Evaluasi Kegiatan Antioksidan Cell Ekstrak dari Mikroalga

Catarina Guedes 1,2 , Maria S. Giao 1 , Rui Seabra 3 , AC Silva Ferreira 1 , Paula
Tamagnini 3,4 . Pedro Moradas-Ferreira 3,5 dan F. Xavier Malcata 2,6, * 1 CBQF /
Bioteknologi College, Universitas Katolik Portugal, Rua Dr. Antnio Bernardino de
Almeida, Porto P-4200-072, Portugal; E-Mail: acatarinaguedes@gmail.com (ACG);
msilvagiao@hotmail.com (MSG); acferreira@esb.ucp.pt (ACSF) 2 Cimar / CIIMARInterdisipliner Pusat Riset Kelautan dan Lingkungan, Universitas Porto, Rua dos
Bragas n177, Porto P-4050-123, Portugal 3 IBMC-Lembaga Biologi Molekuler dan
Seluler, University of Porto, Rua do Campo Alegre n823, Porto P-4150-180,
Portugal; E-Mail: ruisea@gmail.com (RS); pmtamagn@ibmc.up.pt (PT);
pmferrei@ibmc.up.pt (PM-F.) 4 Departemen Biologi, Fakultas Ilmu, Universitas Porto,
Rua do Campo Alegre, Edificio FC4, Porto P-4169-007, Portugal 5 ICBAS-Institute of
Biomedical Sciences Abel Salazar, University of Porto, Largo Abel Salazar n2, Porto
P-4099-003, Portugal 6 Departemen Teknik Kimia, Universitas Porto, Rua Dr. Roberto
Frias, Porto P-4200-465, Portugal * Penulis untuk siapa korespondensi harus
ditangani; E-Mail: fmalcata@fe.up.pt; Tel .: + 351-968-017-411. Diterima: 15 Januari
2013; dalam bentuk direvisi: 6 Maret 2013 / diterima: 7 Maret 2013 / Diterbitkan: 17
April 2013
Abstrak: Sebuah pasar yang berkembang untuk antioksidan baru yang diperoleh
dari sumber-sumber non-mahal membenarkan skrining berpendidikan dari
mikroalga untuk fitur antioksidan potensi mereka. Karakterisasi profil antioksidan 18
spesies cyanobacteria (prokariotik mikroalga) dan 23 spesies (eukariotik) mikroalga
yang sesuai dilaporkan dalam makalah ini. Kapasitas antioksidan total, dicatat
dengan baik air dan antioksidan larut lemak, dievaluasi dengan metode (kation
radikal) ABTS. Untuk karakterisasi pelengkap dari ekstrak sel, uji deoksiribosa
dilakukan, serta bakteriofag P22 / Salmonella -dimediasi pendekatan. The mikroalga
Scenedesmus obliquus ketegangan M2-1 dipamerkan tertinggi (p> 0,05) kapasitas
antioksidan total (149 47 AAU) intraseluler ekstrak. Kegiatan pemulung yang
berkorelasi dengan baik dengan efek protektif terhadap DNA kerusakan oksidatif
yang disebabkan oleh tembaga (II) asam -ascorbic; dan melawan kerusakan di
bakteriofag Kapasitas infeksi yang disebabkan oleh H 2 O 2 . Akhirnya, kinerja tes
Ames mengungkapkan tidak ada Efek mutagenik dari ekstrak kata. Kata kunci: 16S
rDNA; ABTS + ; deoksiribosa; DNA; fag P22 / Salmonella; Tes Ames
1. Perkenalan
Dekade terakhir telah menyaksikan minat dalam senyawa dari sumber alami yang
menanggung sifat antioksidan karena senyawa ini dapat memberikan kontribusi
yang relevan untuk menjaga kesehatan, misalnya, melalui konsumsi rutin sebagai
bagian dari makanan dirumuskan. Memang bukti yang dikumpulkan dalam sejumlah
besar Studi di seluruh dunia mendukung peran antioksidan dalam pencegahan dan
pengendalian pertumbuhan tumor tertentu, serta dalam kejadian dan keparahan
penyakit kardiovaskular dan degeneratif [1-3]. Selain itu, efek menguntungkan pada

