Anda di halaman 1dari 32

TUGAS IMUNOKIMIA

REVIEW : FLOWCYTOMETRY DAN ELISA

Dosen Pengampu Mata Kuliah : Muhaimin Rifai

OLEH :
Mery budiarti supriadi - 106090212141006

Program pascasarjana
Jurusan kimia kekhususan biokimia
Fakultas matematika dan ilmu pengetahuan alam
Universitas brawijaya malang
-2011-

1. FLOWCYTOMETRY
1.1 PENDAHULUAN

Flowcytometry adalah suatu tehnik untuk menghitung dan menganalisa


suatu partikel mikroskropis, seperti sel dan kromosom, dengan menyiapkannya
dalam bentuk suspensi kemudian dialirkan dalam suatu aliran cairan dan
melewatkannya melalui suatu alat pendeteksi elektronik. Flowcytometry juga
dapat diartikan sebagai suatu metode pengukuran sel-sel didalam suatu sistem
aliran (flow), dimana mengantarkan sel-sel secara individu atau tunggal melewati
titik pengukuran. Apabila ditinjau secara teori, maka terdapat banyak tipe
pengukuran yang dapat dipergunakan, akan tetapi dalam prakteknya, istilah
tersebut menunjukkan suatu instrumen yang menggunakan sinar sebagai fokus
dalam titik pengukurannya.
Pada tehnik ini, dapat dipergunakan sinar yang disebarkan dan yang
mengalami fluoresensi memiliki perbedaan panjang gelombang, dimana kemudian
akan terekam. Biasanya, sinar yang disebarkan pada dua sudut yang berbeda dan
satu hingga enam atau lebih sinar berfluorensensi dapat terukur.
Flowcytometry ini merupakan metode analisa multiparameter yang dapat
dikerjakan secara bersamaan, yaitu baik dengan menganalisa sifat kimia dan/atau
fisika dari beribu partikel per detik. Flowcytometer ini dapat dipergunakan untuk
menganalisa banyak jenis sel, seperti sel-sel mamalia, tanaman, alga, ragi dan
bakteri, akan tetapi saat ini juga dapat dipergunakan untuk menganalisa partikel
lain, seperti inti sel (nukleus) dan kromosom atau small beads. Dimana
flowcytometry umumnya digunakan dalam diagnosis gangguan kesehatan,
khususnya kanker darah, tetapi juga dapat dipergunakan pada beberapa aplikasi
lainnya

yang melibatkan suatu penelitian dan praktek klinis. Dimana

penggunaaannya secara umum adalah untuk menyortir secara fisik partikelpartikel berdasarkan sifat-sifatnya, atau dengan kata lain dapat dipergunakan
sebagai suatu metode pemurnian.
Prinsip dari analisa dengan flowcytometry ini adalah adanya sumber sinar
(umumnya sinar laser) atau suatu sinar dengan panjang gelombang tunggal yang
dipancarkan menuju suatu pemfokusan hidrodinamik aliran cairan. Beberapa jenis

detektor digunakan pada suatu titik dimana aliran cairan tersebut kemudian akan
melewati pancaran sinar tersebut, salah satunya berada sejajar dengan pancaran
sinar (Forward Scatter atau FSC) dan beberapa berada berseberangan dengan
aliran cairan tersebut (Side Scatter atau SSC) serta satu atau lebih merupakan
detektor fluoresensi. Setiap partikel tersuspensi dengan ukuran 0,2 hingga 150 m
akan melewati pancaran sinar laser dan bahan kimia berfluoresensi yang terdapat
pada partikel atau berinteraksi dengan partikel tersebut dimungkinkan dapat
tereksitasi menghasilkan suatu emisi sinar pada panjang gelombang yang lebih
tinggi dibandingkan panjang gelombang sumber sinar tersebut.
Kombinasi sinar yang tersebar dan berfluoresensi akan ditangkap oleh
detektor, dan, dengan menganalisi fluktuasi yang terjadi pada intensitas cahaya
pada setiap detektor (satu untuk setiap puncak emisi fluoresensi), hal tersebut
memungkinkan untuk mengantarkan beberapa tipe informasi mengenai struktur
fisika dan kimia setiap individu partikelnya. FSC berkorelasi dengan volume sel
dan SSC tergantung pada kekompleksan bagian dalam partikel (seperti bentuk
nukleus, jumlah dan tipe sitoplasma granulosa atau kekasaran membran).
Beberapa flowcytometer dipasaran telah menghilangkan keperluan fluoresensi dan
menggunakan hanya sinar yang menyebar untuk pengukuran. Sedangkan
beberapa instrumen flowcytometer yang lain membentuk gambaran setiap
fluoresensi sel, penyebaran dan transmitansi sinar.
Kelemahan utama dari metode flowcytometry ini adalah bahwa metode ini
memerlukan suspensi dari sel-sel tunggal atau partikel lainnya, dengan sedikit
clumps dan debris. Dimana hal ini berarti bahwa susunan jaringan dan informasi
lainnya mengenai hubungan spasial antara sel-sel yang berbeda akan hilang saat
sel-sel tunggal ataupun inti sel tersebut dipersiapkan.
Beberapa organisme, seperti alga laut, adalah organisme yang dapat
memfluoresensikan sinar secara alami, akan tetapi secara umum fluoresensi ini
dapat berasal dari label yang berbeda. Beberapa jenis bahan kimia yang memiliki
sifat fluoresensi dimungkinkan dapat digunakan untuk melabel komponen sel,
seperti DNA (secara langsung), atau yang lainnya melalui interaksi dengan suatu
antibodi dengan beragam jenis protein seluler. Gambar 1.1 menunjukkan salah
satu contoh gambaran hasil analisa dengan menggunakan flowcytometry.

