inocuidad Microbiana de los Alimentos:
a) Microorganismos deterioradores.
b) Microorganismos indicadores.
c) Microorganismos patgenos, y
d) Microorganismos tiles para el hombre
Los microorganismos deterioradores son aquellos que afectan las caractersticas organolpticas
de los alimentos, con ellos se estudian los tipos de procesos que tienen lugar, las causas que los
propician y desencadenan y los medios para evitarlos y controlarlos.
Los microorganismos indicadores, son aquellos que se agrupan en funcin de ciertas

caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y ecolgicas a travs de los cuales adquieren un
significado especial. Estos grupos de microorganismos se consideran indicadores de fuentes de
contaminacin indeseable o de otro tipo de accidente que sugiere la comisin de malas prcticas
higinicas de trabajo durante el manejo del agua y de los alimentos.
Los microorganismos patgenos, definidos como aquellos que pueden causar algn dao a la
salud. Por razones obvias, en el presente manual se describirn slo algunas de las bacterias
patgenas vehiculizadas por alimentos.
Los microorganismos tiles para el hombre, son aquellos que se han adicionado intencionalmente
a los alimentos con el propsito de proporcionar alguna caracterstica organolptica especial.
El Laboratorio de Inocuidad Microbiana de los Alimentos, dentro de la Epidemiologa y

Tecnologa de Alimentos, es un valioso recurso en cuestiones tales como:
a)
Control de la calidad sanitaria de materias primas e ingredientes.
b)
Control de la potabilidad desde el punto de vista bacteriolgico del agua.
c)
Diagnstico de la calidad sanitaria de un producto terminado.
d)
Diagnstico diferencial de la causa de alteracin de un alimento.
e)
Evaluacin de la eficiencia de los procesos de lavado y desinfeccin del equipo, utensilios

y superficies de trabajo.
f)
Evaluacin de la eficiencia de sustancias y agentes germicidas.
g)
Evaluacin de la eficiencia de los procesos de pasteurizacin y esterilizacin.
h)
Diagnstico de portadores asintomticos de microorganismos patgenos entre el personal

que maneja alimentos.
i)
Diagnstico diferencial de la causa de un brote de gastroenteritis y otro tipo de

infecciones o intoxicaciones asociadas al consumo de agua y alimentos.
j)
Rastreo de fuentes de contaminacin.
k)
Investigacin del comportamiento de especies microbianas en alimentos y otros sustratos.
l)
Estudio de la capacidad de autoconservacin de un alimento en relacin con su actividad

microbiana.
m)
Estudio de la eficiencia y ptimas condiciones de operacin de conservadores en los

alimentos.
n)
Control de la pureza y actividad de los cultivos utilizados en la fabricacin de alimentos.
En el proceso de control la accin primaria que se pone en juego es la inspeccin. De ella puede
emerger la necesidad de practicar anlisis de laboratorio en muestras de alimentos, materias
primas, especmenes humanos, superficies del equipo, agua, del producto durante su
procesamiento o del medio ambiente.
Deficientes manejos en la recoleccin y transporte de la muestra conducen a resultados ajenos a

la realidad que se pretende poner de manifiesto. La realidad es que el reporte de laboratorio
refleja justamente la imagen microbiana de una parte del producto al tiempo que se retira la
alcuota para iniciar el anlisis, no por fuerza la que tena toda la muestra al ser recolectada.
El pH, el contenido de humedad, la temperatura del medio, el potencial oxidorreduccin, la

acumulacin de productos metablicos, el agotamiento de nutrientes y otros factores se conjugan
fatalmente y a travs de efectos antibiticos, antagnicos, sinrgicos y an mutagnicos, forman
una constelacin de efectos y mecanismos en los que difcilmente pueden sustraerse la flora
microbiana en su conjunto o individualmente considerada.
Agrguese a lo anterior, que desde el punto de vista puramente analtico, los resultados del
laboratorio dependen de:
a)
Las condiciones en que se efecto el muestreo y el transporte de la muestra.
b)
La tcnica de anlisis utilizada.
c)
La calidad de los reactivos y medios de cultivo.
d)
La destreza del tcnico que ejecuta el anlisis.
e)
El apego que observe el analista a la tcnica prescrita.
f)
La presencia de sustancias que interfieren con el desarrollo microbiano, y
g)
El estado fisiolgico de los microorganismos presentes.
As el resultado es slo una expresin convencional de la imagen microbiana de un producto,

configurada en funcin de todos esos factores.
Al interpretar, por otra parte el resultado de un anlisis de laboratorio hay que considerar otros
elementos. La flora microbiana de un alimento est fuertemente condicionada por la tecnologa
utilizada en su fabricacin y por la proteccin que se le confiera contra el ingreso de
microorganismos y su multiplicacin. La abundancia y distribucin de esos microorganismos en

el medio ambiente a su vez se encuentra muy afectadas por las condiciones que en l imperen y
an por los hbitos de las comunidades. La falta de objetividad al interpretar el hallazgo y
abundancia de determinados grupos de microorganismos lleva fcilmente a conclusiones
errticas.
RECUENTOS MICROBIANOS
Con mucha frecuencia es necesario determinar el nmero de microorganismos que contiene el
agua y los alimentos, durante su fabricacin y control sanitario. Entre los objetivos perseguidos
pueden citarse los siguientes:
a)
Tendencia a correlacionar la abundancia de ciertos microorganismos en algunos alimentos

y las condiciones sanitarias en las que fueron elaborados y/o conservados: bacterias
mesoflicas aerobias en leche y hongos en mantequilla.
b)
Determinar la calidad sanitaria de las materias primas: cuenta microscpica en leche,

hongos en salsa de jitomate, etc.
c)
Evaluar la eficiencia de un proceso de desinfeccin, purificacin o pasteurizacin:

coliformes en aguas negras, coliformes en ostiones, mesoflicos aerobios en equipos y
envases.
d)
Determinar el adecuado funcionamiento de cultivos microbianos en la obtencin de

alimentos madurados: bacterias lcticas en quesos.
e)
La probabilidad de incriminar algunas bacterias como causa de toxiinfeccin alimentaria:

S. aureus, C. perfringens y B. cereus.
f)
Grado de frescura que el alimento guarda: bacterias lcticas en salchichas.
g)
Determinacin, en algunos casos, de la vida de anaquel de un alimento: bacterias

psicroflicas en leche cruda.
h)
La evaluacin de los medios de cultivo y agentes bacteriostticos que se incluyen en su

formulacin.
Dada la gran versatilidad de los microorganismos en cuanto a sus demandas nutricionales y

condiciones para desarrollar (tipo
y concentracin de nutrientes, acidez, potencial
oxidorreduccin, salinidad, estado fisiolgico de las clulas, etc.) y de las condiciones del
material por estudiar (presencia de inhibidores, presencia de flora asociada, humedad, etc.) no es
posible disponer de un solo medio de cultivo que permita la proliferacin de todas las variedades,
y dentro de cada una de stas, de todas las clulas viables presentes. Por estas razones ms que
recuentos lo que estas tcnicas proveen son medios para estimar contenido microbianos.
TECNICAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS

TECNICA
FUNDAMENTO
VARIANTE
GENERAL
Directa sin cultivo
Cuenta individual
Microscopa
clulas o grupos
Semi - indirecta
Cuenta individual
Vaciado en placa
con cultivo
de colonias
Inoculacin en superficie
Filtro de membrana
Requiere desarrollo
N.M.P.
Indirecta
Microbiano
Reductasas
no hay
recuentos
No requiere desarrollo
Centrifugacin
Microbiano
Turbidimetra

Prctica No. 2
Preparacin de medios de cultivo
Introduccin.
Medio de cultivo es un sustrato que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo de los
microorganismos. Comercialmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular,
aunque puede presentarse tambin hidratado y preparado. Por su aspecto fsico, los medios de
cultivo preparados pueden ser: lquidos, semislidos y slidos.
Medios lquidos: se emplean fundamentalmente para:
a) Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la
produccin de metabolitos especficos, y
b) Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que
otros se multipliquen, y
c) Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas.
Medios semislidos: se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen
estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda.
Medios slidos: se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos.
Por su uso, se clasifican en:
a)
Medios de pre enriquecimiento: son lquidos y no contienen agentes inhibidores, su

funcin es revitalizar a los microorganismos estresados.
b)
Medios de enriquecimiento: medios lquidos que contienen inhibidores y que por lo tanto
estimulan el desarrollo un microorganismo e inhiben el desarrollo de otros.
c)
Medios selectivos y diferenciales: medios slidos que contienen inhibidores y que por lo
tanto estimulan el desarrollo un microorganismo e inhiben el desarrollo de otros.
d)
Medios de transporte: sirven para transportar los especmenes que contienen a los
microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a
efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la
flora microbiana en los especmenes.
Objetivo.
Conocer la importancia de la preparacin adecuada de los diferentes medios de cultivo utilizados
en el Laboratorio de Microbiologa Sanitaria.
Desarrollo.
1. Leer las cuidadosamente las instrucciones del fabricante, teniendo cuidado principalmente
en las condiciones de esterilizacin o adicin de algn material extra.
2. Hacer los clculos necesarios para conocer la cantidad de medio de cultivo necesario de
acuerdo al volumen que se va a preparar.
3. Seleccionar un recipiente de por lo menos el doble del volumen a preparar.
4. Medir la cantidad de agua necesaria y depositar una parte de esta en el recipiente
seleccionado.
5. Pesar con ayuda de una balanza granataria o digital.
6. Agregar el medio en el recipiente, agitar suavemente y adicionar el resto del volumen de
agua.
7. En el caso de los agares y de algunos caldos, disolver con ayuda de calor.
8. Ya disuelto, colocar en frascos o tubos.
9. Esterilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Cuestionario.
1. Defina qu es un medio de cultivo?
2. Cmo se clasifican?
3. Cul es la caracterstica principal de un medio de pre enriquecimiento?

