Pesquisador(es)

ano

contribuio

J. J. Thompson

1912

Primeiro espectrmetro de Massas

Dempster

1918

Desenvolvimento de ionizao
eletrnica e focalizao magntica

Aston

1919

Massa atmica usando MS

Stephens

1946

anlise por Tempo de vo

Nier-Johnson

1952

Instrumentos de duplo-foco

Paul, Steinwedel, Raether,

1953-

Analisadores quadrupolo

Reinhard, von Zahn

1958

Willey e McLaren

1955

Desenvolvimento de analisador

tempo de vo avanado
Gohlke e McLafferty

1956

Cromatografia gasosa acoplado a

Espectrometria de Massas (CG-EM)

Beynon

1956

Espectro de Massas alta resoluo

Biemann, Seibl e Gapp

1959

Sequenciamento de Peptdeos

Hipple, Sommer e Wabschall

1965

ressonncia ciclotrnica de ons

Investigador(es)

Ano

Munson

1966

McLafferty

1967

contribuio
Ionizao Qumica

Espectrometria de Massas
Tandem

Dole, Mack, Hines e

Alice

McLafferty

1968

Ionizao Eletrospray

1973 Cromatografia Lquida acoplada a

espectrometria de Massas (LC-MS)

Yamashita e Fenn,
Aleksandrov.

1984

Gall, Krasnov, Dokl, Baram,

Aplicao de Ionizao Eletrospray

a anlise de macromolculas

Pavlenko, Nikolaev,
Sckurov, e Garacher
Karas, Tanaka, Bachmann

1987-

Matriz assistida por Dessoro de

laser

Hillenkamp, Waki, Ido,

1988

MALDI-MS

e Yoshida

Espectrometria de Massas

Ilustrao do processo de anlise de massa e do espectro de massas

de cis- 9, lO-octadecenoamida.
A espcie original tem massa m = 281. A Ionizao adiciona um prton, formando
um on positivo com razo massa/carga m/z = 282, o qual aparece como o pico
principal do espectro. Os outros ons so fragmentos do on original.

Espectrmetro de massas
Um

espectrmetro de massas um
equipamento analtico que determina
a massa molecular de compostos
qumicos, e de seus fragmentos,
separando os ons moleculares de
acordo com suas razes massa-carga
(m/z). Os ons so gerados por
induo seja por ganho ou perda de
carga (e.x., ejeo do eltron,
protonao ou desprotonao).

Fonte
de ons

Analisador
de massas

Fonte
luminosa

Prisma

Detector
de luz

Detector de massas

Figura 1.2 Analogia entre anlise de massa e disperso da luz.

Fonte de ionizao

Introduo da
amostra

Analisador de massa
Detector

Sistema
de dados
(computador)

Figura 1.3 Componentes de um espectrmetro de

massas.

Fontes de on e insero de
amostra

A injetor de amostras a interface

entre a amostra e o espectrmetro de
massas (Figura 1.1). Para se analisar por
espectrometria de massas, uma amostra a
presso atmosfrica deve ser injetada no
instrumento ao qual se encontra sob
vcuo. Uma amostra pode ser injetada de
muitas maneiras, as mais comuns so a
insero direta , ou por infuso atravs de
uma coluna capilar (cromatografia gasosa
ou cromatografia lquida).

Ionizao da amostra

Insero direta

Coluna capilar

LC-MS cromatografia lquida acoplada a

espectrometria de massas

Ionizao de eltrons (EI) foi a primeira

fonte de ionizao para anlises de massa
at 1980, limitando a qumica a molculas
pequenas bem abaixo das massas de
compostos bioorgnicos comuns. Esta
limitao motivou cientistas como John B.
Fenn, Franz Hillenkamp, Michael Karas e
Michael Barber a desenvolver tcnicas
para anlise de biomolculas que so
comumente conhecidas como
bombardeamento de tomos rpidos
(FAB), Ionizao por dessoro a Laser
assistida por matriz (MALDI), e Ionizao
por eletrospray (ESI).