Gambar 1.1. Analisa flowcytometry pada sampel organisme laut (phytoplankton)

1.2 FLOWCYTOMETER

Flowcytometer modern dapat dipergunakan untuk menganalisa beberapa


ribu partikel dalam setiap detik, pada saat yang tepat real time, dan dapat secara
aktif memisahkan dan mengisolasi partikel yang memiliki sifat spesifik. Suatu
flowcytometer serupa dengan mikroskop, kecuali dalam penghasilan gambar
selnya,

flowcytometry

memberikan

hasil

akhir

yang

secara

otomatis

menggambarkan pula kuantitas sejumlah tersebut dalam suatu parameter. Untuk


menganalisa jaringan padat, suspensi sel tunggal terlebih dahulu harus
dipersiapkan.
Suatu instrumen flowcytometer memiliki lima komponen utama,
diantaranya :
1. suatu flow cell liquid stream (sheath fluid), yang membawa dan
meluruskan sel-sel sehingga dapat melewati keadaan tunggalnya hingga
melalui pancaran sinar untuk sensor
2. sistem pengukuran, biasanya yang digunakan adalah pengukuran
impedansi (atau konduktivitas) dan suatu sistem optik, seperti lampu
(mercury, xenon); high-power water-cooled lasers (argon, krypton, dye
laser); low-power air-cooled lasers (argon (488 nm), red-HeNe (633 nm),
green-HeNe, HeCd (UV)); diodelasers (biru, hijau, merah, ungu) yang
menghasilkan sinyal sinar.

3. suatu detektor dan sistem Analogue-to-Digital Conversion (ADC), yang


menghasilkan FSC dan SSC sebaik sinyal fluoresensi dari sinar menjadi
suatu sinyal elektrik yang kemudian dapat diproses secara komputasi.
4. sistem amplifikasi, baik linier ataupun logaritmik
5. komputer untuk analisa sinyal
Salah satu hal

yang mendasar mengenai flowcytometry adalah

kemampuan untuk menentukan sifat dari setipa individu partikel. Ketika sampel
berada dalam larutan diinjeksikan kedalam suatu flowcytometer, partikel-partikel
tersebut secara acak akan didistribusikan dalam suatu ruang tiga dimensi. Oleh
karena itu, sampel harus dikenalan dalam suatu aliran partikel-partikel tunggal
yang mampu dianalisa oleh sistem deteksi mesin. Proses ini diatur oleh suatu
sistem fluiditas atau cairan.
Berikut ini adalah diagram instrumen flowcytometer :

Gambar 1.2. Diagram flowcytometer


Umumnya, sistem fluiditas ini terdiri atas suatu central channel atau core
sebagai tempat sampel diinjeksikan, dimana letaknya tertutupi oleh suatu outer
sheats (pelapis terluar) yang mengandung aliran cairan yang deras. Sebagai
pelapis cairan yang bergerak, bagian ini menciptakan pengaruh gesekan yang
tinggi pada bagian central chamber yang menyempit. Hal inilah yang mengubah
kecepatan cairan central yang mengalir dengan kecepatan tersebar di pusat dan
kecepatan nol pada dinding (Gambar 1.3 dan 1.4).

Gambar 1.3. Pemfokusan hidrodinamik yang menghasilkan aliran sel-sel tunggal

Gambar 1.4. Pemfokusan dengan lensa silindris yang dipasang bersilangan


Flow chamber terletak di jantung instrumen. Biasanya disebut sebagai
flow cell tetapi lebih sesuai digunakan kata chamber, hal ini untuk menghindari
ketimpangan dengan sel-sel biologis. Flow chamber ini didesain untuk
mengantarkan sel-sel dalam bentuk tunggal pada titik pengukuran. Sampel
diinjeksikan kedalam pusat aliran cairan (air atau buffer), yang dikenal sebagai
selubung cairan (sheath fluid). Apabila aliran terganggu, sheath fluid dan aliran
sampel tidak akan bercampur dan yang terakhir akan menyempit, secara umum
diameternya berkisar 10 m, menghambat sel-sel untuk bergerak masuk melewati
pusat chamber. Pada titik ini, sinar kemudian akan difokuskan.
Gambar 1.5 ini menunjukkan flow chamber dan kelengkapannya, yaitu
sebagai berikut :

Gambar 1.5. Flow chamber dan kelengkapannya


Terdapat dua tipe flow chamber yang mendasar, yaitu chamber yang
tertutup penuh dimana dipergunakan hanya untuk menganalisa dan chamber
dimana aliran sampel terbuka, yang dipergunakan untuk analisa dan penyortiran
sel-sel. Bentuk chamber yang seringkali ditemukan adalah kuvet yang berbahan
dasar kuarsa. Desain tipe yang lain dipergunakan dalam microscope-based
cytometer (Gambar 1.6), dimana fluoresensi diukur pada jalur optik. Permukaan
atas biasanya ditutupi oleh slip atau yang serupa lainnya (equivalent).