4. Qu diferencia existe entre un medio de cultivo de enriquecimiento y uno selectivo y
diferencial?
10

Prctica No. 3
Preparacin de diluciones
Introduccin.
Esta prctica est orientada a proporcionar las guas generales para la preparacin de diluciones
para el examen microbiolgico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este
campo de aplicacin, estas guas pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y
para otros requerirse otros mtodos diferentes. Sin embargo, en todos los casos donde sea
posible se recomienda apegarse a estas guas y modificarse nicamente cuando sea necesario.
La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de
los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis.
La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo
reducir el nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la
incubacin, la observacin de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en
el caso de placas.
Objetivo:
Realizar las diluciones decimales necesarias para realizar los recuentos de los diferentes
microorganismos de inters sanitario, utilizados para la determinacin de su calidad sanitaria.
Desarrollo:
Preparacin de la dilucin primaria.
Muestras lquidas:
11
Muestras lquidas como agua, leche, refrescos, etc., en las cuales la distribucin de
I.
microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos.

II.
Muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo

en bao de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 min y homogeneizar agitando
vigorosamente.
a) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm

efectuados en un tiempo de 7 seg o 10 seg en Vortex. Tomar 1 mL de la muestra y diluir
con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando
el contacto entre la pipeta y el diluyente.
b) Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo
volmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describi.
Muestras slidas o semislidas.

Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C
durante 18 y no ms de 24 h antes de proceder a su anlisis.
a) Pesar una cantidad de 10 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica
estriles de tamao adecuado.
b) Adicionar 90 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.
c) Homogeneizar en el Stomacher por 1 min hasta obtener una suspensin completa y
homognea segn se indique en la tcnica correspondiente para cada alimento.
d) Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada
tomando de las capas superiores de la suspensin.
El homogeneizador peristltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por
ejemplo, aquellos con partculas agudas o constituyentes que no se dispersen fcilmente).
Preparacin de las diluciones decimales adicionales.
a) Transferir 1 ml de la dilucin primaria 1:10, en un tubo que contiene 9 mL de diluyente
estril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
12
b) Agitar el tubo 25 veces en un ngulo de 30 cm durante 7 seg, o bien, durante 10 seg con
ayuda de un agitador Vortex.
c) La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular,
dependen de:
i.
Existencia de una NOM o criterio microbiolgico de aceptacin.
ii.
Tratar de obtener una caja contable, y
iii.
Condiciones en que se encontraba la muestra durante su recoleccin.
d) Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la
capacidad total de la pipeta.
e) Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de lquido equivalente a su capacidad
total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una rea de la caja Petri sin
lquido.
f) Mientras s afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del
cuello del frasco y mantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe
inclinarse lo necesario.
Duracin del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del anlisis y
stas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su
preparacin.
Cuestionario.
1.
Por qu es necesario diluir la muestra?
2.
Cmo saber que diluciones debe utilizar?
3.
Qu tipos de diluyente puede utilizar?
4.
Cmo agitar los tubos en que se efectan las diluciones?
13

Prctica No. 4
Recuento de bacterias mesoflicas aerobias por la tcnica de vaciado en placa
Introduccin.
Este grupo de microorganismos indicadores es el que con mayor frecuencia se utiliza en la
Microbiologa Sanitaria. El recuento de colonias bacterianas en medios de cultivo con un
adecuado soporte nutricional y libre de agentes inhibidores es ampliamente utilizado con diversos
propsitos en el anlisis de alimentos, perecederos o no, agua, equipo y otros productos. Se
pretende contar el mximo nmero de microorganismos, y cuando la incubacin se ha realizado
entre 20-37 se le designa como recuento de bacterias mesoflicas aerobias.
El estudio de la flora bacteriana mesoflica aerobia es la prueba ms utilizada para todos

aquellos propsitos que tienden a explorar el efecto de diferentes agentes fsicos y qumicos en la
microbiologa de un alimento durante su fabricacin o conservacin, cuando no existe un
problema concreto que implique el uso de otros grupos indicadores especficos. Solo las bacterias
psicrotrfas la sustituyen o la complementan en el caso de los productos para los que suele
emplearse la refrigeracin.
Objetivo:
Realizar el recuento de bacterias mesoflicas aerobias a partir de agua y alimentos e
interpretar su significado sanitario.
Desarrollo:
Preparacin de material y de muestras
1. Estimar el nmero de cajas, pipetas y frascos o tubos de dilucin que se vayan a necesitar.
14
2. Anota clave, fecha y dems informacin que permita identificar la caja dentro del estudio.
Hacer las anotaciones en la tapa de la caja procurando reducirlas al mnimo.
Preparacin, seleccin y medicin de la alcuota.

1. La muestra recolectada de un lote debe suponerse representativa de ste. Esa muestra a su
vez es objeto de un nuevo muestreo cuando se extrae de ella la alcuota que se va a analizar.
Habr por tanto, de retirarla cuidando de no incurrir en una seleccin o contaminacin.
2. Efectuar la medicin o pesada sobre la mesa de trabajo dentro del orden y cuidado
necesarios para evitar contaminaciones. El sobrante de la muestra conviene conservarlo en
refrigeracin, en previsin de algn accidente.
3. El retiro de la alcuota obliga al empleo de utensilios estriles y fcilmente manejables.
Para este fin puede hacerse uso de cucharas, cuchillos, esptulas, abatelenguas y pinzas.
4. Cuando el producto es slido y muy heterogneo (alimento cocinado) macerar o dividir
finamente una muestra grande (100-500 g) y a partir de sa obtener la alcuota por analizar.
5. De especial inters es el tamao de la alcuota. Puede establecerse que la precisin y
exactitud de los resultados mejoran conforme se hace uso de una alcuota de mayor tamao.
Alcuotas menores a 10 g deben evitarse.
6. Los productos lquidos se miden con pipeta de capacidad conveniente, de preferencia con la
correspondiente al volumen a medir.
Preparacin de las diluciones.

1. Se requiere hacer diluciones por dos razones bsicas:
Un elevado contenido de microorganismos en el producto.
Tratase de una muestra slida o insuficientemente fluida que dificulte su incorporacin
directamente al medio de cultivo.
2. Al preparar diluciones es necesario considerar algunos factores que pueden influir en el
resultado:
La grasa del alimento dificulta la dispersin homognea de los microorganismos.
El fundamento de la tcnica: una colonia se origina a partir de una sola clula viable.
La liberacin de los microorganismos de algunos alimentos no ocurre con la misma
facilidad.
15
El uso de la licuadora tiene efectos variados sobre los microorganismos y el alimento,

por lo que se recomienda actualmente el uso de un homogenizador (Stomacher).
Se recomienda no exceder de 20 min desde que el producto fue puesto en contacto con
el diluyente hasta su incorporacin con el medio de cultivo.
Las mediciones de los volmenes de muestras, diluciones e inculos constituyen una
importante fuente de error cuando la maniobra no se realiza en forma correcta.
3. Agitar los frascos o tubos con diluyente y muestra siempre en la misma forma: 25
movimientos en un arco de 30 cm completados durante 7 seg. Si existe una cantidad
excesiva de partculas mayores en suspensin o grasa, dejar sedimentar o flotar y tomar la
alcuota hacia el centro del recipiente.
Inoculacin de las cajas.

Colocar 1 mL de cada dilucin en el fondo de la caja y destapar sta solo lo suficiente
para introducir la pipeta con una inclinacin de unos 45C. No soplar.
Adicin del medio de cultivo.