Tabela 1

Mtodos de ionizao para compostos bioinorgnicos

Tcnica de ionizao

Ionizao de
Eltron
Bombardeamento de
tomos rpidos
Desoro a laser
assistida por matriz
Eletrospray

Sigla

Modo de Ionizao

EI

Transferncia de
eltron

FAB

Transferncia de
prton

MALDI

Transferncia de
prton

ESI

Evaporao de
partculas carregadas

Ionizao de eltrons (Electron

Ionization- EI )
Importante na rotina de anlise de
molculas pequenas.
Bases de dados contendo espectro de
massas de mais de 100.000 compostos
so usadas e consultadas por milhares de
qumicos.
Bases de dados possuem algorrtmos que
permitem a rpida comparao com
espectros de massas conhecidos,
facilitando a determinao estrutural de
molculas pequenas.

EI

Tcnica simples.
A amostra deve chegar na forma de gs - um
processo normalmente realizado por dessoro
trmica da amostra da sonda. O alto vcuo do
espectrmetro de massas e o aquecimento,
pode facilitar este processo. Uma vez na fase
gasosa, a substncia passa para uma regio de
ionizao de eltrons (Figura 1,4), onde ele
interage com uma nuvem de eltrons resultando
na ejeo de eltrons e algum grau de
fragmentao.
Aplicabilidade da EI: diminui significativamente
para os compostos acima da massa molecular
de 400 Da.
Dificuldades: exige dessoro trmica da
amostra na fonte, muitas vezes leva ionizao
e decomposio antes da vaporizao. No
volatilizao da amostra de grandes molculas e
da decomposio trmica, e em muitos casos
ocorre fragmentao excessiva.

Vantagens e desvantagens da Ionizao de

eltrons
Vantagens
Sensibilidade elevada
(picomols (1X10-12)

Desvantagens
Limitado a compostos com
Massa molecular baixa devido
baixa volatilizao

Uso das fragmentaes para

comparao com base de
dados de compostos obtendo
informaes estruturais

Possvel decomposio da
amostra por dessoro
trmica.

Uso das fragmentaes para

comparao com base de
dados de compostos

Excesso de fragmentaes
resultando na perda de
informao do on molecular.

Ionizao Qumica (CI)

Tcnica

mais branda em relao a EI

Formao de espcies radicalares a
partir de gases
Obteno de dados do on molecular

Ionizao Qumica
Molculas

da amostra misturadas
com um fluxo de gs reagente
ionizado.
Gases utilizados: metano, amnia,
isobutano e metanol.
Reaes

: Caderno
Grau de fragmentao : observar
Afinidade protnica.

:Ionizao Qumica
afinidade protnica Resultado

(kcal.mol-1)
H2
101
frag. significativa
CH4
132
menos frag. que H2
CH3OH
182
Branda, pequena frag.

Frag. : Fragmentao
Observar espectros do caderno

Bombardeamento de tomos rpidos

(FAB) tcnica de ionizao (Figura 1,5)

normalmente requer o uso de uma
sonda de insero direta para a
introduo da amostra
feixe de alta energia de tomos de Xe,
para chocar-se com a amostra e com a
matriz.
A matriz : um solvente voltil no qual a
amostra dissolvida. A matriz FAB
reabastece constantemente a superfcie
com uma nova amostra, como o feixe
de ons incidente bombardeia essa
superfcie.

A matriz tambm serve para

minimizar os danos amostra do feixe
de partculas de alta energia,
absorvendo a maior parte da energia
facilitando o processo de ionizao.
Matrizes para FAB so lcool mnitrobenzlico e glicerol

lcool meta-nitrobenzlico

glicerol

Parte da Figura 1.5

Feixe de ons csio

Sequncia de aminocidos

Vantagens e desvantagens da ionizao FAB

Vantagens

Desvantagens

Prtico ampla massa de at 20.000 Da.

Queda da sensibilidade com altas

massas

As anlises podem ser executadas

rapidamente.

Resoluo baixa em relao a

MALDI e Eletrosplay

A "ionizao suave". O
on molecular obtido facilmente com
pouca fragmentao.

Pouca fragmentao portanto,

apenas uma quantidade limitada de
informaes podem ser obtidas.

Facilidade de adio de ctions na matriz

levando ao on molecular com ctions
(metais alcalinos adventcios)
(por exemplo: (M+Na)+, (M+K)+ .

Anlise confusa, requer grande

experincia com a tcnica e com os
ons de fundo.

Facilidade de adaptao a
instrumentao de alta resoluo,
permitindo a medio da massa exata.