Gambar 1.6. Microscope-based flow cytometer


Suatu chamber desain khusus yang berbentuk kuvet berbahan dasar kuarsa
(Gambar 1.7), desain ini sangat sesuai untuk penyortiran sel.

Gambar 1.7. Salah satu desain flow chamber

Salah satu instrumen analisa, yang mana tidak dapat menyortir sel, aliran biasanya
berada mengarah vertikal dengan tujuan untuk menghilangkan keberadaan
gelembung-gelembung udara. Seperti halnya sheath dan sample lines, terdapat
juga

vacuum

line

yang

berfungsi

untuk

membersihkan

dan

mampu

menghilangkan hambatan yang ada.


Sekumpulan

lensa

yang

berinteraksi

dengan

chamber

akan

memaksimalkan jumlah fluoresesensi dan sinar yang menyebar. Ketika sel-sel


disortir secara elektrostatis, sheath dan aliran sampelnya berada diudara terbuka.
Terdapat dua jenis chamber untuk sortir, salah satunya berdasarkan desain kuvet
dan yang lain didasarkan pada interograsi sinar laser pada sel-sel diluar chamber,
dimana sistem ini sering disebut dengan istilah stream-in-air atau jet-in-air
(Gambar 1.8).

Gambar 1.8. Flow chamber menggunakan sistem stream-in-air

Sheath fluid, umumnya digerakan melalui flow chamber oleh tekanan air
yang tersedia dengan suatu kompresor (Gambar 1.9). Tekanan yang sama
digunakan untuk melawan sampel kedalam sheath, dimana rata-rata aliran sampel
diregulasi oleh regulator tekanan. Parameter ini dapat digolongkan sebagai
variabel yang kontinu atau tetap, yaitu menjadi tiga pengaturan (tinggi, menengah
dan rendah).

Gambar 1.9. Sistem fluiditas flowcytometer

Sumber sinar yang digunakan dapat berupa laser, suatu lampu arc atau
bahkan LED. Akan tetapi, yang lebih banyak dipergunakan saat ini adalah laser.
Laser dipilih karena dapat menghasilkan intensitas yang tinggi dari pancaran sinar
monokromatis. Selain itu, karena laser juga memiliki ukuran spot yang kecil,
dimana hal ini menjadi penting karena sinar tersebut perlu untuk difokuskan
menjadi volume kecil untuk mendapatkan eksitasi yang maksimum pada sel
tunggal, serta untuk meminimalkan kemungkinan menjadi lebih dari satu sel oleh
karena pancaran laser. Sedangkan, lampu Arc memerlukan suatu filter optis untuk
memilih panjang gelombang yang diperlukan.
Kespesifikan deteksi diatur oleh filter optis (Gambar 1.10), dimana
mampu menghalangi panjang gelombang tertentu saat yang lain bertransmisi.
Terdapat beberapa tipe filter utama, diantaranya long pass filter yang
memungkinkan melalui sinar diatas panjang gelombang batas, short pass yang
mampu mentransmisikan sinar dibawah panjang gelombang batas dan band pass
yang dapat mentransmisikan sinar diantara range sempit yang spesifik pada
panjang gelombang. Seluruh filter ini menghambat sinar melalui proses absorpsi.

Gambar 1.10. Perbedaan beberapa tipe filter optis


Ketika filter diletakkan pada suhu 45 o terhadap sinar datang, maka disebut
sebagai dichroic filter/mirror, seperti namanya, tipe filter ini menunjukkan dua
fungsi, pertama, untuk melewatkan panjang gelombang yang spesifik dengan arah
yang sejajar, dan kedua, untuk membelokkan sinar pada sudut 90o, dimana hal ini
bertujuan untuk menggandakan sinyal secara berkelanjutan (Gambar 1.11).

Gambar 1.11. Skematik pengaturan flowcytometer tertentu

Laser memiliki keragaman jenis, diantaranya air-cooled dan solid state.


Tipe laser yang paling umum adalah laser air-cooled argon-ion yang
menghasilkan sinar biru pada panjang gelombang 488 nm. Panjang gelombang ini
mencukupi

untuk

proses

eksitasi

fluoresensi,

yang

merupakan

label

immunofluorescent yang pertama kali digunakan. Laser air-cooled umumnya


menggunakan He-Ne (633 nm) dan He-Cd (325 nm). Sedangkan laser solid state
menghasilkan sinar dengan panjang gelombang 355, 405, 488, 530, 594, 635 dan
780 nm. Hampir seluruh solid state dihasilkan diantara 10 dan 25 mW, dimana
paling minimum adalah menggunakan laser diode yang memberikan mW pada
488 nm.
Walaupun kekuatan output yang tinggi mampu meningkatkan sensitivitas,
tetapi kondisi tersebut juga memberikan efek samping yaitu peningkatan biaya,
perbaikan dan ukuran. Beberapa aplikasi memerlukan kekuatan laser yang tinggi,
seperti analisa dan sortir kromosom, dimana laser water-cooled yang
menghasilkan 200 mW sering digunakan pada prosesnya.