1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar cuenta estndar fundido y enfriado en
bao Mara a 45-48C. Inmediatamente incorporar el inculo al medio por rotacin de la caja
alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha. Evitar el derrame
de lquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparacin de la
primera dilucin hasta la incorporacin del medio de cultivo a todas las cajas no exceder de
20 min y preferentemente 10 min.
2. Evitar prcticas viciosas como son la utilizacin de baos Mara con un nivel de agua por
debajo del nivel del medio de cultivo en las botellas o matraces, introducir estos recin
extrados del autoclave, utilizarlos cuando la temperatura actual se encuentre muy por encima
de los 46C o reutilizar sobrantes en los frascos para nuevas pruebas.
3. Incluir cada da y para cada lote de medio de cultivo y diluyente, cajas control preparadas en
idntica forma, omitiendo la adicin de muestra.
4. El medio de cultivo que se utilice debe corresponder precisamente al que se especifique para
cada caso.
16
Incubacin.
La determinacin de bacterias mesoflicas aerobias suele requerir de temperaturas y
tiempos de incubacin: que dependen del producto en estudio: 24 h en el agua, 48 en la leche y
72 en alimentos desecados.
Recuentos de colonias.
El recuento de las colonias por s mismo demanda cuidado, habilidad, conocimientos y
responsabilidad a fin de incluir en el todas aquellas que han desarrollado y no ms que puedan
resultar por error o confusin.
Para efectuar el recuento es necesario contar con un contador de colonias tipo Quebec que
permite la iluminacin adecuada sobre un fondo oscuro, un buen aumento y una gua
cuadriculada que facilita el trabajo.
La presencia de colonias extendidas, burbujas de aire, y partculas de alimento, son

artificios que no el aparato, sino el analista debe ser capaz de interpretar.
Cuestionario:
1. Cul es el fundamento del recuento por la tcnica de vaciado en placa?
2. Qu superficie tiene la caja de vidrio?
3. Cmo se agitan los tubos en que se hacen las diluciones?
4. A qu temperatura se mantienen los medios de cultivo ya fundidos?
17

Prctica No. 5
Recuento de bacterias coliformes totales por la tcnica de vaciado en placa
Introduccin.
El concepto de bacterias coliformes, fue aplicado en un principio para referirse a todas
aquellas bacterias semejantes a Escherichia coli. Los coliformes se definen como bacterias
aerobias o facultativamente anaerobias, Gram negativas, no esporuladas, que fermentan la lactosa
con produccin de gas dentro de las primeras 48 h de incubacin a 35. De acuerdo con el
desarrollo de las tcnicas bacteriolgicas, al disearse medios como el agar bilis-rojo violeta se
encontr conveniente limitar el perodo de incubacin de las placas a 24 h y por razones de orden
prctico, aquellas colonias que presentan una determinada apariencia al trmino del periodo de
incubacin, se considera como coliformes.
Hay que hacer notar que existen cepas aberrantes (muestran cierta morosidad para
fermentar la lactosa) que no se cuentan como coliformes por su comportamiento en esos medios.
Objetivo.
Realizar el recuento de bacterias coliformes totales a partir alimentos e interpretar su
significado sanitario.
Desarrollo.
Preparacin de material y de muestras.
18


Seguir de la misma forma como se seala para el recuento de bacterias mesofilicas aerobias.


1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar rojo violeta bilis fundido y enfriado en
bao Mara a 45-48C. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio por rotacin de la caja
alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha. Evitar el derrame
de lquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la preparacin de la
19
primera dilucin hasta la incorporacin del medio de cultivo a todas las cajas no exceder de
20 min.
2. Una vez gelificado el medio, agregar una sobrecapa de 3 4 mL.
cada caso.
Incubacin
La determinacin de bacterias coliformes totales se incuban por 24 h a 35C.
Solo se contaran aquellas colonias de color rojo o guinda con o sin halo rosa, redondas o
elipsoidales y que se encuentren dentro del seno de agar.
Cuestionario.
1. A que se debe el color rojo o guinda de las colonias en el agar rojo violeta bilis?
2. Por qu se agrega una sobrecapa del medio de cultivo?
3. Cul es el significado de la presencia de bacterias coliformes en alimentos cocinados?
20

Prctica No. 6
Recuento de bacterias lcticas, por la tcnica de vaciado en placa
Introduccin.
En la actualidad se definen como bacterias Gram positivas, no esporuladas, fermentadoras de
carbohidratos con produccin del cido lctico, tolerantes a los cido (capacidad para desarrollar
a pH relativamente bajos), catalasa negativa y hbitat no aerbico.
Todas las cualidades
admiten cierta flexibilidad, a excepcin de la tincin de Gram. Entre los lcticos existen especies
psicrfilas, mesfilas y termfilas. El grupo comparte entre sus miembros una caracterstica
significativa: son nutricionalmente exigentes.
Ecologa.
a) En vegetales: aunque no se recuperan constantemente a partir del suelo, al parecer esto se
favorece con la participacin de insectos.
b) En los alimentos: existen normalmente en una gran variedad de alimentos tanto crudos
(verduras y frutas) como procesados (lcteos y crnicos) en nmero variable.
c) En animales y hombre: las bacterias lcticas se localizan en el intestino, cavidad oral y vagina,
donde juegan un papel importante en la salud. Materia fecal del hombre, pollos y cerdos: 300
millones UFC/g. En la cavidad oral pueden originar un efecto patgeno, ya que la dentina es
susceptible a la accin de los cidos provenientes de las fermentaciones. En la vagina, los
lactobacilos constituyen parte de la flora normal. Su presencia se relaciona con una baja
notable de la acidez de esta zona. Por mucho tiempo se pens que solo L. acidophilus,
constitua la nica especie que colonizaba la vagina, pero estudios recientes han demostrado la
presencia de L. plantar, L. fermenta, L. bullerais y otros.
21
Objetivo.
Realizar el recuento e identificacin de las bacterias cido lcticas a partir de productos
fermentados comerciales.
Desarrollo.
Preparacin de material y de muestras


Seguir de la misma forma como se seala para el recuento de bacterias mesoflicas aerobias.
Inoculacin de las cajas
22


1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar APT (Agar - Polimixina Triptona)
fundido y enfriado en bao Mara a 45-48C. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio
por rotacin de la caja alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a
derecha. Evitar el derrame de lquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido
desde la preparacin de la primera dilucin hasta la incorporacin del medio de cultivo a todas
las cajas no exceder de 20 min.
cada caso.
Incubacin.
La determinacin de hongos y levaduras se incuban a 30C por 48 h.
Se contaran como bacterias cido lcticas aquellas colonias de color blanco amarillento,
de 1 a 3 mm de dimetro.
Cuestionario.
1. Qu caractersticas comunes presentan las colonias de bacterias cido lctico?
2. Diferencie probitico de prebitico.
3. Cite por lo menos 2 medios de cultivo utilizados para el recuento de BAL?
23

Prctica No. 7
Recuento de hongos y levaduras por la tcnica de vaciado en placa
Introduccin.
Los hongos y levaduras estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar
formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos
sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoqumico de stos, debido a la
utilizacin en su metabolismo de los carbohidratos, cidos orgnicos, protenas y lpidos
originando mal olor, alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados.
Adems los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos txicos termoresistentes, capaces de
soportar algunas sustancias qumicas, as como la irradiacin y presentan capacidad para alterar
sustratos desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al
establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilizacin como un indicador de
prcticas sanitarias inadecuadas durante la produccin y el almacenamiento de los productos, as
como el uso de materia prima inadecuada.
Objetivo.
Realizar el recuento de hongos y levaduras a partir alimentos e interpretar su significado
sanitario.
Desarrollo.
Preparacin de material y de muestras.
24


Seguir de la misma forma como se seala para el recuento de bacterias mesoflicas aerobias.


1. A cada caja inoculada, adicionar 12-15 mL. del agar papa dextrosa acidificado fundido y
enfriado en bao Mara a 45-48C. Inmediatamente incorporar el inoculo al medio por
25
rotacin de la caja alternando con 6 movimientos circulares y 6 rectos de izquierda a derecha.

Evitar el derrame de lquido o contacto con la tapa de la caja. El tiempo transcurrido desde la
preparacin de la primera dilucin hasta la incorporacin del medio de cultivo a todas las cajas
no exceder de 20 min.
cada caso.
Incubacin.
La determinacin de hongos y levaduras se incuban a 22C por 3 5 das.
Se contaran como hongos aquellas colonias de aspecto algodonoso de cualquier color,
mientras que las colonias de levaduras, son de generalmente de color blanco, aunque algunas
llegan a presentar diferentes colores.
Cuestionario.
1. Qu funcin tiene el cido tartrico adicionado al agar papa dextrosa?
2. Qu significado tiene la presencia de hongos en los alimentos?
3. Cul es el significado de un elevado nmero de hongos en alimentos lcteos?
26

Prctica No. 8
Recuento de Staphylococcus aureus por la tcnica de extensin en superficie
Introduccin.
Las tcnicas para el recuento de colonias por inoculacin en superficie poseen atributos que para
ciertos propsitos desplazan a las de vaciado en placa. Las tcnicas ms frecuentemente
utilizadas son: la tcnica de la gota de Miles y Misra y la de extensin en superficie. La tcnica
es utilizada para la cuantificacin de S. aureus.
Entre las ventajas que presenta la tcnica estn:

a) La disponibilidad de placas ya preparadas para efectuar las inoculaciones.
b) Una mejor definicin de la morfologa colonial para fines adicionales al mero recuento.
c) Una mayor probabilidad de disponer de subcultivos puros a partir de las colonias
desarrolladas.
d) Una condicin ms favorable para el desarrollo de los microorganismos aerobios estrictos.
e) La omisin del dao que sufren algunas clulas durante el vaciado del medio de cultivo
caliente (choque trmico).
f) La presencia de partculas de alimento o la turbiedad del medio del cultivo que tanto
dificultan el recuento de las colonias en la tcnica de vaciado en placa, no tiene efecto
alguno sobre los recuentos de las colonias desarrolladas en la superficie.
Esta tcnica no se recomienda para recuentos menores de 3,000 UFC/g. o mL.

