Anda di halaman 1dari 19

TEKNIK PEMURNIAN ENZIM

(Tugas Teknologi Enzim Industri)

MUTI DIANDA SARI


P051114021

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI


SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2013

TEKNOLOGI ENZIM
PEMURNIAN ENZIM

Enzim merupakan salah satu jenis substrat biologis yang memiliki fungsi yang sangat penting
dalam kehidupan manusia. Selain dimanfaatkan sebagai biokatalisataor, enzim banyak berperan
dalam industri komersial dalam bidang pangan maupun medis dan farmakologi. Untuk mendapatkan
suatu produk yang maksimal, maka dalam setiap kali reaksi biologis digunakan enzim untuk
mempermudah proses maupun menghemat biaya produksi suatu proses. Enzim yang digunakanpun
sebaiknya merupakan enzim yang memiliki kemurnian yang tinggi.
Memperoleh enzim dengan kemurnian yang tinggi, tidaklah mudah butuh biaya serta proses
yang lama untuk memperoleh enzim dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Ada banyak faktor yang
berpengaruh dalam memperoleh enzim dengan kemurnian yang tinggi. Pemurnian merupakan tahap
yang penting setelab enzim diisolasi. Pemurnian enzim dapat dilakukan dengan beberapa cara
antara lain dialisis, elektroforesis dan kromatografi. Teknik dialisis bekerja dengan cara pengendapan
dalam garam organik (salting out) atau pelarut organik (aseton), dan melalui membran ultrafiltrasi.
Teknik elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sedangkan teknik kromatografi
merupakan teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak
dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
Berikut akan dibahas satu persatu tentang teknik-teknik pemurnian enzim:
1.

DIALISIS
Dialisis adalah suatu teknik pemisahan dengan cara menggunakan membran yang
memisahkan dua fasa cairan. Membran tersebut bersifat semipermeabel terhadap partikel
solute. Partikel solut berpindah melalui membran ke larutan dengan konsentrasi rendah.
Dialisis digunakan untuk memisahkan garam-garam dari suspensi dalam biokimia dengan
tujuan mencegah koagulasi. Dialysis adalah metode pemisahan molekul besar (seperti pati
atau protein) dari molekul kecil (seperti glukosa atau asam amino) dengan difusi selektif
melalui membrane semipermeabel. Misalnya, jika larutan campuran pati dan glukosa
dimasukkan dalam wadah tertutup terbuat dari bahan semipermeabel (seperti selofan) lalu
direndam dalam gelas kimia berisi air, maka molekul glukosa yang lebih kecil akan melewati
membrane menuju ke air, sedangkan molekul besar, yaitu pati, akan tertinggal di dalam
wadah. Prinsip dasar dari dialisi ini adalah perbedaan molekul-molekul. Alat yang digunakan
yaitu wadah tertutup terbuat dari bahan semipermeabel (sperti selofun), gelas piala. Dialysis

ini digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang memiliki perbedaan ukuran.


Membrane sel pada makhluk hidup bersifat semipermeabel, dan dialysis berlangsung secara
alami dalam ginjal untuk mengeluarkan limbah bernitrogen. Ginjal buatan (mesin dialysis)
menggunakan asas ini untuk menggantikan fungsi ginjal sakit.

Gambar 1. Teknik Pemisahan Dialisis

2.

ELEKTROFORESIS
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Hasil dari berbagai manipulasi DNA dan
analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan
senyawa yang bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik.
Elektroforesis memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub
ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif. Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk
pemisahan protein. Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang berbeda lain dari
biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino.
Menurut Andrews (1993), lektroforesis merupakan teknik yang umum digunakan untuk analisis
DNA dan protein. Melalui teknik ini dapat ditentukan:
1. Berat molekul suatu bahan
2. Banyaknya jenis protein pada suatu sampel
3. Adanya pemalsuan bahan atau kerusakan/kontaminasi bahan