1.3 APLIKASI FLOWCYTOMETRY

PEMILAHAN

SEL

BERDASARKAN

EFEK

ELEKTROSTATIK

(ELECTROSTATIC CELL SORTING)


Aplikasi utama dari flowcytometry adalah untuk memisahkan atau
separasi sel-sel berdasarkan ekspresi subtipe atau epitop, dimana selanjutnya
dipergunakan untuk penelitian biologis. Proses ini dikenal juga dengan istilah cell
sorting (pemilahan sel) atau analisa FACS.
Terdapat dua metode pemilahan sel dengan menggunakan flowcytometer.
Metode yang paling umum adalah dengan memanfaatkan pembelokan (defleksi)
elektrostatik dari droplet yang bermuatan. Metode alternatif lain adalah
menggunakan alat piezo-electric untuk memilah sel-sel secara mekanik.
Proses sorting sel dengan elektrostatik dapat terjadi sebagai berikut suatu
cairan pelapis (sheath fluid) yang bersifat konduktif digunakan dalam proses
tersebut, biasanya yang digunakan adalah buffered saline. Flow chamber
digetarkan secara vertikal oleh tranduser piezoelektrik umumnya pada frekuensi

antara 20 dan 60 kHz. Getaran ini menyebabkan cairan tersebut muncul dari
gangguan yang keluar (umumnya berdiameter 75 m) untuk kemudian dapat pecah
menjadi droplet. Flow chamber, dan aliran arus, yang bermuatan (+ v dimana v
umumnya terletak antara 50 dan 150 V) pada saat sel yang diinginkan terdapat
didalam droplet sedang terbentuk. Arus droplet lewat melalui sepasang plate
bermuatan (+ 500 V) sehingga droplet yang bermuatan tersebut akan terdefleksi
dan berkumpul bersama dengan sel yang terkandung didalamnya. Oleh karena itu,
sel-sel dalam dua pre definisi gerbang dapat dipisahkan dengan menggunakan
muatan positif dan negatif.
Berlangsungnya proses analisa ini adalah setelah sampel difokuskan secara
hidrodinamik, setiap partikelnya kemudian dilapisi dengan pancaran sinar. Sinyal
yang tersebar dan fluoresensi dibandingkan dengan pengaturan kriteria pemilihan
dalam instrumen. Apabila partikel-partikel tersebut sesuai dengan kriteria, aliran
cairan dianggap sebagai gangguan yang masuk kedalam sistem fluidik. Muatan
elektrostatik biasanya terjadi pada saat yang tepat atau disebut sebagai break-off
point,dimana hal ini menjelaskan bagaimana droplet yang mengandung partikel
yang diinginkan terpisah dari aliran dan dapat terjatuh secara otomatis.
Hal-hal yang mempengaruhi posisi break off point (perubahan suhu,
sebuah kotoran, draft dalam sel orifice flow) dapat mempengaruhi stabilitas
penyortir. Untuk mencegah terjadinya break-off point pada sembarang jarak dari
gangguan dan untuk menjaga konsistensi ukuran droplet, gangguan divibrasikan
pada frekuensi yang tinggi. Droplet umumnya melewati medan dengan
elektrostatik yang kuat dan membelokkan ke arah kiri atau kanan tergantung
muatannya (Gambar 1.12).

Gambar 1.12. Elektrostatic sorting flow


Kecepatan sorting aliran tergantung pada beberapa faktor, termasuk
ukuran partikel dan laju pembentukan droplet. Suatu jenis gangguan yaitu
berdiameter antara 50 70 M, bergantung pula pada kecepatan jet, sehingga dapat
menghasilkan 30.000 100.000 droplet per detik, yang merupakan kondisi yang
akurat untuk proses sorting atau pemilahan. Semakin tinggi kecepatan jet maka
memberikan resiko gangguan menjadi semakin terhambat sehingga mampu
menurunkan kemurnian preparasi.

1. ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)


1.1 PENDAHULUAN

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan salah satu


metode immunoassay yang menggunakan antibodi untuk menangkap suatu
antigen dan suatu antibodi berlabel enzim untuk menentukan jumlah antigennya.
Istilah immunoassay merupakan kombinasi antara istilah immuno yang berarti
suatu aplikasi imunokimia yang melibatkan interaksi antara antigen-antibodi dan
assay atau pengukuran yang menunjukkan suatu teknik untuk penentuan
kemurnian suatu substansi atau jumlah suatu konstituen campuran. Sehingga,
immunoassay dapat diartikan sebagai suatu metode untuk mengukur sutau
substansi dalam suatu campuran menggunakan aplikasi reaksi ikatan spesifik
antibodi.
Berikut ini merupakan perkembangan radioimmunoassay sebagai salah
satu tehnik dalam immunoassay dengan label radioisotop :