S. aureus, son cocos Gram positivos, de 0.5-1.5 de dimetro, inmviles y no esporulados. Se
encuentran distribuidos en racimos, son facultativamente anaerobios, de metabolismo oxidativo
y fermentativo. Son catalasa positivo, oxidasa negativo. Son halotolerantes (10% de NaCl). Su
27
temperatura ptima de crecimiento es de 30-37C. Frecuentemente son recuperados a partir de

alimentos, polvo y agua. Produce una toxina termoestable causante de intoxicaciones
alimentarias. S. aureus es el tpico microorganismo causante de una intoxicacin alimentaria. Se
ha estimado que ste microorganismo es el responsable de alrededor de un 13 a 30% de las
enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) en los Estados Unidos. Algunos autores
marcan que el nmero en casos de dicho envenenamiento alimentario oscila aproximadamente
entre 1 milln y 2 millones por ao. La forma de contaminar a los alimentos es por toser o
estornudar en los mismos, aunque usualmente es cuando se presenta un manipuleo por portadores
asintomticos.
Se han reportado que en casos severos se presentan calambres musculares y cambios

transitorios en la presin sangunea. La recuperacin generalmente toma dos das, sin embargo,
esto no es usual por completo, por lo que la recuperacin puede tomar hasta tres das y algunas
veces ms tiempo en casos severos. Una vez remitidos los sntomas, la persona afectada no posee
inmunidad demostrable frente a los sucesivos ataques. Aunque los animales se vuelven
resistentes a la enterotoxina como consecuencia de la administracin de dosis orales repetidas.
La cantidad mnima de toxina que se necesita para causar la enfermedad en el hombre es

de aproximadamente 200 ng, aunque unos autores muestran que una dosis de toxina menor que
un microgramo (g) en un alimento contaminado puede producir sntomas de intoxicacin
alimentaria estafiloccica, ste nivel de toxina es alcanzada cuando la poblacin del estafilococo
excede las 100,000 cel/g.
Objetivo.
Conocer un mtodo alternativo de recuento de bacterias y valorar sus ventajas con
respecto a la tcnica de vaciado en placa.
Desarrollo.
Preparacin de material, muestras, seleccin y medicin de la alcuota y de las diluciones.
Semejante que en la tcnica de vaciado en placa.
28
Inoculacin de las cajas

Colocar 0.1 mL de cada dilucin seleccionada sobre placas con Agar Baird Parker.
Extender con ayuda de una varilla de vidrio, hasta que el inculo se seque.
Incubacin.
Cuestionario.
1. Cite por lo menos 4 ventajas de la tcnica de extensin en superficie, sobre la de vaciado
en placa.
2. Cul es el medio de eleccin para el recuento de S. aureus a partir de alimentos?
3. Menciones las caractersticas morfolgicas de S. aureus en ese medio de cultivo?
29

Prctica No. 9
Cuantificacin de Bacillus cereus
Introduccin.
El inters sanitario por este microorganismo se ha manifestado hasta hace muy pocos aos en
Amrica, aunque el primer reporte confirmado de su papel como agente etiolgico de
gastroenteritis se remota al ao de 1950 en Europa.
Bacillus cereus pertenece al tipo de los bacilos aerobios esporulados, cuyo cuerpo no se
deforma por la espora, es vacuolado y tiene un dimetro mayor de 0.9 micras por 2.9 a 5.2 de
longitud. Forma cadenas cortas o hasta de 10 clulas y sus esporas son ovales y centrales o
paracentrales. La bacteria es mvil y los extremos de su cuerpo cuadrados o ligeramente
redondos. Es Gram positivo, aerobio, catalasa positiva, hidroliza el almidn, la casena y
fermenta la glucosa, sacarosa y trehalosa. Es Voges-Proskauer positivo y reduce los nitratos a
nitritos. No fermenta la xilosa, lactosa, sorbitol, inositol, manitol, arabinosa, galactosa, manosa y
dulcitol; no produce H2S ni indol. Produce beta hemolisis. El germen es resistente a la accin de
la penicilina (penicilinasas) y produce fosfolipasas (lecitinasa C), prueba base para su
identificacin presuntiva y una toxina letal para el ratn.
B. cereus se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, hecho importante en el

establecimiento de medidas para su control en los alimentos. Es un contaminante comn de los
productos lcteos.
Puede concretarse que la presencia de este microorganismo es un hecho comn en los

alimentos, especialmente en aquellos que han estado en contacto con el polvo o bien en otros
30
alimentos cocinados o procesados, en los cuales el tratamiento antibacteriano aplicado

(fumigacin con xido de etileno o de propileno, o el calor) no es bastante para destruir al
germen presente en los ingredientes utilizados.
Ocasionalmente B. cereus al desarrollar en leche cruda o pasteurizada, puede dar lugar a

alteraciones como protelisis cida, coagulacin dulce y solidificacin de la crema en partculas
flotantes.
Aparentemente B. cereus no compite favorablemente con otros grmenes saprfitos y ms

abundantes en los alimentos, lo que contribuye a explicar las bajas tasas de gastroenteritis que
suelen observarse en el hombre por esta causa.
La gastroenteritis por B. cereus en el hombre est caracterizada por un perodo de

incubacin de 2 a 6 h y sntomas moderados consistentes en diarrea, nusea y dolor abdominal,
no hay fiebre y la letalidad es del 0%.
Objetivo.
Cuantificar Bacillus cereus a partir de alimentos involucrados en brotes de intoxicacin
alimentaria.
Desarrollo.
Preparacin de material, muestras, seleccin y medicin de la alcuota y de las diluciones

Colocar 0.1 mL de cada dilucin seleccionada sobre el Agar MYP (Manitol - Yema de
huevo polimixina), ya preparado y contenido en cajas de Petri. Extender con ayuda de una
varilla de vidrio, hasta que el inoculo se seque.
Incubacin.
Incubar las placas ya inoculadas, a 30C por 24 h en condiciones de aerobiosis.
31
Sern consideradas colonias sospechosas de ser B. cereus, aquellas de color rosa, planas, con
aspecto de vidrio esmeril y que presenten un halo transparente.
Cuestionario.
1. Mencione las caractersticas morfolgicas de B. cereus en el medio MYP?
2. Tipo de hemolisis que produce B. cereus?
3. A qu tipo de flora inhibe la polimixina?
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Practica No. 10
Determinacin de bacterias coliformes totales en agua e investigacin de E.
coli en alimentos por la tcnica del nmero ms probable (N.M.P.)
Introduccin.
N.M.P. es el valor que resulta de la estimacin de un contenido microbiano, con base a la
probabilidad, cuando se aplica una tcnica en tubo de dilucin mltiple en el anlisis de un
producto. Esta tcnica se recomienda emplear cuando se estima que el grupo o microorganismos
sometidos a estudio se encuentran en baja concentracin se encuentran estresados.
En general la tcnica del Nmero ms Probable consta de tres pruebas:

a) Prueba presuntiva: la cual se realiza en un medio lquido (caldo) sin inhibidores o con la
presencia de estos a bajas concentraciones. Ejemplos: caldo lactosado, caldo lauril sulfato
de sodio, caldo Mc Conkey, etc.
b) Prueba confirmatoria: se realiza en medios lquidos o slidos selectivos, y en ocasiones se
recurre a la incubacin a temperatura elevada. Ejemplos: caldo lactosa bilis verde brillante,
caldo EC, agar TCBS, agar verde brillante, etc.
c) Prueba completa: donde generalmente se recurre a la realizacin de pruebas bioqumicas
que nos permitan identificar los diferentes microorganismos.
Las bacterias coliformes son un grupo heterogneo compuesto por varios subgrupos.
Existe poca evidencia que indique que estas bacterias pertenezcan a un solo gnero taxonmico.
La falta de certeza en cuanto a su filiacin taxonmica y la imprecisa correlacin entre los
mtodos recomendados para la deteccin de coliformes han presentado problemas. El primero, es
que aunque, Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes
33
que no producen gas de la lactosa o lo hacen despus de 48 h, por lo que no se les identifica por
medio de sta tcnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa est frecuentemente
asociada a genes localizados en plsmidos. Estos determinantes extracromosomales son
fcilmente transferidos entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que
pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del anlisis. No obstante en la
prctica, la tcnica ha demostrado su efectividad. El nmero de organismos se establece mediante
la cuenta de unidades formadoras de colonias (UFC) o el uso de la tcnica del nmero ms
probable. Esta ltima, tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona una estimacin
estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos
con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.
Objetivo.
Conocer una tcnica para estimar el nmero de coliformes, u otros grupos, presentes en
productos alimenticios, por medio del clculo del nmero ms probable (NMP) despus de la
incubacin a 35C en un medio lquido.
Desarrollo.
Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos
procesados trmicamente, as como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prcticas
sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad
esperada es como mnimo de una bacteria con 10 mL de producto lquido y una bacteria por
gramo de alimento slido.
Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aqu citada y si la naturaleza del alimento
lo permite, utilizar el mtodo de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea
mayor a 100/mL o g de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el mtodo en placa.
Esta tcnica establece el mtodo microbiolgico para estimar el nmero de coliformes

presentes en productos alimenticios, por medio del clculo del nmero ms probable (NMP)
despus de la incubacin a 35C en un medio lquido.
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I.
Determinacin de bacterias coliformes totales por la tcnica de N.M.P. en agua:
a) Prueba presuntiva: transferir 10 mL de la muestra a 5 tubos con 20 mL de caldo lactosado