4. Adanya antibodi terhadap virus atau bakteri pathogen tertentu


5. Titik isoelektrik protein

Hartati dan Lisdiyati (1997) menyebutkan terdapat dua macam macam teknik elektroforesis yang
telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal. Sedangkan menurut Suranto
(2002), berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:
1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan
tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel
tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan,
mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarosa atau
poliakrilamid.
Peralatan untuk elektroforesis secara umum terdiri dari 2 komponen utama, yaitu power supply
sebagai sumber arus listrik dan tangki elektroforesis. Untuk menghantarkan listrik, gel diletakkan
dalam suatu bufer. Bufer yang sama digunakan untuk membuat gel (Tchin et al., 2011). Untuk
pewarnaan digunakan Ethidium Bromida, suatu zat pewarna yang dapat menyisip/interkalasi di
antara basa DNA pada dua utas DNA yang berlainan. Ethidium Bromida (EtBr) akan berpendar di
bawah paparan sinar UV (Lepais and Bacles, 2011). Pewarna ini dapat ditambahkan pada gel dan
bufer sehingga tidak perlu melakukan staining sesudah proses elektroforesis. Keuntungannya adalah
lebih praktis, tetapi kemungkinan kontaminasi EtBr lebih besar. EtBr adalah zat yang bersifat
karsinogenik sehingga harus dihindari kontak langsung (Andrews, 1993).
Untuk analisis DNA gel yang digunakan adalah agarosa, suatu polisakarida (Allen et al., 1984).
Elektroforesis yang dilakukan adalah sistem horizontal. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak
ke arah kutub positif melalui molekul-molekul agarosa (Hartati dan Lisdiyati, 1997). Selain agarosa,
gel poliakrilamid juga dapat digunakan untuk memisahkan DNA, terutama untuk fragmen yang
berukuran kecil (antara 5 bp-<1 kb), misalnya untuk sekuensing (Lepais and Bacles, 2011). Laju
migrasi DNA pada agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor:
1. Arus listrik
Semakin besar arus listrik yang digunakan, laju migrasi akan semakin cepat. Akan tetapi jika
arus yang digunakan besar, akan menimbulkan panas yang dapat menyebabkan gel meleleh.

2. Konsentrasi gel
Konsentrasi agarosa yang digunakan akan menentukan besarnya pori-pori gel yang akan
memisahkan DNA. Untuk mendapatkan resolusi yang tinggi digunakan konsentrasi agarosa
yang lebih tinggi. Agarosa umumnya dipakai dalam konsentrasi antara 1%-3%.

3. Ukuran molekul
Molekul yang berukuran lebih kecil akan lebih mudah melalui pori-pori gel sehingga laju
migrasinya lebih cepat. Tetapi ini hanya berlaku untuk fragmen yang berukuran antara 0,515 kbp dan bila konformasinya sama. Kecepatan migrasi akan berbanding terbalik dengan
log 10 dari jumlah pasangan basa.

4. Bentuk molekul
DNA dapat memiliki beberapa kemungkinan bentuk, yaitu supercoil (SC), sirkular (S), linear
(L). Laju migrasi masing-masing dari yang paling cepat adalah SC > L > S. Untuk SC dan S, laju
migrasinya lebih ditentukan oleh bentuk molekul daripada ukurannya.

5. Arah medan listrik


Molekul DNA akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbanding terbalik dengan ukuran
molekulnya jika medan listrik tetap/konstan. Jika arah medan listrik diubah, molekul yang
besar akan membutuhkan waktu yang lebih lama untuk reorientasi. Elektroforesis dengan
mengubah arah medan listrik secara periodik dikenal dengan Pulsed Field Gel Electrophoresis
(PFGE).

6. Adanya Ethidium Bromida (EtBr) di dalam gel


Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar
15%.

7. Komposisi Larutan Bufer


Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik menjadi sedikit dan
migrasi DNA sangat lambat, sedangkan larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan
meningkatkan panas sehingga aliran listrik akan menjadi sangat maksimal.

Teknik elektroforesis dapat dibedakan berdasarkan medium penyangganya, antara lain :


1. Elekroforesis Kertas
Dengan menggunakan medium kertas, pemisahan dan analisis terhadap asam
amino, peptida, nukleotida, dan ion-ion logam yang kecil dapat dilakukan. Kelemahan
elektroforesis kertas yaitu adanya gangguan yang disebabkan oleh adanya gugus OH- yang
terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi
molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah . Kelemahan ini dapat diatasi dengan
cara asetilasi gugus hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat yang tidak polar.
Hal ini menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu, resolusi lebih baik, dan proses
pemisahan berlangsung lebih cepat. Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah
proses migrasi lebih cepat, pemisahan spot menjadi lebih kecil, mudah memisahkan sampel
dengan spektrofotometri, dan mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit. Pada
elektroforesis kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkan dengan cara
kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya dan spotnya lebih kecil
daripada cara basah.