Gambar 2.1. Perkembangan Radioimmunoassay

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), dikenal juga sebagai


metode Enzyme Immunoassay (EIA), merupakan suatu tehnik biokimia yang
digunakan pada bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan suau antibodi
atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah dipergunakan sebagai alat diagonis
dalam dunia medis dan patologi tumbuhan, serta dapat juga dipergunakan sebagai
pendeteksi quality control pada berbagai macam industri. Secara sederhana, dalam
ELISA, sejumlah antigen yang tidak diketahui ditempatkan atau dilekatkan pada
suatu permukaan, dan kemudian diperlakukan dengan suatu antibodi yang spesifik
diatas permukaan tersebut sehingga terjadi interaksi pengikatan dengan antigen.
Antibodi tersebut dilekatkan dengan suatu enzim, dan pada tahapan terkahir
substansi ditambahkan sehingga enzim dapat berkonversi menjadi beberapa sinyal
yang dapat terdeteksi, umumnya sinyal tersebut berupa perubahan warna dengan
adanya suatu substrat kimia.

2.2 HAL-HAL YANG PENTING DALAM IMMUNOASSAY


Berikut ini merupakan hal-hal penting yang perlu dipahami dalam
immunoassay, antara lain :
ANTIBODI (ANTISERUM)
Pada immunoassay, antibodi digunakan sebagai reagen pengikat dengan
spesifitas dan kemampuan pengikatan yang tinggi, sehingga afinitasnya terhadap
substansi yang tinggi ini dapat terukur. Antibodi berinteraksi dengan substansi
lain diperoleh dengan cara melakukan imunisasi pada suatu hewan dengan suatu
subtansi tertentu. Beberapa substansi dapat dengan mudah secara langsung
memproduksi antibodi dan beberapa substansi lainnya memerlukan dukungan
suatu adjuvant, seperti complete Freunds adjuvant, agar dapat meningkatkan
respon imun serta mempercepat proses produksi antibodi tersebut.
Antibodi dikenal juga sebagai immunoglobulins yang berasal dari sifat
kimianya, dan molekul dasarnya terbentuk dari dua heavy (H) dan dua light (L)
chain, memiliki berat molekul antara 50000 70000 dan/atau 23000.
Immunoglobulin diklasifikasikan berdasarkan struktur dari H chain, yaitu IgG,
IgM, IgA, IgD dan IgE. Dan L chain diklasifikasikan ke dalam dua tipe, yaitu
lamda dan kappa. IgG, IgD dan IgE merupakan struktur dasar dan memiliki berat

molekul antara 150, 170-200 dan 190 kDa. IgA merupakan tipe dimer dengan
berat molekul 390 kDa, sedangkan IgM adalah suatu pentamer dengan berat
molekul 900 kDa.
Antibodi memiliki suatu lokasi tertentu pada akhir H dan L chain yang
kemudian dikenal sebagai wilayah variable (VH, VL), karena variasi dari sekuen
asam amino diantara kelas yang sama, sedangkan akhir dari chain disebut dengan
wilayah konstant (CH, CL). Wilayah variabel merupakan tempat untuk
pengenalan dan pengikatan dengan epitop yang spesifik dari antigen.

ANTIGEN DAN HAPTEN


Antigen umumnya merupakan suatu makromolekul dengan ukuran di atas
1000 Dalton. Substansi dengan ukuran molekul yang lebih kecil tidak dapat
memproduksi antibodinya sendiri, akan tetapi tetap dapat berikatan dengan
antibodi, dan substansi ini biasa dikenal dengan hapten. Untuk memperoleh suatu
antibodi untuk hapten, maka hapten perlu digabungkan dengan suatu carrier
protein yang berukuran besar. Kemudian antibodi dapat diproduksi melalui proses
imunisasi suatu hewan dengan suatu immunogen. Antibodi akan muncul setelah
inokulasi pertama dan dikenal sebagai tipe IgM, yang merupakan suatu pentamer
dan komponen dasat antibodi. Antibodi tipe ini, kemudian akan berubah menjadi
tipe IgG setelah dilakukan inokulasi berulang, dimana antibodi tipe IgG ini
merupakan antibodi yang sering digunakan dalam immunoassay.

LARUTAN STANDAR
Preparasi larutan standar adalah hal yang diperlukan untuk immunoassay.
Larutan standar digunakan untuk merancang suatu kurva standar dari suatu reaksi
bertingkat

yang menghasilkan variasi konsentrasi standar, dan dengan

membandingkan reaksi yang dihasilkan oleh sampel dengan kurva standar, maka
akan diperoleh harga sampel. Hasil akhir pengukuran menunjukkan jumlah
absolut substansi target, seperti berat dan konsentrasi, atau jumlah substansi
pendukung, seperti potensi (unit biologis, aktivitas enzim dan beberapa variabel
dengan satuan internasional).

MATERI TERLABEL
Dalam immunoassay, sangat diperlukan untuk menggunakan penanda atau
marker agar dapat diketahui proses pengikatan antigen-antibodi. Untuk tujuan
tersebut, maka perlu dilakukan pelabelan baik pada antigen ataupun antibodi
dengan suatu bahan atau materi yang tidak mengganggu proses pengikatan.
Umumnya digunakan radioisotop, enzim, substansi berfluoresens seperti FITC,
unsur pengkhelat yang berasal dari unsur lantanida, dan yang lainnya. Dan faktor
ini merupakan faktor yang paling penting dalam immunoassay.