(se inoculan un total de 5 tubos). Utilizar una pipeta estril para la inoculacin de todos los tubos.
Incubar los tubos a 35C/24-48 h y observar si hay formacin de gas.
b) Prueba confirmativa: de cada tubo con formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un
nmero igual de tubos con 3 mL de caldo lactosa bilis verde brillante. Incubar a 35C/24-48 h.
Interpretacin de resultados.
Tomar los tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas despus del periodo
de incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.
Informe de la prueba.
Nmero ms probable (NMP) de coliformes por 100 mL de muestra
II.
Investigacin de E. coli por la tcnica de N.M.P. para alimentos:

A partir de la muestra recolectada, separar 10 g de esta y colocarla en un frasco con 90
mL de diluyente. A partir de esta dilucin, preparar las diluciones 1:100 y 1:1,000.

a) Prueba presuntiva: transferir 1 mL de cada dilucin a 3 tubos con 10 mL de caldo lauril
sulfato de sodio (se inoculan un total de 9 tubos). Utilizar una pipeta estril para cada
dilucin. Incubacin. Incubar los tubos a 35C/24 h y observar si hay formacin de gas,
en caso contrario prolongar la incubacin hasta 48 h.
b) Prueba confirmativa: de cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y
sembrar en un nmero igual de tubos con 3 mL de caldo EC Incubar a 44.5C/24 h.
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas despus del
periodo de incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.
Nmero ms probable (NMP) de coliformes por g o mL de muestra.
Cuestionario.
1. Cundo es recomendable utilizar la tcnica del N.M.P.?
2. De cuantas pruebas consta la tcnica?
3. Qu tipo de medio son los caldos lactosado y el EC-MUG?
35

Practica No. 11
Investigacin de Salmonella spp
Introduccin:
Son bacilos Gram negativos aerobios o facultativamente anaerobios, mviles por flagelos
pertricos, no esporulados, catalasa positiva, oxidasa negativa, fermentan la glucosa, producen
gas, no fermentan la lactosa ni la sacarosa, no producen indol, no hidrolizan la urea,
descarboxilan la arginina, lisina y ornitina, temperatura mnima de crecimiento 6.6-7.7C, con
una temperatura ptima de 37C. Los miembros del gnero Salmonella han sido muy estudiados
como patgenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este
microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras
de alimentos, depende en cierta medida del mtodo analtico utilizado para su deteccin. Las
modificaciones a los mtodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el
debilitamiento o dao a las clulas bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que
est sujeto (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a
la naturaleza del producto bajo estudio.
Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella,

todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de pre enriquecimiento,
enriquecimiento, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificacin
bioqumica y confirmacin serolgica de los microorganismos.
La presente tcnica para la determinacin de Salmonella en alimentos, describe un

esquema general que consiste de 5 pasos bsicos:
36
1. Pre enriquecimiento. Es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no

selectivo que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas a una condicin fisiolgica
estable.
2. Enriquecimiento. Empleado con el propsito de incrementar las poblaciones de Salmonella e
inhibir otros organismos presentes en la muestra.
3. Aislamiento en medios slidos. En este paso se utilizan medios selectivos que restringen el
crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de
colonias sospechosas.
4. Identificacin bioqumica. Este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de
Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.
5. Confirmacin serolgica. Es una tcnica que permite la identificacin plena del gnero e
incluso el serotipo de Salmonella. Esta tcnica es de gran importancia en el estudio de brotes
de intoxicacin alimentaria.
Objetivo.
Investigar la presencia de Salmonella spp a partir de alimentos, mediante la utilizacin de
pasos de pre-enriquecimiento, enriquecimiento, aislamiento selectivo y diferencial, identificacin
bioqumica y confirmacin serolgica.
Desarrollo.
Preparacin de la muestra.
El siguiente mtodo se basa en el anlisis de 25 g. de la muestra en una proporcin de
1:10 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma
proporcin.
Pre enriquecimiento
Pesar aspticamente 25 g de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril
para trabajar en homogeneizador (Stomacher). Adicionar 225 mL del medio de pre
enriquecimiento estril (generalmente caldo lactosado) y homogenizar en Stomacher si es
necesario durante 1 min. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente
estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con
37
la tapa bien enroscada. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8+0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estriles.
Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24+2 h. a 35C.
Enriquecimiento.
Cerrar firmemente el tapn de rosca de los recipientes con los cultivos de pre
enriquecimiento y agitar suavemente, transferir 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml.
de caldo tetrationato adicionado de 0.2 mL de yodo y a otro con 10 mL de caldo RappaportVassiliadis. Incubar de 18-24 h. a 43 y 35C respectivamente.
Aislamiento de Salmonella.
Al trmino de la incubacin, mezclar los tubos de enriquecimiento, estriar en agar verde brillante
y agar sulfito de bismuto. Incubar las placas por 24-48 h a 35C, respectivamente.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella de acuerdo con
las siguientes caractersticas:
a) Agar verde brillante: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por un halo
rojo, las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias verdes o verde-amarillas.
b) Agar sulfito de bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras:
con o sin brillo metlico. Generalmente presentan un halo caf, tornndose posteriormente
negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro.
Identificacin bioqumica.
Seleccionar las colonias tpicas de cada medio selectivo que se encuentren bien aisladas.
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular tubos con: agar triple azcar hierro (TSI) y
agar hierro lisina (LIA) (por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo), y medio
MIO (por puncin). Incubar por a 35C/24 h.
Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para

Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:
a) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original
38
debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se

observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfhdrico.
b) Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo
en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella producen H2S en este medio con
ennegrecimiento a lo largo de la puncin.
c) Medio MIO: Se observa un color gris-prpura debido a la descarboxilacin de la ornitina.
Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo
del medio.
Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en
los medios TSI y LIA para las pruebas serolgicas.
Identificacin serolgica.
Ensayo de los antgenos somticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)
Colocar con un asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un portaobjetos.
Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en LIA. Agregar a una
de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mezclar con el canto del asa o
empleando aplicadores de madera.
Agitar inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente 1 min
Observar bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro. Considerar cualquier grado de
aglutinacin como positiva
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el

antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina.
Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar

con las pruebas bioqumicas complementarias.
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Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el

subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser
los ms frecuentes). Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y
efectuar la prueba. Si hay aglutinacin con Vi calentar el cultivo a ebullicin y repetir la
aglutinacin con el antisuero polivalente O.
Si no se cuenta con los sueros grupo especficos, solicitar la tipificacin de la cepa al

Laboratorio de Enterobacterias del Instituto Nacional de Diagnstico y Referencia
Epidemiolgicos de la Secretara de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pblica. Si se
requiere, practicar el ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella (antisuero polivalente H).
Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusin de cerebro corazn e incubar de 4
a 6 h a 35 hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo da), o bien, en caldo soya
tripticasana e incubar a 35C/24 h (para ensayo al da siguiente). Adicionar 2.5 mL de solucin
salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazn (BHI).
Colocar 0.5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serologa
(13x100 mm aproximadamente). Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control
de solucin salina mezclando 0.5 mL de solucin salina formalizada con 0.5 mL del antgeno
formalizado. Incubar las mezclas en bao de agua a 48-50C. Observar a intervalos de 15 min por
espacio de 1 h. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la mezcla de prueba
pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las
mezclas muestre aglutinacin. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba
inespecfica.
Cuestionario.
1. Qu enfermedades producen los miembros del gnero Salmonella?
2. Qu ventajas y desventajas tiene el ejecutar la etapa de pre-enriquecimiento?
3. Cul es el lmite permitido de Salmonella en alimentos?
4. A qu temperatura debe incubarse el caldo tetrationato?. Justifique su respuesta.
40

Practica No. 12
Cuantificacin de Clostridium perfringens
Introduccin.
C. perfringens es un microorganismo que normalmente se encuentra en el contenido intestinal del
hombre y de muchos animales, as como en el suelo y en el agua. Es probablemente la bacteria
anaerobia patgena al hombre ms extensamente estudiada. Durante los pasados 90 aos, esta
bacteria haba sido asociada ms cercanamente con la gangrena gaseosa.
C. perfringens es un bacilo anaerobio estricto, Gram positivo, con longitud variable de 3 a