Gambar 2. Elektroforesis Kertas

2. Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan

listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya
oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada
ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,
namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida
dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang
lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah
menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat
yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat
protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna
"biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul
sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium
bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom
radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah
proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita
yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul
yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang

biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda
(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat
digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada
lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran
molekul.

Gambar 3. Elektroforesis Gel

3.

KROMATOGRAFI
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan

antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada
larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat
dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat
dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen
tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis
lebih lanjut.
Berdasarkan bahan dan peralatan yang digunakan kromatografi dibedakan menjadi 4 jenis, antara
lain :

1. Kromatografi Kertas (Paper Chromatography)


Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan
distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan
sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas,
prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai
pengganti kolom. Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi
partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu
disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas
dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan
air. Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk
selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang teradsorpsi dalam selulosa
kertas.fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk
bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas
dilakukan dengan cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik
dengan time retention (tR) atau volume retention (VR).

Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga


besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama.
Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan.
Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua
dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.
Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi
sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1 cm dari tepi kertas. Setelah penetesan
larutan

pada

kertas, maka

bagian

bawah kertas

dicelupkan

dalam

larutan

pengambang(developing solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa


pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air. Sistem ini akan terserap oleh kertas dan
sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini
dapat diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan,
sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya telah
jenuh dengan uap sistem pelarut ini.

Gambar 4. Kromatografi Kertas

2. Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Chromatography)


Salah satu metode pemisahan yang sederhana ialah kromatografi lapis tipis. Pada
dasarnya prinsip pada KLT sama dengan kromatografi kertas hanya KLT mempunyai
kelebihan yang khas dibandingkan dengan kromatografi kertas yaitu keserbagunaan,
kecepatan, dan kepekaannya. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai
sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, ataupun preparatif. Kedua,
dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai pada
kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi/KCKT. Analisis dari KLT dapat
membantu menentukan pelarut terbaik apa yang akan dipakai dan berapa perbandingan
antar pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak pada kromatografi kolom.
Kromatografi lapis tipis sangat berhubungan dengan kromatografi kolom, hal ini karena
fasa-fasa senyawa yang digunakan dalam teknik keduanya sama. Alumina dan silika gel
adalah fasa diam yang biasa digunakan, dan fasa geraknya menggunakan eluen yang
sama. Walaupun demikian, tetap terdapat perbedaan antara KLT dan kromatografi kolom.
Fasa gerak (cair) di dalam kromatografi kolom bergerak turun, sedangkan dalam KLT
bergerak naik. Bahan fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom yang berupa
kolom digantikan dengan suatu lapisan tipis (tebalnya 100 m) pada KLT, yang merata
pada seluruh bagian permukaannya. Bahan-bahan dari gelas atau lembaran-lembaran
plastik dapat digunakan sebagai bahan pendukung fasa diam untuk lapis tipisnya.
Sangat dimungkinkan bagi kita untuk menyiapkan lembaran KLT yang dari gelas,
tetapi untuk yang bahan pendukungnya plastik hanya tersedia secara komersil. Lembaran
yang pendukungnya plastik sangat menarik karena dapat dipotong dengan gunting

menjadi lembaran-lembaran yang lebih kecil dengan berbagai ukuran. Biasanya lembaran
kecil itu berukuran 13 inci tetapi untuk lembaran yang lebih kecil dapat disesuaikan.
KLT mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya: waktu yang dibutuhkan tidak lama (2
5 menit) dan sampel yang dipakai hanya sedikit sekali (2 20 g). Kerugiannya dengan
menggunakan KLT adalah tidak efektif untuk skala industri. Walaupun lembaran KLT yang
digunakan lebih lebar dan tebal, pemisahannya sering dibatasi hanya sampai beberapa
miligram sampel saja .
Larutan sampel ditotolkan pada plat dengan pipet mikro atau injektor pada jarak 1
2 cm dari batas plat. Setelah kering plat siap untuk dikembangkan dengan fasa gerak
sampai pada batas tertentu. Proses pengembangan dikerjakan dalam wadah tertutup
yang diisi eluen dan telah dijenuhi uap eluen agar dihasilkan pemisahan yang baik.
Langkah selanjutnya yaitu mengeringkan sisa eluen dalam plat, kemudian melakukan
identifikasi yang dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu: pengamatan langsung
(untuk noda/bercak yang tampak), dengan lampu ultraviolet, atau dengan pereaksi
semprot penimbul warna. Dalam penelitian ini menggunakan pereaksi yang digunakan
adalah Dragendorff.