rentang kehidupan manusia melalui penundaan penuaan telah diklaim, didasarkan

pada penurunan biomarker seperti karbonil protein yang dihasilkan melalui
kerusakan oksidatif. Pasar berkembang untuk antioksidan baru yang diperoleh dari
non-mahal, sumber kurang konvensional karena itu membenarkan pencarian yang
komprehensif yang mencakup sumber yang tidak biasa - seperti halnya dengan
mikroalga. Mikroalga merupakan dasar dari rantai makanan di ekosistem perairan;
dengan bantuan energi matahari, mereka dapat menggunakan H 2 O dan CO 2
untuk mensintesis senyawa organik kompleks - dan kemudian menumpuk dan /
atau mengeluarkan banyak metabolit primer dan sekunder yang menarik [4-6].
Selanjutnya, mikroalga pameran tanggapan adaptif terhadap tekanan oksidatif,
melalui stimulasi sistem pertahanan antioksidan mereka [7] yang terdiri dari
mekanisme baik enzimatik dan non-enzimatik: superoksida dismutase, katalase,
glutathione reduktase dan askorbat peroksidase adalah enzim kunci dalam bekas,
sedangkan rekan non-enzimatik termasuk senyawa seperti mediator sebagai asam
askorbat, glutation tereduksi, tokoferol, karotenoid dan phycocyanin [8]. Upaya
penelitian yang diuraikan dalam tulisan ini mencoba untuk memberikan kontribusi
untuk memperluas penggunaan mikroalga, yaitu dalam industri makanan, dengan
secara khusus mengambil keuntungan dari fitur antioksidan. Oleh karena itu, karya
eksperimental meliputi pemutaran beberapa mikroalga biasa bagi perilaku
antioksidan menggunakan pendekatan analitis pelengkap; tes awal mutagenisitas
juga dilakukan, seperti diperlukan sebelum ekstrak mikroba tertentu mengalami
lebih mendalam mengenai karakterisasi nilai tambah tinggi senyawa fungsional (s).
Kedua ekstrak intra dan ekstra-seluler dianggap, sehingga untuk secara
komprehensif ciri strain dalam hal kapasitas antioksidan total; mantan adalah
biasanya lebih berlimpah, tetapi yang terakhir akan lebih menarik dari sudut
pandang pengolahan pandang yg berhutang untuk pemulihan lebih mudah dari
kaldu mikroba. Skrining dimulai dengan tes generik untuk antioksidan fitur; hanya
mereka strain bantalan potensi yang baik menjadi sasaran tes yang lebih rinci,
sehingga untuk cukup sesuai dengan sumber daya terbatas laboratorium sementara
memaksimalkan keberhasilan percobaan.
2. Hasil dan Diskusi
2.1. Mikroorganisme Tujuan utama dari upaya penelitian ini adalah untuk
mengidentifikasi sel-sel mikroalga kurang konvensional menyimpan senyawa
dengan kapasitas antioksidan. Oleh karena itu, set mikroorganisme diuji termasuk
strain yang tidak biasa / spesies dipelihara dalam koleksi budaya, serta yang liar
diisolasi dari unik ekosistem di Portugal (lihat Tabel 1 dan 2). Isolat lingkungan
diidentifikasi melalui pendekatan polifasik, menggunakan kedua morfologi
karakteristik dan sequencing parsial 16S rRNA; isolat seperti itu sementara dinamai
mereka terdekat relatif berbudaya.
* Regangan liar, diidentifikasi menggunakan karakteristik morfologi dan sequencing
parsial 16S rDNA. a-d Berarti dalam kolom yang sama, tanpa superscript umum,
berbeda secara signifikan (p <0,05). nd (tidak terdeteksi). ACOI-Coimbra Koleksi