8 por 0.4 a 1.2 de ancho, es inmvil y est rodeada por una cpsula; la espora que forma es
oval, terminal y ms ancha que el cuerpo bacteriano. Produce beta hemlisis, licua la gelatina y
en medios con yema de huevo, las colonias se observan con un halo de opalescencia. Reduce los
nitratos a nitritos, fermenta la glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa, no produce catalasa; su pH
y temperatura ptimos de crecimiento es de 7.2 y 30-47C, respectivamente. Fermenta la leche en
forma tormentosa.
Objetivo.
Realizar el recuento de una de las bacterias anaerobias ms frecuentemente involucrada en
intoxicaciones alimentarias.
Desarrollo.
1. Se recolectan muestras entre 25 y 30 g en frascos estriles y se transportan en enfriamiento
rpidamente para su procesamiento y anlisis. En un rea estril, auxilindose de cubiertos en
las mismas condiciones, se pesan 15 g de la muestra del alimento en el interior del vaso de una
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licuadora previamente tarado. Se adicionan 135 mL de agua peptonada al 1% y s licuan

durante 1 min (dilucin 1:10).
2. Se continan las diluciones decimales en tubos conteniendo 9 mL de agua peptonada al 1% a
partir de la dilucin 1:10, hasta la dilucin 1:100,000. Los tubos debern agitarse 25 veces en
un ngulo de 30 cm durante 7 seg.
3. Se inocula por la tcnica de extensin en superficie, 0.1 mL por dilucin en una caja de Petri
conteniendo 20 mL de Agar SFP (Shahidi-Ferguson-Perfringens) y en otra con Agar TNS
(Triptosa-Sulfito-Neomicina), se deja que se absorba la muestra en la superficie y se agrega
una sobrecapa de 10 mL de medio basal, estril y mantenido a 45C.
4. Incubar en anaerobiosis a 35C/18-24 h.
5. perfringens forma colonias tpicas negras de 2-4 mm de dimetro con un halo opalescente. Se
selecciona la placa que contenga entre 50 y 100 UFC sospechosas. Reportar este dato,
considerando la dilucin de la muestra, como el contenido presuntivo de C. perfringens/g de
alimento.
6. Confirmar el estudio de la siguiente forma:
Transferir por separado 10 colonias bien aisladas de la placa seleccionada a tubos con caldo
tioglicolato. Incubar a 35C/18 a 24 h en anaerobiosis.
Tomar una asada del caldo incubado y realizar un frotis que ser tenido por la tcnica de
Gram, con la finalidad de comprobar la pureza del cultivo. En caso de estar contaminado,
se hace una resiembra en placas de SFP o de TNS.
Si se cuenta con un cultivo puro, se inoculan tubos con: gelatina-lactosa, leche tornasolada
y movilidad-nitrato. El primer y el tercer tubo se inoculan por picadura y se sellan con una
sobrecapa de aceite mineral. El segundo tubo se inocula con 1 mL de caldo tioglicolato
adicionado con una pipeta Pasteur en el fondo del tubo. Se incuban a 35C/18-24 h en
anaerobiosis.
En el medio de gelatina-lactosa, C. perfringens produce compuestos cidos (amarillo) y

gas e hidroliza la gelatina an despus de 10-20 min de refrigeracin, fermenta la leche en forma
tumultuosa y en el medio de movilidad-nitrato, despus de la adicin de alfa-naftil amina (0.5
mL.) y cido sulfanlico (0.5 mL), produce una coloracin entre rosa y rojo en un periodo de 15
min como mximo y la bacteria es inmvil. A partir del porcentaje de colonias confirmadas y del
42
nmero de colonias presuntivas contadas en la dilucin de la placa seleccionada, calcular en

nmero de bacterias por gramo de alimento muestreado.
Cuestionario.
1. En qu condiciones de atmosfera, debe incubar las cajas para la investigacin de Cl.
perfringens?
2. La prueba debe ser cuantitativa o cualitativa. Explique su respuesta.
3. Qu tipo de toxina es la producida por este microorganismo?
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Practica No. 13
Investigacin de Vibro cholerae O1
Introduccin:
Pertenece a la familia Vibrionaceae, filogenticamente cercana a la familia
Enterobacteriaceae. Mide de 1.5 a 3 de longitud por 0.5 a 0.8 de dimetro, posee cpsula. Se
presenta solo, en parejas o cadenas cortas, que semejan espirilos. Durante el cultivo prolongado
los vibriones pueden convertirse en bacilos rectos, que se parecen a las bacterias intestinales
Gram negativas, estos microorganismos son oxidasa positivos, con excepcin de V.
metschnikovii. No son haloflicos pero necesitan trazas de iones sodio para su crecimiento.
Se encuentran en hbitat acuticos en una gran variedad de salinidad. Son muy comunes
en ambientes marinos, algunas especies se encuentran sobre la superficie y en el contenido
intestinal de animales marinos. Tambin se pueden encontrar en agua dulce donde sobreviven
unas horas y algunas semanas si esta se encuentra contaminada con materia orgnica y tiene un
pH entre 6 y 9. Es susceptible a la desecacin, la ebullicin, el cloro, otros desinfectantes y a las
tetraciclinas. V. cholerae sobrevive por periodos hasta de 7 das fuera del organismo,
especialmente en ambientes hmedos y templados.
V. cholerae s subclasifica con base en sus antgenos somticos (Ag O), en 139 serovares
que se denominan con nmeros, de tal manera que se hace referencia a V. cholerae 01, V.
cholerae 02, etc. Es comn referirse a todos los serovares diferentes de V. cholerae 01, como V.
cholerae NO 01. Existen 2 biotipos de V. cholerae 01: el biotipo Clsico y el biotipo El Tor, que
pueden ser considerados como dos variantes de un mismo microorganismo. Para fines de
diagnstico no se requiere especificar el biotipo y ambos pueden tomarse como similares. A su
vez ambos biotipos pueden subdividirse en los subtipos Inaba, Ogawa e Hikojima.
44
Objetivo.
Aislar e identificar a Vibrio cholerae, a partir de agua y productos de origen marino.
Desarrollo.
Agua
Es recomendable utilizar la tcnica del Hisopo de Moore o de la torunda, la cual se
expone a la corriente por un periodo de 18-24 h.
a) El hisopo es transportado al laboratorio en frascos que contengan 450 mL de agua peptonada
alcalina, de preferencia con pH 10.0. En ellos mismos se incuban por 18-24 h. a 35C.
b) Finalizada la incubacin, a partir de la superficie del agua peptonada alcalina, se tomara de
una a tres asadas y se inocular una placa con agar TCBS. Estas se incuban de 18-24 h a 35C.
V. cholerae, produce colonias amarillas, de 3 a 5 mm de dimetro, planas con bordes
regulares.
c) A partir del TCBS, seleccionar las colonias caractersticas e inocular tubos con agar TSI, LIA,
MIO y agua peptonada. Incubar a 35C por 18-24 h. V. cholerae, acidifica el TSI, es lisina y
ornitina descarboxilasa positiva, es mvil y produce indol.
d) De obtenerse una bioqumica tpica de V. cholerae, confirmar serolgicamente con antisuero
polivalente O y antisuero especfico
Alimentos.
a) Colocar 50 g de muestra en 450 mL de agua peptonada alcalina.
b) Homogeneizar en licuadora por 1 min e incubar a 35C por 18 - 24 h.
c) Continuar como se indica en el inciso b para el anlisis de V. cholerae en agua.
Cuestionario.
1. Qu tipo de alimentos pueden ser considerados como vehculo de transmisin de V.
cholerae?
2. Describa la morfologa colonial de V. cholerae en el agar TCBS??
3. Qu significa TCBS?
4. Cul es el mecanismo de patogenicidad de esta bacteria?
45