Requer solubilidade da amostra da

matriz

Impacto com de glicerol, permite

multiplicar ons carregados,mais adequada
para biopolmeros de alta Massa Molecular.

Pouca utilidade para amostras

apolares que no formam cargas

MALDI
Permite a anlise de compostos de alto peso
molecular com alta sensibilidade. um mtodo
que permite a ionizao e a transferncia de uma
amostra de uma fase outra de uma forma similar a
FAB. A principal diferena entre MALDI e FAB
que enquanto a FAB usa uma matriz lquida,
MALDI utiliza uma matriz slida, e o feixe de luz
laser ionizante. A formao de ons em MALDI
realizada por um feixe de laser pulsado em uma
amostra suspensa ou dissolvida em uma matriz,
que absorve a energia e carrega a amostra.
Matrizes: cidos nicotnico, picolnico, e cinmico.

Matrizes para MALDI - (LASER)

O
OH
O

N
N

cido

OH

cido picolnico

nicotnico
O
OH

HO

cido ciano 4- hidroxicinmico

MALDI
A matriz em fase gasosa facilita ionizao das
molculas do analito.
Molculas carregadas so dirigidas por lentes
eletrostticas da fonte de ionizao no analisador de
massa. Molculas neutras muitas vezes reagem com as
molculas de matriz ou de outras molculas produzindo
espcies carregadas, sendo transferidas
eletrostaticamente no analisador de massa.
Anlise: TOF (tempo de vo)
Eficincia do processo permite a anlise de quantidades
relativamente pequenas de amostra (faixa de picomol)
. A anlise de amostras heterogneas torna MALDI muito
bom na anlise de massa de amostras biolgicas.
Amostras que podem ser analisadas por MALDI:
oligonucleotdeos, oligossacardios, polipetdeos (maior
que 30 aminocidos), anticorpos e pequenas protenas
(peptdio com mais de 50 aminocidos).

Feixe de ftons

MALDI Vantagens
Prtico gama de massas de at 300.000 Da.
Espcie de massas muito maiores tm sido
relatados.
Sensibilidade tpica da ordem menor que
femtomol.

Ionizao branda com pouca ou nenhuma

fragmentao observada.
Adequada para a anlise de misturas complexas.

MALDI desvantagens
Baixa resoluo MALDI Alguns
instrumentos so capazes de maior
resoluo, no entanto, esta conseguida
em escala de massa relativamente baixa e
custa de sensibilidade.
Matriz de fundo, que pode ser problema
para os compostos abaixo de uma massa
de 1000 Da.

Possibilidade de fotodegradao por laser.

Ionizao Eletrospray

um mtodo que molculas ionizadas gasosas a partir de

uma soluo lquida. Isto feito atravs da criao de um
fino spray de gotculas altamente carregadas na presena
de um potencial de alta voltagem (4.000 V). So expulsas
pequenas gotculas carregadas. Estas passam por um fluxo
de nitrognio que evapora o solvente. A densidade de
cargas aumentas e estas se dividem em menores
partculas.

 Ionizao

eletrospray propcio para

aumentar a formao de molculas
carregadas. Esta uma caracterstica
importante uma vez que o
espectrmetro de massa mede a
relao massa/carga, tornando
possvel observar molculas muito
grandes com um instrumento com
uma faixa de massa relativamente
pequena.

Eletrospray vantagens

Prtico gama de massas de at 200.000 Da.

Boa sensibilidade at fentomol (1x10-15).

Ionizao mais branda de todas com capacidade de observar

interaes no covalentes de amostras biolgicas.
Facilmente adaptvel a Cromatografia lquida.
Capaz de analisar diretamente eluentes de Cromatografia
Lquida , com uma razo de um mL por minuto.

No h interferncia da matriz.

Mltiplas cargas com preciso melhor de massa atravs da

mdia.

Eletrospray desvantagens
Dificuldade

de limpeza instrumento,
devido alta sensibilidade para
determinados compostos.

Baixa

tolerncia para misturas. A pureza

da amostra importante.

ANALISADORES DE MASSA

 Quadrupolo
Quadrupolos

Analisador

so quatro barras metlicas

precisamente alinhadas sob uma
voltagem direta (DC) e um potencial de
radiofrequncia (RF) (Figura 2.4).
O campo nos quadrupolos determina
quais ons so permitidos a chegar ao
detector.

lon Trap = armadilha de ons

O analisador de massa ion trap foi
desenvolvido na mesma poca do
quadrupolo. A Fsica envolvida em ambos
analisadores so muito similares;
entretando, suas aplicabilidades para
ionizao eletrospray ainda esto sendo
desenvolvidas.