Alga (University of Coimbra, Portugal); ATCC-American Type Culture Collection

(USA); CBSC-Carolina Biological Supply Company (USA); CCAP Budaya-Koleksi Algae
dan Protozoa (Inggris); IPIMAR (Portugal); dan PCC-Pasteur Culture Collection
(Prancis).
a-g Berarti dalam kolom yang sama, tanpa superscript umum, berbeda secara
signifikan (p <0,05). 1 Spesies liar, diidentifikasi dengan menggunakan karakter
morfologi dan sequencing parsial chloroplastidial 16S rDNA. 2 Menengah ASW tanpa
0,04 g / L SiO 3 . nd (tidak terdeteksi).
2.2. Kapasitas antioksidan sebagai ABTS Scavenging Pemilihan mikroorganisme
paling menjanjikan (s) didasarkan pada tes untuk aktivitas antioksidan mereka
melalui pendekatan yang saling melengkapi; Strategi ini diharapkan efektif
mengatasi (jelas) keterbatasan dari setiap metode analisis yang diusulkan bila
dianggap independen. Uji pertama diukur perlindungan terhadap kerusakan
oksidatif oleh ekstrak sel dan jelas menunjukkan bahwa mengisolasi M2-1
(Scenedesmus obliquus) dilakukan yang terbaik. Oleh karena itu, hanya isolat ini
menjadi sasaran pelengkap tes antioksidan seperti yang dibahas dalam subbagian
berikutnya. Hasil radikal bebas ABTS tes tercantum dalam Tabel 1 dan 2, untuk
ekstrak intra dan ekstraseluler dari cyanobacteria dan mikroalga, masing-masing.
Konsentrasi asam-setara askorbat dalam ekstrak intraseluler berkisar antara 1,84
0,57 AAU (Antioksidan Kegiatan Unit) untuk Nodularia harveyana ke 38,10 6,03
AAU untuk Gloeobacter violaceus. Untuk ekstrak ekstraseluler, nilai-nilai yang
diperoleh jauh lebih rendah [9] - mulai dari (3.56 0.76) 10 -5 AAU untuk Nostoc
muscorum 0,07 0,01 AAU untuk G. violaceus. Mengenai ekstrak intraseluler dari
mikroalga, konsentrasi asam askorbat-setara berkisar antara 1,54 0,05 AAU untuk
Desmodesmus pleiomorphus A ke 149,00 46,60 AAU untuk M2-1 (S. obliquus).
Tingkat aktivitas antioksidan yang ditemukan dalam pemeriksaan awal ini
mengungkapkan bahwa ekstrak intraseluler mikroalga biasanya lebih kuat
dibandingkan cyanobacteria: ini terutama terjadi untuk isolat M2-1 (S. obliquus),
tingkat yang hampir empat kali lipat nilai tertinggi diperoleh dengan G. violaceus.
2.3. Kapasitas antioksidan sebagai deoksiribosa Perlindungan Perlindungan DNA
dari kerusakan oksidatif yang analitis ditentukan melalui perlindungan mikroalga
dan cyanobacterial ekstrak intraseluler pada diinduksi kerusakan deoksiribosa [10].
Tes ini diaplikasikan hanya untuk strain yang paling menjanjikan sebagai
menyimpulkan dari pemeriksaan Tabel 1 dan 2. Karena tidak ada ekstrak
dipamerkan efek pro-oksidan, kekuatan antioksidan berkorelasi linear (dan positif)
untuk kemampuan untuk menghambat degradasi deoksiribosa. Oleh karena itu,
ekstrak intraseluler yang paling strain menjanjikan mampu melindungi deoksiribosa
dan menurun secara signifikan luasnya degradasi, yang merupakan indikasi dari
kapasitas pemulung radikal hidroksil (lihat Tabel 3). Perlindungan terkuat adalah
sekali lagi terkait dengan ketegangan M2-1, sehingga hanya ekstrak ini menjalani
pengujian lebih lanjut.