2.3 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)


Metode pengukuran ini menggunakan enzim sebagai materi pelabel dan
antibodi yang telah mengeras atau melekat sebagai agen yang akan menangkap
antigen sebagai targetnya. Pada ELISA dikenal adanya mikroplate dengan 96
sumuran (well plate) dan umumnya well terlebih dahulu akan dilapisi atau
dicoating dengan antibodi. Antibodi ini disebut sebagai antinodi penangkap atau
captured antibodies, yang berperan utama sebagai penangkap molekul antigen
yang terdapat dalam sampel. Pelapisan atau coating dilakukan dengan proses
adsorpsi pada permukaan dari bagian dasar sumuran well plate (Gambar 2.2).

Gambar 2.2 Microplate ELISA

Well plate tersebut terbuat dari polistirene yang dimodifikasi sehingga memiliki
efisiensi adsorpsi yang tinggi. Karena konsentrasi antibodi terkait dengan efisiensi
penangkapan antigen untuk mendapatkan sensitifitas yang sempurna, preparasi
antibodi yang digunakan adalah fraksi IgG, atau fraksi antibodi monospesifik

yang diperoleh dengan suatu proses kromatografi afinitas. Fraksi tersebut lebih
baik digunakan dibanding dengan fraksi crude gamma globulin (IgG) yang
dipreparasi dengan fraksinasi amonium sulfate.

PROSEDUR DASAR ELISA


Berikut ini merupakan prosedur mendasar ELISA, yaitu sebagai berikut
(Gambar 2.3):
1. Larutan standar atau sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang telah
terlapisi atau tercoating dengan antibodi, kemudian diinkubasi selama
beberapa jam sehingga molekul antigen dapat tertangkap dengan sempurna
oleh antibodi penangkap atau capture antibody.
2. Setelah reaksi pengikatan, campuran reaksi tersebut dibuang kemudian
sumuran dicuci untuk menghilangkan materi atau bahan berlebih.
3. Antibodi sekunder yang mengenali epitop lain dari antigen ditambahkan.
Antibodi sekunder tersebut telah terlabel dengan suatu enzim seperti
horseradish peroxidase (HRP).
4. Antibodi sekunder berlabel enzim akan terikat pada antigen yang telah
terikat pada antibodi yang berada didasar sumuran. Hal ini berarti bahwa
enzim (HRP) juga akan melekat pada bagian dasar sumuran. Jumlah
antigen yang terperangkap sebanding dengan enzim yang melekat.
5. Aktivitas enzim diukur dengan menambahkan substrat kromogen dari
enzim tersebut. Dalam hal ini, untuk HRP umumnya digunakan
tetramethylbenzidine (TMB). Setelah inkubasi untuk beberapa saat,
substrat kromogen akan mengalami perubahan warna. Reaksi tersebut
kemudian dihentikan dengan penambahan suatu reaktan penghenti reaksi
atau stopper, biasanya adalah suatu larutan asam sulfat, dan absorbasni
diukur dengan menggunakan suatu plate reader.
6. Kurva standar disiapkan dari beberapa variasi konsentrasi larutan standar
yang diukur absorbansinya. Dan nilai pengukuran sampel ditentukan dari
nilai absorbansinya yang telah dibandingkan dengan kurva standar (kurva
kalibrasi).

Gambar 2.3. Tahapan prosedur dasar ELISA

PROSEDUR ELISA DENGAN BIOTIN AVIDIN BINDING


Enzim merupakan makromolekul, sehingga terkadang pelabelan dengan
menggunakan enzim dapat mengganggu reaksi pengikatan antara antigen dan
antibodi. Untuk menghindari gangguan tersebut, maka umumnya antibodi
sekunder dilabeli dengan suatu substansi yang memiliki ukuran molekul lebih
kecil, yaitu biotin (MW=244,31), dan suatu protein spesifik untuk berikatan
dengan biotion, avidin yang berkonjugasi dengan enzim, seperti HRP (Gambar
2.4).

Gambar 2.4. Prosedur ELISA dengan biotin avidin binding


Biotin (Gambar 2.5) adalah semacam growth factor atau faktor
pertumbuhan yang ada pada setiap sel dan termasuk ke dalam golongan vitamin B
kompleks, dan umumnya dikenal juga sebagai vitamin H.

Gambar 2.5. Struktur biotin


Biotin ini berperan sebagai ko-faktor dari beragam jenis enzim yang terkait
dengan reaksi karboksilasi, biasanya dikenal juga dengan koenzim R. Biotin
terdapat melimpah di hati, ginjal, penkreas, ragi dan susu. Substansi ini juga

penting dalam metabolisme asam lemak dan karbohidrat, dan kekurangannya


dapat menyebabkan luka pada kulit.
Sedangkan avidin merupakan suatu glikoprotein dasar yang berada dalam
putih telur mentah, diproduksi di saluran telur unggas dan amfibi. Avidin ini
termasuk substansi tetramer yang tersusun atas subunit rantai tunggal yang terdiri
atas 128 asam amino (N-terminal berupa alanin dan C-terminal berupa asam
glutamat). Berat molekulnya adalah berkisar 66000 Dalton dan diperoleh melalui
proses pemecahan dengan perlakuan panas dan iradiasi. Avidin terikat secara kuat
dengan biotin dan dapat menonaktifkannya. Setiap subunit dapat terikat dengan
satu biotin. Konstanta disosiasinya (Kd) adalah 10-15 M.