Practica No. 14
Determinacin de Vibrio parahaemolyticus por la tcnica de N.M.P.
Introduccin:
V. parahaemolyticus fue conocido primeramente en Japn como patgeno transmitido por
alimentos 15 aos antes de que lo fuera en Estados Unidos de Norteamrica. Se sabe que en
Japn provoca de 300 a 500 brotes anuales, ocupando cuando mucho la primera causa de
gastroenteritis de etiologa conocida.(5,7)
El descubrimiento de V. parahaemolyticus se origin a partir de un brote de intoxicacin

alimentaria ocurrido el 21 de Octubre de 1950 en Osaka, Japn; en el cual de 272 pacientes que
sufrieron gastroenteritis aguda, 20 murieron. El alimento sospechoso de esta intoxicacin fue una
sardina semiseca nombrada en japons shirasu. El 23 de Octubre los investigadores iniciaron
inmediatamente un estudio para determinar al agente causante de la enfermedad en el Instituto
para Enfermedades Microbianas, en la Universidad de Osaka.
Objetivo.
Estimar el contenido de Vibrio parahaemolyticus a partir de productos de origen marino,
mediante la tcnica de N.M.P.
Desarrollo.
a) Prueba presuntiva.
Transferir 1 mL de cada dilucin a 3 tubos con 10 mL de agua peptonada alcalina (se
inoculan un total de 9 tubos). Utilizar una pipeta estril para cada dilucin. Incubacin. Incubar
los tubos a 35C/24 h y observar si hay turbidez.
46
b) Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre turbidez, tomar una azada y sembrar en un nmero igual de
placas con Agar TCBS. Incubar a 355C/24 h.
c) Prueba completa.
De cada placa con Agar TCBS que contenga colonias azules, planas de 3 4 mm de
dimetro, inocular un juego de pruebas bioqumicas (TSI, LIA y MIO ajustadas al 3% de sal).
Tomar la serie de tubos de la prueba completa y buscar el NMP en los cuadros
correspondientes.
Nmero ms probable (NMP) de V. parahaemolyticus por g o mL de muestra.
Cuestionario.
1. Qu tipo de enfermedad produce V. parahaemolyticus?
2. Por qu es importante estimar el contenido de V. parahaemolyticus a partir de alimentos?
3. Qu tipo de medio es el Agar TCBS?
47

Practica No. 15
Determinacin de Listeria monocytogenes
Introduccin.
Es una bacilo Grampositivo, no esporulado, movilidad positiva a 25C, crecimiento aerobio a
microaerfilo, con metabolismo fermentativo, produccin de cido, pero no de gas a partir de la
glucosa, catalasa positiva, oxidasa negativa, no presenta cpsula. Se encuentran ampliamente
distribuidas (suelo, agua y vegetacin). Causan infecciones en peces, aves y mamferos (aborto
en vacunos y borregos). Por lo tanto es considerada una enfermedad ocupacional. Produce
listeriosis, cuyas manifestaciones clnicas son: meningitis, infeccin en rganos sexuales
femeninos, infecciones en recin nacidos o sepsis neonatal (desde conjuntivitis hasta neumonas y
por lo tanto la muerte). En adultos produce faringitis febril y dao a nivel de S.N.C. La bacteria
tiene tropismo positivo hacia S.N.C. y placenta. La listeriosis se presenta en pacientes
inmunocomprometidos.
Para la investigacin de Listeria se recomienda el procedimiento propuesto por el

Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), el cual incluye enriquecimiento
primario en caldo UVM (caldo de enriquecimiento universal de Vermont) durante 24 h a 30C
seguido de enriquecimiento en caldo Fraser; de los tubos positivos (ennegrecidos), se procede a
su aislamiento en agar MOX (Oxford modificado) y agar LPM (Litio-Feniletanol-Moxalactamo).
Las colonias sospechosas de Listeria se identifican mediante pruebas bioqumicas, morfolgicas
y serolgicas. Este mtodo debe realizarlo un microbilogo experimentado, en un ambiente
controlado, aislado de reas de produccin de alimentos. Se debe tener especial cuidado en la
disposicin de aquellos materiales y equipo que hayan estado en contacto con alimentos
sospechosos, antes de desecharlos o volver a utilizarlos. Esta tcnica por ningn motivo debe
48
aplicarla personal inmunocomprometido ya sea por enfermedad o por el uso de medicamentos,

mujeres embarazadas o personas de edad avanzada.
Objetivo.
Aislar e identificar a la actualmente considerada una bacteria ms frecuentemente involucradas
en brotes y casos de enfermedades asociadas al consumo de alimentos.
Desarrollo.
Procedimiento de enriquecimiento.
Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del
interior. Colocar 25 mL o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 mL de medio de
enriquecimiento (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30C. En el caso de muestras en donde
se sospecha que tienen clulas de Listeria spp daadas, se recomienda la incubacin en un caldo
de enriquecimiento que contenga piruvato de sodio al 0.1 % (p/v) incubado a 30C por 6 h sin
suplementos. Despus de las 6 h de incubacin los suplementos deben agregarse y continuar la
incubacin a 30C hasta un total de 48 h.
Aislamiento.
Despus de 24 y 48 h de incubacin en el medio EB, resembrar en los medios LMP y
OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30C por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35C por el
mismo periodo. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un
ngulo de 45 (iluminacin de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio
generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes. Ver la figura 1. En el
medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden
aparecer con un tono caf oscuro que se define mejor a los siete das de incubacin. Seleccionar
cinco o ms colonias tpicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este
paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP
pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista.
Debido a que puede estar presente ms de una especie de Listeria en la muestra, deben
identificarse como mnimo cinco colonias.
49
Identificacin.
Entre las pruebas bioqumicas utilizadas se encuentran las siguientes:
a) Prueba de movilidad en fresco. Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre
porta y cubreobjetos) utilizando solucin salina al 0.85%. La suspensin debe ser densa y
emulsificarse completamente, y observar con objetivo de inmersin en un microscopio de
contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las clulas de Listeria son bacilos cortos
con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rpidos no son
Listeria.
b) Prueba de catalasa. Las especies de Listeria son catalasa positiva.
Nota: Cualquier contaminacin de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas.
c) Tincin de Gram. Hacer una tincin de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de
Listeria son bacilos cortos Gram positivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse
como formas cocoides.
d) Prueba de hemlisis. Dibujar una cuadrcula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de
agar sangre de carnero al 5%. Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por
48 h a 35C. Al inocular, observar la reaccin hemoltica en las placas. L. monocytogenes y L.
seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadura.
e) Prueba de reduccin de nitratos. Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C
por 5 das. Para la lectura se debe agregar 0.2 mL del reactivo A y 0.2 mL del reactivo B, un
color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa,
adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo despus de una hora confirma una prueba
negativa (presencia de nitratos). En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2
mL del reactivo B y 0.2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva
(presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de
cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de
nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa - naftilamina, que es
carcinognica.
f) Prueba de movilidad en agar. Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 das a
temperatura ambiente (20-25C), observar diariamente. Las especies de Listeria son mviles,
dando un crecimiento tpico en forma de paraguas.
50
g) Prueba de utilizacin de carbohidratos. Inocular tubos de caldo prpura para fermentacin de

carbohidratos al 0,5 %: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 das
a 35C. Una coloracin amarilla indica una prueba positiva. Todas las especies de Listeria
dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa.
Cuestionario.
1. Defina que es listeriosis?
2. Cul es la poblacin ms frecuentemente atacada por esta bacteria?
3. Cules son los alimentos ms frecuentemente contaminados con Listeria spp?
51

Prctica No. 16
Anlisis microbiolgico de alimentos enlatados
Introduccin.
Los productos objeto de esta norma por su naturaleza se clasifican en:
1. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermtico con pH < 4,6.
a) Alimentos sometidos a tratamiento trmico envasados aspticamente.
b) Alimentos cidos y poco cidos-acidificados, fermentados, encurtidos, alimentos
elaborados a base de frutas (como jugos, nctares, mermeladas, jaleas, ates, etctera) y
frutas envasadas en recipientes de cierre hermtico y sometidas a tratamiento trmico.
2. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermtico con pH > 4,6.
a)
Vegetales, productos crnicos, platillos preparados con carne, productos lcteos y

mezclas, envasados en recipientes de cierre hermtico y sometido a tratamiento
trmico que asegure su esterilidad comercial.
b)
Alimentos sometidos a tratamiento trmico envasados aspticamente.
3. Otros productos con las mismas caractersticas y sujetos al mismo proceso.
Objetivo.
Conocer la metodologa para llevar a cabo el anlisis microbiolgico de productos enlatados.
Desarrollo.
Examen microbiolgico de latas no alteradas.
Este examen tiene por objeto determinar la presencia de microorganismos viables latentes,
que resistieron el tratamiento trmico debidamente aplicado y que en determinadas circunstancias
pudieran desarrollarse, produciendo alteraciones en el alimento y representando un riesgo para el
52
consumidor.
Los envasados, aun los bien procesados, pueden contener esporas de bacilos
termoflicos, las cuales son muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en las condiciones
normales de almacenamiento y no producen problemas de descomposicin del producto ni
representan un peligro para el consumidor. La prueba de esterilidad comercial, puede efectuarse
por la observacin y anlisis del contenido del producto, su apariencia, color, olor, pH y examen
microscpico. Estas observaciones se hacen despus de la incubacin de las latas y siempre
comparndolas con otras no incubadas. Si es necesario efectuar el cultivo o si el producto
despus de incubarse presenta cualquier cambio, ya sea en apariencia, olor, color, pH, o bien
presencia de gas o espuma, proceder como se indica en 5.1 o 5.2, dependiendo del pH del
alimento.
Examen microbiolgico de latas alteradas.