Gambar 5. Kromatografi Lapis Tipis

3. Kromatografi Cair (Liqiud Chromatography)


Teknik kromatografi cair dibagi menjadi 4, yaitu :
1. Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi penukar ion merupakan metode pemisahan berdasar-kan muatan
molekul di bawah kondisi pH dan kekuatan ion tertentu. interaksi elektrostatik dari
berbagai jenis ligan bermuatan pada matriks dengan gugus yang dapat berionisasi

pada protein akan menimbulkan mekanisme pemisahan. Penukar anion yang


bermuatan positif dipilih untuk mengikat molekul asam, sedangkan penukar kation
yang bermuatan negatif memberikan mekanisme pemisahan untuk molekul bersifat
basa. Karena enzim memiliki aktivitas, maka sebelum dilakukan pemisahan dengan
metode tersebut terlebih dahulu diketahui pH optimum enzim, sehingga aktivitas
enzim tetap dapat dipertahankan.
Protein memiliki muatan positif dan negatif terutama disebabkan oleh rantai
samping dari asam amino penyusunnya. Muatan positif di-sumbangkan oleh asam
amino histidin, lisin, arginin dan gugus amino dari N-terminal, sedangkan muatan
negatif disumbangkan oleh aspartat, glutamat dan gugus karboksil pada C-terminal.
Muatan bersih protein bergantung pada jumlah relatif gugus bermuatan positif dan
negatif yang bervariasi berdasarkan pH lingkungan. Tingkat keasaman protein atau
enzim dengan jumlah muatan positif dan negatif sama dikenal sebagai pH isoelektrik
atau titik isoelektrik (pl). Pada umumnya protein memiliki nilai pH sekitar 5,0-9,0.
Protein yang memiliki pH di atas nilai pl akan bermuatan negatif, sedangkan pH di
bawah nilai pl akan bermuatan positif.

Gambar 6. Prinsip kerja kromatografi penukar ion

Prinsip kromatografi penukar ion adalah penggunaan matriks penukar ion yang
mengikat secara kovalen gugus fungsi bermuatan negatif pada penukar kation, atau
gugus fungsi yang bermuatan positif pada penukar anion seperti terlihat pada gambar
8. Matriks berupa polimer elastis dan mengandung senyawa resin sintetik yang

terbuat dari bahan dekstran: selulosa atau sefadeks. Matriks penukar kation yaitu
karboksimetil selulosa (CMC), dan matriks penukar kation yaitu dietil aminoetil
(DEAE)-selulosa dan DEAE-sefadeks.
2. Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro molekul
biologi lain berdasarkan ukuran molekul, jadi bekerja sebagai suatu penyaring molekul
seperti terlihat pada gambar 10. Proses pemisahan ini menggunakan gel yaitu
dekstran (polimer gula yang larut dalam air) dan mengalami reaksi ikatan silang (cross
linkage) sehingga dekstran menjadi tidak larut dalam air, tetapi masih dapat
menyerap molekul air dalam molekulnya.
Daya serap matriks bergantung pada jumlah ikatan silang yang terjadi di dalamnya.
Matriks atau gel dekstran disebut juga sebagai sefadeks, misalnya sefadeks G-50.
Huruf dan nomor menunjukkan bahwa safadeks tersebut dapat dikembangkan
(Swelling) dengan air atau larutan penyangga dengan besar pengembangnya 50 kali.
Gel atau matriks ini berpori yang dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair
mobil. Molekul yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori matriks dan bergerak lebih
lambat, sedangkan molekul yang lebih besar akan bergerak lebih cepat karena tidak
tertahan di dalam pori matriks. Dengan demikian kromatogram molekul-molekul yang
lebih besar akan muncul sebagai komponen awal seperti terlihat pada gambar 10.