2.4. Kapasitas antioksidan sebagai Perlindungan DNA Hal ini diketahui bahwa
spesies oksigen aktif bereaksi dengan DNA (selain deoksiribosa), dan secara
bersamaan menghasilkan untai istirahat yang dapat dideteksi menggunakan
pemisahan elektroforesis fragmen DNA sehingga diproduksi. Berikut Perez et al.
[11], asam askorbat dan tembaga yang digunakan untuk menginduksi oksidasi (dan
pembelahan DNA konsekuen); selain penilaian terhadap kapasitas antioksidan M2-1
(S. obliquus) ekstrak. Metode ini juga membahas pertanyaan apakah efek prooksidan hadir (yaitu, jika bisa menyebabkan oksidasi dengan sendirinya). Hasilnya
digambarkan pada Gambar 1.
Menurut metode ini, ekstrak M2-1 melindungi DNA betis-timus dari induksi oksidatif
kerusakan. Efek ini menjadi secara bertahap lebih terlihat sebagai volume sampel
meningkat (lihat Gambar 1, jalur A), dan mencapai tingkat maksimum ketika 200 uL
ekstrak sel diinkubasi dengan DNA (Lihat Gambar 1, jalur A1). Volume yang lebih
tinggi (dari 200 sampai 400 uL) tidak secara signifikan mempengaruhi tingkat
perlindungan (data tidak ditampilkan). Dalam semua kasus, tidak ada efek prooksidan yang signifikan terdeteksi (lihat Gambar 1, jalur A '). 2.5. Kapasitas
antioksidan sebagai Bacteriophage Perlindungan Penggunaan bakteriofag sebagai
sistem in vivo untuk menilai kapasitas antioksidan adalah relatif baru Pendekatan,
namun hasil yang dipublikasikan di tempat lain [12,13] membuka kesesuaian
sebagai metode analisis. Dalam rangka untuk memastikan efek antioksidan dari
ekstrak M2-1, uji pendahuluan digunakan hanya etanol / air (1: 1, v / v) untuk
menentukan apakah etanol akan mempengaruhi pertumbuhan fag; disimpulkan
bahwa tidak bertindak sebagai baik oksidan atau antioksidan (data tidak
ditampilkan). Efek antioksidan menggunakan assay spesifik ini dihitung sebagai
perbedaan antara diamati Tingkat infeksi bakteri oleh virus di hadapan kedua M2-1
ekstrak dan H 2 O 2 (SPO), dan rekan di hadapan H 2 O 2 hanya (OP). Kurva
inaktivasi dari bakteriofag P22, yang dicapai dengan menambahkan 250 mM H 2 O
2 , Jelas membuka pengurangan jumlah fag tersedia untuk menginfeksi Salmonella
selama percobaan (lihat OP pada Gambar 2). Dengan 20 menit, tiga pengurangan
log-siklus sudah dicapai relatif terhadap nomor fag awal; Penurunan ini digunakan
sebagai garis dasar untuk menilai aktivitas antioksidan dari ekstrak M2-1. Setelah
menambahkan 50 mg mL -1 dari ekstrak mengatakan, efek oksidan dari H 2 O 2
pada fag itu secara signifikan berkurang, p> 0,05 (lihat SPO pada Gambar 2). Di sisi
lain, M2-1 ekstrak itu sendiri tidak menghasilkan kerusakan fag (lihat SP pada
Gambar 2). Selanjutnya, efek perlindungan penting adalah disampaikan oleh M2-1
ekstrak sesegera setelah 10 menit dari kontak, yang mencapai 1,5 unit log oleh 20
menit - meskipun efek dasarnya nihil diamati selama 5 menit pertama.
he M2-1 ekstrak itu sendiri tidak menghasilkan kerusakan virus, juga tidak etanol
yang digunakan sebagai pelarut mengganggu pengujian tersebut. Fag inaktivasi
oleh oksidasi kimia eksternal diinduksi bisa akurat memastikan efek stres oksidatif
pada integritas biologis DNA; alternatif, itu mungkin mencerminkan kerusakan pada
kapsid fag protein yang menghambat pengiriman bahan DNA batin. Hasil kami

menunjukkan bahwa ekstrak M2-1 secara efektif dapat melindungi fag P22 terhadap
kerusakan oksidatif oleh H 2 O 2 , Misalnya, di 50 mg mL -1 . 2.6. Senyawa
antioksidan Dengan tujuan mengidentifikasi senyawa tertentu yang dapat
menjelaskan kapasitas antioksidan Ekstrak M2-1, beberapa analisis dilakukan oleh
HPLC; standar yang diperoleh baik dari komersial sumber (misalnya, lutein), atau
ekstrak jelatang dan paprika kuning (misalnya, zeaxanthin, cryptoxanthin,
echinenone, neoxanthin, violaxanthin dan luteoxanthin) yang sesuai digunakan
sebagai referensi. Retensi kali dari standar tersebut digambarkan dalam Tabel 4.
Lutein telah dihitung menggunakan faktor respon linear, dihitung dari solusi
referensi (ditandai dengan faktor korelasi 0,9976), sedangkan -karoten,
violaxanthin dan konsentrasi neoxanthin dinyatakan sebagai lutein-setara.