Este anlisis tiene por objeto determinar el origen de la alteracin, la cual puede ser
causada por microorganismos que sobreviven al tratamiento trmico o por la introduccin de
stos despus del tratamiento, por defectos de las cerraduras o por golpes que lesionen el envase.
Conociendo la naturaleza del alimento y su tratamiento, es posible predecir el tipo de organismo
responsable de la alteracin.
Numerosas investigaciones han demostrado que el tipo de alteraciones guarda relacin

con el grado de acidez del alimento procesado, por lo que stos se dividen en dos grandes grupos:
a)
Alimentos de baja acidez, con pH > 4,6, entre los que se encuentran productos crnicos,
lcteos, marinos, algunos vegetales, guisados, sopas, etctera.
b)
Alimentos cidos, con pH < 4,6, entre los que se encuentran tomates, frutas, jugos de
ctricos, encurtidos, entre otros.
Incubacin de productos en envases de apariencia normal.

La prueba ms confiable para determinar la esterilidad comercial es la incubacin del
producto a temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier
microorganismo que se encuentre pueda desarrollarse bajo las condiciones del producto
envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el envase o en el producto. Incubar de 30 a
35C por 10 a 14 das.
53
Observar diariamente los envases. La manifestacin de crecimiento es la hinchazn en

diferentes grados y en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la
formacin de burbujas. En cuanto se detecte hinchazn en el producto o cualquier otra desviacin
suspender la incubacin.
Al final del periodo de incubacin, abrir las latas para descubrir descomposicin cida
(flat sour), por cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimento. Preparar extensiones,
teirlas con azul de metileno o tincin de Gram y observarlas microscpicamente. El hallazgo de
cualquier anormalidad indica que el producto no est comercialmente estril y se debe proceder
como para los envases alterados.
Incubacin de envases sospechosos o alterados.

Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas
que no presenten alteracin evidente o con abombamiento de grado I de 30 a 35C/10-14 das.
Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse. Aquellas que se
clasifiquen como grado III o IV de no analizarse en el momento, debern refrigerarse.
rea de trabajo.
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un
ambiente ultra-limpio. La desinfeccin de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol o
sales cuaternarias de amonio a la concentracin recomendada por el fabricante. Posteriormente se
debe poner a trabajar el flujo, 30 min antes de efectuar el trabajo. Para controlar la eficacia del
flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los lados y al centro del
rea de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operacin. Si no se tiene el equipo necesario,
se puede utilizar un cuarto o cubculo perfectamente limpio, lavado con agua y jabn,
desinfectndolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajar entre dos
mecheros Bunsen.
Personal.
El personal debe trabajar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe usar turbante. El uso
de mascarillas quirrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema
infeccioso no debe intervenir en el anlisis.
54
Preparacin de latas o envases normales.

a)
Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabn; enjuagar y dejar secar.
b)
Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde est grabado el
lote. Escurrir el lquido y secar con la flama de un mechero.
c)
Destapar con un abridor de latas sanitario estril.
d)
En las latas de cierre de anillo o dispositivos abre fcil, abrir por la cara opuesta.
Frascos de vidrio.
a) Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solucin sanitizante, de
manera que quede cubierta la tapa; esta solucin puede ser cloro 100 mg/kg.
b) Colocar un algodn estril en torno a la tapa y con un punzn estril hacer un orificio en
el centro, a fin de que se pierda el vaco y pueda abrirse con facilidad.
c) Abrir el frasco sin contaminar los bordes del mismo.
Preparacin de latas o envases alterados

a) Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jabn; enjuagar y secar.
b) Si la lata est muy inflada, mantener en el refrigerador antes de abrirla.
c) Limpiar y sanitizar la tapa con una solucin de cloro 100 mg/kg o yodo al 2% en alcohol
al 70%; limpiar con una gasa estril.
d) En latas muy infladas de pH muy cido, es necesario hacer una prueba para hidrgeno,
con objeto de conocer si el gas se debe a la accin del cido sobre el metal. Para ello,
practicar una pequea puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo
invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. Una pequea explosin indica la
presencia de hidrgeno. No debe flamearse directamente el orificio de la lata.
e) Para abrir latas infladas, colocar un embudo invertido con un algodn estril sobre la tapa
y picar con un picahielo estril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata.
Procedimiento
a) Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete de flujo laminar vertical.
55
b) Tomar porciones tanto del contenido slido como del lquido; si es posible,
homogeneizar.
c) Utilizando utensilios adecuados a la naturaleza del producto (esptulas, pinzas, tubos de
vidrio, pipetas, etctera) transferir aproximadamente 2 g o 2 mL del producto a los tubos
con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento.
d) Conservar una muestra en un frasco estril, para cualquier aclaracin o para efectuar
pruebas biolgicas.
e) Hacer una extensin en un portaobjetos del contenido de la lata, ya que muchas veces los
grmenes causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y slo el examen
microscpico puede dar una idea de los microorganismos involucrados en la
descomposicin.
f) Preparar las extensiones mediante una asa de platino. Si el alimento es slido o muy
espeso, agregar una pequea cantidad de agua estril. Si es muy grasoso, depositar sobre
la extensin una pequea cantidad de xilol con posterioridad a su fijacin por calor.
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento: su olor, cambios en su color,
consistencia, etctera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata.
Observar su interior, anotando el estado del barniz, la presencia de manchas, defectos del frasco o
de la tapa, etctera. Tener cuidado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases
aparentemente normales.
Cuestionario:
1. Qu tipos de enfermedades pueden transmitirse por el consumo de alimentos enlatados
contaminados?
2. Cmo se clasifican este tipo de alimentos?
3. Qu tipo de precauciones debe tener al abrir la lata o envase?
56
BIBLIOGRAFA:
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para la cuenta de bacterias mesoflicas aerobias en alimentos. 12 diciembre 1994.
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agosto 1994.
4. Diario oficial de la Federacin. NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios.
Determinacin de bacterias coliformes. tcnica del nmero ms probable.
para la cuenta de microorganismos coliformes totales en alimentos. Diario oficial de la
federacin 15 septiembre 1994.
para determinacin de Salmonella spp. en alimentos. Diario oficial de la federacin 25
septiembre 1994.
para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Diario oficial de la
federacin 15 septiembre 1994.
8. Diario Oficial de la Federacin. NOM-130-SSA1-1995, Bienes y servicios. Alimentos
envasados en recipientes de cierre hermticos y sometidos a tratamiento trmico.
Disposiciones y especificaciones sanitarias.
9. Diario Oficial de la Federacin. NOM-143-SSA1-1995. Bienes y servicios. Mtodo
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Alimentos. Ed. Universidad Autnoma de Quertaro.
57
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applied nutrition. Disponible en: http://vm.cfsan.fda.gov/~mow/chap21.html
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17. Food & Drug Administration. 2001. Vibrio cholerae. In: Foodborne pathogenic
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Microbiology Laboratory Guidebook. 1998. 3rd edition. Washington, D.C. Disponible
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20. Vanderzant, C. and Splittstoesser, D.F. 2002. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. Edited by: Frances Pouch Downes and Keith
Ito. 4th Edition. American Public Health Association
58
59

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Fundamentos del Lab. de Inocuidad Microbiana de los

Preparacin de medios de cultivo

Recuento de bacterias mesoflicas aerobias por la tcnica

Recuento de bacterias coliformes totales por la tcnica de

Recuento de bacterias lcticas por vaciado en placa

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Los microorganismos indicadores, son aquellos que se agrupan en funcin de ciertas

El Laboratorio de Inocuidad Microbiana de los Alimentos, dentro de la Epidemiologa y

Control de la calidad sanitaria de materias primas e ingredientes.

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Diagnstico diferencial de la causa de un brote de gastroenteritis y otro tipo de

Rastreo de fuentes de contaminacin.

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Control de la pureza y actividad de los cultivos utilizados en la fabricacin de alimentos.

Deficientes manejos en la recoleccin y transporte de la muestra conducen a resultados ajenos a

El pH, el contenido de humedad, la temperatura del medio, el potencial oxidorreduccin, la

Las condiciones en que se efecto el muestreo y el transporte de la muestra.

La tcnica de anlisis utilizada.

La calidad de los reactivos y medios de cultivo.

La destreza del tcnico que ejecuta el anlisis.

El apego que observe el analista a la tcnica prescrita.

La presencia de sustancias que interfieren con el desarrollo microbiano, y

El estado fisiolgico de los microorganismos presentes.

As el resultado es slo una expresin convencional de la imagen microbiana de un producto,

microorganismos y su multiplicacin. La abundancia y distribucin de esos microorganismos en

Tendencia a correlacionar la abundancia de ciertos microorganismos en algunos alimentos

Determinar la calidad sanitaria de las materias primas: cuenta microscpica en leche,

Evaluar la eficiencia de un proceso de desinfeccin, purificacin o pasteurizacin:

Determinar el adecuado funcionamiento de cultivos microbianos en la obtencin de

La probabilidad de incriminar algunas bacterias como causa de toxiinfeccin alimentaria:

Grado de frescura que el alimento guarda: bacterias lcticas en salchichas.

Determinacin, en algunos casos, de la vida de anaquel de un alimento: bacterias

La evaluacin de los medios de cultivo y agentes bacteriostticos que se incluyen en su

Dada la gran versatilidad de los microorganismos en cuanto a sus demandas nutricionales y

y concentracin de nutrientes, acidez, potencial

TECNICAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS

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