Gambar 7. Prinsip kerja kromatografi filtrasi gel

3. Kromatografi Interaksi Hidrofobik


Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan metode pemisahan berdasarkan
perbedaan hidrofobisitas pada permukaan protein. Hal ini bergantung pada interaksi
hidrofobik antara permukaan protein dengan gugus hidrofobik yang terikat secara
kovalen pada matriks. Pada kondisi kekuatan ion yang tinggi, protein atau enzim akan
terikat kuat pada matriks melalui interaksi hidrofobik, hal seperti ini dapat terlihat
pada gambar 9. Matriks yang umum digunakan bersifat nonpolar, turunan jenis
sefarosa yakni fenil sefarosa atau butil sefarosa.

Gambar 8. Prinsip kerja Kromatografi interaksi hidrofobik


Suatu campuran protein dimasukkan ke dalam kolom interaksi hidrofobik dalam kondisi
ionik yang tinggi. Pada kekuatan ion yang tinggi protein terikat kuat pada matriks melalui
interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik suatu protein, maka semakin kuat ikatannya.
Protein yang terikat pada matriks dapat terlepas jika dielusi dengan eluen yang kekuatan
ionnya semakin menurun yaitu dengan konsentrasi garam dari tinggi ke yang lebih rendah.
4. Kromatografi Afinitas
Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi,
dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik.
Tujuan dari kromatografi afinitas adalah untuk memisahkan semua molekul dari
kekhususan tertentu dari keseluruhan seluruh molekul dalam campuran. Pemurnian
dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tahap (one step
purification) Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas
diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan.
Dalam kasus ini pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap

sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks. Skema yang paling urnum untuk melakukan
krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahap elusi gradien. Skema ini
melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom afinitas dengan adanya fase gerak (dengan
pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solut-ligan. Pelarut ini, yang
menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi.
Selama fase aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan
afinitas akan berikatan karena sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi.
Meskipun demikian, karena selektifitas interaksi solut-Iigan yang tinggi, sampelsampel lain yang tidak terikat akan melewati kolom tanpa tertahan. Setelah
komponen-komponen yang tidak tertahan telah tercuci secara sempurna dari kolom,
solut yang tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut yang mampu
mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu memecah kompleks ligan-solut.
Pelarut ini merupakan fase gerak yang kuat dan seringkali dikenal sebagai bufer elusi.
Begitu solut yang dikehendaki keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau
dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom selanjutnya diiregenerasi dengan
cara mensetimbangkan kembali menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut
Komplementer molekul yang mengikat (ligan) pertama kovalen digabungkan ke larut
matriks, seperti kecil agarosa manik-manik, dan matriks dituangkan ke dalam kolom.
Suatu campuran tidak murni mengandung protein untuk diisolasi ini kemudian
diterapkan pada kolom dan memungkinkan untuk berinteraksi dengan ligan amobil
Pada tahap ini, protein yang akan diisolasi mengikat secara khusus untuk ligan amobil
sementara sisa molekul dalam aliran campuran melalui kolom. Protein kepentingan
kemudian dapat dielusi dari kolom di bawah kondisi yang mengganggu interaksinya
dengan ligan bufer pengelusi mengandung zat yang berfungsi untuk memutuskan
ikatan antara protein yang akan diambil dengan lingannya. Jadi, buffer pengelusi ini
dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat, sehingga protein lepas dan
selanjutnya keluar bersama eluen.
Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein hasil pemurnian
tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan
ikatan antara ligan dengan protein, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang

melebar. Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan
yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak
serapan, sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak.

Gambar 9. Prinsip Kerja Kromatografi Afinitas


4. Kromatografi Gas (Gas Chromatography)
Kromatografi gas adalah suatu metode yang didasarkan pemisahan fisik zat organik atau
anorganik yang stabil pada pemanasan dan mudah diatsirikan. Kromatografi sebagai
instrument untuk analisis fisika kimia menduduki posisi yang sangat penting dan banyak
dipakai, hal ini disebabkan oleh :
1.

Aliran fase gerak (gas) sangat terkontrol dan kecepatannya tetap

2.

Sangat mudah terjadi pencampuran uap sample ke dalam aliran fase gerak

3.

Pemisahan fisik terjadi di dalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan
suhunya dapat diatur.

4.

Banyak detektor yang dapat dipakai.

5.