2.4 SISTEM METODE ELISA


Terdapat beberapa sistem metode ELISA yang terkait dengan prinsip
pelaksanaannya, dimana sistem tersebut terbagi atas :
DIRECT ELISA
Metode ELISA ini merupakan bentuk metode ELISA yang paling
sederhana (Gambar 2.6), dimana pada metode ini antigen berinteraksi dengan
pasif terhadap fase tetap atau plastic solid phase (microtiter plate well) melalui
suatu periode inkubasi. Setelah proses pencucian, antigen dideteksi dengan
penambahan antibodi yang berikatan secara kovalen dengan enzim. Setelah
inkubasi dan pencucian, tes atau analisa ini dikembangkan dengan penambahan
kromogen atau substrat yang dimana mampu menghasilkan suatu aktivitas enzim
dalam wujud terjadinya perubahan warna. Jumlah enzim tertinggi dalam sistem
ditentukan dengan kecepatan warna tersebut terbentuk. Umumnya warna yang
terbentuk tersebut dibaca setelah waktu yang telah ditentukan atau setelah
aktivitas enzimatis tersebut dihentikan dengan suatu bahan kimia pada suatu
waktu yang tertentu. Kemudian warna tersebut dibaca secara spektrofotometer.

Gambar 2.6. Tahapan direct ELISA

INDIRECT ELISA
Antigen berinteraksi secara pasif dengan sumuran melalui suatu proses
inkubasi. Setelah pencucian, antibodi yang spesifik untuk suatu antigen diinkubasi
dengan antigen. Sumuran dicuci dan semua antibodi yang terikat dideteksi dengan
penambahan antispesies antibodi yang secara kovalen berinteraksi dengan suatu
enzim. Seperti antibodi yang spesifik untuk suatu spesies yang sama seperti
tempat antibodi yang pertama kali ditambahkan diproduksi. Setelah inkubasi dan
pencucian, analisa dikembangkan dan dibaca serupa dengan metode pada direct
ELISA, yaitu dengan penambahan kromogen atau substrat yang menghasilkan
suatu aktivitas enzim. Dimana aktivitas enzim ini diwujudkan dalam perubahan
warna yang akhirnya dapat terukur secara spektrofotometer.
Gambar 2.7 ini menunjukkan tahapan-tahapan dari metode indirect ELISA
yaitu sebagai berikut :

Gambar 2.7. Tahapan indirect ELISA

Metode indirect ELISA ini merupakan salah satu metode analisa yang banyak
diaplikasikan sebagai metode analisa diagnosis.

SANDWICH ELISA
Terdapat dua bentuk ELISA berdasarkan jumlah antibodi yang
dipergunakan. Prinsip yang dipergunakan sama seperti kedua metode ELISA yang
dipergunakan sebelumnya, yaitu penambahan antigen secara langsung pada fase
padatan, antibodi ditambahkan pula pada fase padatan, kemudian antibodi tersebut
berperan sebagai penangkap antigen. Sistem ini berguna apabila antigen berada
dalam bentuk crude atau pada konsentrasi yang rendah. Pada kasus ini, antigen
tidak dapat secara langsung ditambahkan pada fase padatan karena tidak terdapat
konsentrasi yang cukup tinggi untuk dapat diperoleh keberhasilan pengukuran
berdasarkan prinsip direct ataupun indirect ELISA. Sandwich ELISA tergantung
pada antigen yang stidaknya memiliki dua sisi antigenik sehingga setidaknya dua
antibodi dapat terikat.
Metode sandwich ELISA ini terbagi menjadi dua metode pelaksanaan,
yaitu direct sandwich ELISA dan indirect sandwich ELISA.
DIRECT SANDWICH ELISA
Antibodi merupakan protein yang terdapat secara alami dan dapat secara
pasif berinteraksi dengan fase padatan. Setelah pencucian untuk menghilangkan
antibodi berlebih yang tidak berikatan, antigen ditambahkan dan akan tertangkap
secara spesifik. Antigen kemudian akan dideteksi dengan suatu antibodi sekunder
yang berlabel enzim secara langsung terhadap antigen. Antibodi ini dapat secara
identik menangkap antibodi yang bereaksi dengan sisi antigenik yang berulang
atau suatu antibodi yang berasal dari spesies yang berbeda dihadapkan secara
langsung pada sisi yang sama ataupun berbeda. Tipe pengukuran ini berguna
apabila terdapat suatu spesies antiserum tunggal dan jika antigen tidak
berinteraksi dengan plate.
Gambar 2.8 menunjukkan tahapan pelaksanaan direct sandwich ELISA,
dimana pelaksanaannya adalah sebagai berikut :

