Anda di halaman 1dari 7

METODE KERJA

Amplifikasi fragmen gen PerL


Konstruksi vektor ekspersi pGWB502-PerL
Introduksi pGWB502-PerL ke dalam
Agrobacterium tumefaciens LBA4044
Transformasi genetik Nicotiana tabacum
SR1
Identifikasi Nicotiana tabacum SR1
transgenik

KONSTRUKSI VEKTOR EKSPRESI GEN Peroksidase


Sistem Gateway Cloning
Fragmen PerL diamplifikasi dari pGEM-PerL dengan primer
yang ditambah situs CACC pada ujung 5 forward

Purifikasi dengan
elusi
PerL pENTR-F
Atprx-R

5-CAC CAT GCA TTT CTC TTC GTC-3


5-GTT CTG AAG TAA ACG TCT TGA GAG -3

1100bp

RESULT
Pengklonan Entry Vektor pENTR-PerL dengan Vektor
Ekspresi pGWB502
PCR Koloni dengan primer 35SF dan AtprxR
1

Hasil restriksi dengan enzim spe1 dan sac1

1500bp
1000 Bp

35SF

RB

1500 bp

35S-P

PerL

AtprxR

Tnos

1100 bp

Spe1

Sac1

Tnos:NPTII:Pnos

LB

Triparental
mating

Introduksi pGWB502PerL ke A. tumefaciens


E. coli

DH5

PCR koloni dengan primer


35SF dan AtprxR

Plasmid rekombinan
pGWB502-PerL
E. coli
DH1

pRK2013

Media LA
tanpa
antibiotik

A. tumefaciens

Media LA dengan
antibiotik
spectinomisin dan
streptomisin

RESULT
Introduksi pGWB502-PerL ke dalam A. tumefaciens LBA4404
1

1500 bp

AtprxR

1500 bp

35SF

RB

35S-P

PerL

Tnos

Tnos:NPTII:Pno
s

LB

Transformasi genetik Nicotiana tabacum


Daun dipotong
dan direndam

A. tumefaciens
LBA 4404
transforman

Media kokultivasi

Media induksi
kalus

PCR
Seleksi hyg 30
mg/L

Media induksi
akar (5 minggu)

Media induksi
akar (8 minggu)

RESULT
Identifikasi Nicotiana tabacum SR1
Transgenik
M

1500bp

35SF

RB

35S-P

1500 bp
PerL

AtprxR

Tnos

Tnos:NPTII:Pnos LB