Mudah digabung dengan instrumen lain (GC-MS, GC-FTIR-MS)

Kelima hal tersebut di atas telah melebarkan jangkauan penggunaan kromatografi gas yang
sampai saat ini secara luas banyak digunakan / dibutuhkan untuk analisis fisiko-kimia
(kualitatif dan kuantitatif).Pada kromatografi gas sample diuapkan di dalam gerbang suntik
(injection port) dan selanjutnya mengalami pemisahan fisik pada kolom setelah dielusi

dengan fase gerak (gas pembawa) yang inert (lembam). Ada dua metode kromatografi gas,
yaitu :
1.

Kromatografi Gas Padat (KGP) : Fase diam pada KGP adalah butiran-butiran
adsorben padat dan fase geraknya adalah gas. Mekanisme pemisahan komponen
sample adalah perbedaan fisik adsorpsi oleh fase diam. Ada beberapa kelemahan
KGP yaitu : adsorpsi fase diam terhadap komponen-komponen sample bersifat
semipermanen terutama terhadap molekul yang aktif atau molekul yang polar. Di
samping itu, KGP sering kali memberikan bentuk kromatogram yang berekor.
Kelemahan yang lain dari KGP adalah efektivitas pemisahan komponen sanhat
dipengaruhi oleh bobot molekul. KGP lebih efektif untuk pemisahan komponenkomponen dengan massa relative (Mr) rendah.

2.

Kromatografi Gas Cair (KGC) dikemukakan pertama kali oleh Martin dan Synge.
Pada KGC sebagai fase diamnya adalah cairan yang disalut tipis pada permukaan
butiran padat sebagai pendukung, sedangkan fase geraknya adalah gas yang
lembam. mekanisme pemisahannya adalah perbedaaan partisi komponenkomponen sample diantara fase diam dan fase geraknya.

Gambar 10. Kromatografi Gas

REVIEW JURNAL

Berdasarkan jurnal Purifikasi Protein Fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes Hasil Ekspresi
Heterolog di Escherichia coli (jurnal terlampir) telah dilakukan optimasi proses pemurnian protein
fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes dari Escherichia coli pMALMga rekombinan yang
mengandung gen mga49. Pemurnian dilakukan menggunakan kolom kromatografi afinitas dengan
ligan amilosa. Kemudian di analisis menggunakan SDS-page dan menghasilkan pita tunggal dengan
ukuran 104 kDa yang menunjukkan protein fusi MBP-Mga murni.
Pemurnian terhadap protein ekstrak kasar E. coli pMALMga hasil overekspresi dilakukan
masing-masing 4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom dan
4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom. Hasil pengukuran
serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa yang
sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom untuk 4 kali pengulangan masingmasing menunjukkan 1,897 g/ml, 1,890 g/ml, 1,901 g/ml dan 1,898 g/ml. Sedangkan hasil
pengukuran serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa
yang sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom untuk 4 kali pengulangan masingmasing adalah 1,897 g/ml, 1,890 g/ml, 1,901 g/ml dan 1,898 g/ml.
Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom
terdapat pada fraksi ketiga sampai kelima, sedangkan protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang
dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom terdapat pada fraksi ketiga sampai ketujuh.
Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian
tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara
ligan (amilosa) dengan protein fusi MBP-Mga, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar.
Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada semakin
banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein MBPMga yang dihasilkan lebih banyak. Dari data hasil penelitian, diketahui bahwa pemurnian protein fusi
MBP-Mga dengan teknik kromatografi afinitas menggunakan kolom resin amilosa memberikan hasil
yang reprodusibel.
Kemudian dilakukan analisis SDS-Page untuk melihat hasil pemurnian dengan kolom resin
amilosa. Protein yang digunakan sebagai pembanding terhadap protein MBP-Mga murni hasil
pemurnian adalah protein marker dan protein ekstrak kasar E.Coli pMALMga yang diinduksi selama 2
jam dengan IPTG 0,3 mM dalam medium LB yang mengandung 0,2% glukosa. Hasil pemurnian
protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom memberikan
kadar yang hampir sama, tetapi pemurnian protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci

100X volume kolom memberikan hasil yang lebih murni, karena pada elektroforegram memberikan
satu pita dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa. Protein Mga yang difusikan dengan protein
MBP terdiri dari 533 asam amino dan pI 5,88.