Gambar 2.8 Tahapan direct sandwich ELISA

INDIRECT SANDWICH ELISA


Metode ELISA ini memiliki prinsip yang sama dengan metode direct
sandwich ELISA, akan tetapi melibatkan tiga antibodi. Tahapannya meliputi
pelapisan atau coating pada fase padatan dengan antibodi dan penangkapan
antigen, kemudian antigen tersebut dideteksi dengan suatu antibodi sekunder yang
tidak berlabel. Antibodi ini kemudian dideteksi menggunakan suatu antispesies
enzim yang terlabel konjugat. Hal ini pentinga bahwa antispesies konjugat tidak
terikat pada antibodi penangkap, oleh karena itu spesies yang digunakan sebagai

temapat produksi antibodi penangkap harus berbeda. Satu hal yang harus dimiliki
adalah keberadaan antigen dengan dua sisi antigenik. Dimana keuntungan dari
sistem ini adalah bahwa konjugat antispesies tunggal dapat digunakan untuk
mengevaluasi pengikatan antibodi pada beberapa jenis sampel.
Gambar 2.9 menunjukkan tahapan pelaksanaan direct sandwich ELISA,
dimana pelaksanaannya adalah sebagai berikut :

Gambar 2.9 Tahapan indirect sandwich ELISA

COMPETITIVE/INHIBITION ELISA
Keseluruhan metode ELISA yang ada dapat digunakan sebagai adaptasi
untuk pengukuran antigen atau antibodi menggunakan metode kompetitif atau
inhibisi. Sehingga, setiap pengukuran diatas menjelaskan perlunya pretitrasi
reagen untuk memperoleh suatu kondisi yang optimum. Kondisi optimum ini
kemudian dapat dilanjutkan dengan penambahan antigen atau antibodi.
Metode sandwich ELISA

ini terbagi menjadi beberapa metode

pelaksanaan, yaitu :
COMPETITIVE ELISA DIRECT ANTIGEN
Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA
direct antigen :

Gambar 2.10. Prinsip competitive ELISA direct antigen

Reaksi antigen yang terkandung didalam sampel dengan antibodi berlabel enzim
secara langsung terhadap antigen pada fase padat menghambat label dari
pengikatan pada antigen fase padat. Apabila ntigen tidak memiliki crossreactivity
atau tidak terdapat sama sekali, kemudian antibodi berlabel akan berikatan dengan
antigen fase padat dan reaksi warna merupakan hasil akhir yang akan dianalisa.

COMPETITIVE ELISA DIRECT ANTIBODY


Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA
direct antibodi :

Gambar 2.11. Prinsip competitive ELISA direct antibodi

Tingkat penghambatan oleh antibodi yang terikat pada serum untuk pretitrasi
reaksi antiserum berlabel enzim merupakan parameter yang dipergunakan.

COMPETITIVE ELISA INDIRECT ANTIGEN


Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA
indirect antigen :

Gambar 2.12. Prinsip competitive ELISA indirect antigen

Pretitrasi indirect ELISA dibandingkan dengan/atau tanpa antigen. Apabila


antigen membagikan sisi antigenik dengan antigen yang terikat pada fase padatan,
kemudian berikatan dengan antibodi pretitrasi dan mencegah terjadinya ikatan
dengan antigen pada fase padat. Jika tidak terdapat kemiripan, kemudian antibodi
tidak terikat dan bereaksi dengan antigen pada fase padat. Penambahan konjugat
enzim antispesies sebanding dengan jumlah ikatan antibodi yang ada.

COMPETITIVE ELISA INDIRECT ANTIBODY


Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA
indirect antibodi :

Gambar 2.13. Prinsip competitive ELISA indirect antibodi

Metode ini berprinsip pada keterlibatan antigen pretitrasi dan antiserum dalam
suatu indirect ELISA. Penambahan serum yang memiliki crossreactivity dengan
antibodi akan mengacaukan keseimbangan dalam sistem pretitrasi. Karena
konjugat antispesies yang digunakan, spesies yang merupakan tempat sampel
serum diperoleh tidak dapat disamakan seperti pada sistem pretitrasi.

2.5 KELEBIHAN ELISA


Terdapat empat alasan utama tentang penggunaan ELISA, dimana seperti
yang ditunjukkan pada diagram (Gambar 2.13) berikut ini :

Gambar 2.13. Kelebihan utama ELISA

Pada Gambar 2.13 tersebut ditunjukkan bahwa ELISA memiliki empat kelebihan
utama, diantaranya :
1. Versatile atau serbaguna
2. Simple atau sederhana
3. Sensitive
4. Quantifiable atau dapat digunakan sebagai metode untuk mengukur suatu
kuantitas

DAFTAR PUSTAKA
Cowter, John. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Jose, San. 2000.Introduction to Flow Cytometry : A Learning Guide. Becton,


Dickinson and Company. United Stated of America.

Lequin,

Rudolf M. 2005. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked


Immunosorbent Assay (ELISA). Clinical Chemistry 51:12 pp. 2415
2418.

Ormerod, Michael G. 2008. Flow Cytometry : A Basic Introduction. De Novo


Software.

Rahman, Misha. 2006. Introduction to Flowcytometry. AbD Serotec.

Wakabayashi, K., Emer. ELISA A to Z ... from Introduction to Practice.