Analyzer Time of-Flight (TOF) Tempo de vo

Analisador TOF um dos mais simples analisadores de
massa e comumente utilizado com a ionizao MALDI. A
anlise por TOF baseada em acelerar um conjunto de ons
para o detetor com a mesma quantidade de energia.
Devido ao fato dos ons terem a mesma energia, embora
com diferentes massas, faz com que os on cheguem ao
detetor em tempos diferentes. O processo anlogo a
jogar uma bola de golfe e uma bola de basquete com a
mesma energia. A bola de golfe chegar primeiro, o
mesmo ocorre com os ons.

 Equaes:

Energia cintica (KE)

igual a mv2 ou velocidade v =
(2KE/m)1/2, ons que viajam a uma
dada distncia, d, com tempo, t,
onde t dependente de sua relao
m/z.

poder de resoluo do TOF

baixo, mas tem a vantagem de no
ter limitao de massa.

Detectores de massa

Detector de massas composto de um contador

que produz uma corrente proporcional ao nmero
de ons que o atingem.
O detector utiliza multiplicadores de eltrons, que
geram uma corrente, esta pode ser medida com
alta preciso. Quando o on bate na superfcie do
multiplicador de eltrons( vidro dopado com Pb e
com revestimento de PbO) dois eltrons so
ejetados. Existe no sistema um potencial de 2kV
que repetindo o processo gera um grande
nmero de eltrons. O sinal do detector
enviado para um registrador, que produz o
espectro de massas.

Tcnicas de anlise
Regra

do treze
Quando no se sabe a massa
molecular.
1 passo gerar uma frmula base
que contenha apena C e H. Para isto
divide-se a massa molecular por 13.
Este clculo fornece um numerador
(n) e um resto (r) .
A frmula torna-se CnHn+r

Tcnicas de anlise
Regra

do treze

O IDH ndice de deficincia de

hidrognio pode ser calculado por:
IDH: (n-r+2)/2
Para compostos que tem outros tomos ,
devemos subtrair a massa correspondente
de tomos de C e H. Por exemplo para a
adio de 1 tomo de O, subtrair 1 C e 4H
da frmula correspondente. Ao IDH
adicionar 1 unidade

Exemplos
Massa

molecular (M.M) 94, 94/13=7

(n) com r=3 o que d frmula C7H10,
para um composto com 1O subrair
CH4 que d C6H6O adiciona-se ao
IDH deste composto 1 unidade: 4
M.M 110, 110/13=8 (n) , r=6 ,
frmula C8H14 IDH=2. Para um
composto com 2O C2H8
Fornecendo composto C6H6O2 com
IDH =4

Mtodos de anlise
M.M 148 : C11H16 (IDH 4) para um O
subtrair CH4 e acrescentar 1O: C10H12O
(IDH 5).
M.M 196 : 196/13=15 (n=15) r=1 :
C15H16 IDH=(15-1+2)/2= 8. Para um
composto com 2 O subtrair C2H8
resultando em C13H8O2 somar 2 ao IDH:
como o n de H insuficiente usa-se o
artifcio de subtrair 1 C e somar 12 H
resultando em C12H20O2 e subtraindo-se 7
do IDH resultando em IDH 3

Mtodos de Anlise
No

caso de IDH der n fracionado

deve-se suspeitar da presena de N.
Exemplo : M.M = 95 95/13 =7 r=4
C7H11 ( 7-4+2)/2= 5/2 (um
composto improvvel) adicionar um
N subtraindo CH2: C6H9N adicionar
ao IDH=3.

IDH
FRMULA

IDH=

GERAL:

n de C - n de H/2 - n de
halognios/2 + (n de N, P ou tomo
trivalente)/2 + 1

Tcnicas de anlise

Regra do nitrognio - Se um composto contm

um nmero par de tomos de nitrognio, o seu
on molecular ter um nmero par de massa. Um
composto com nmero mpar de N aparecer
com um valor de massa mpar.
Neste caso, um composto neutro com um
nmero par de nitrognios ter um nmero par
de hidrognios. Um composto tendo nmero
mpar de nitrognios normalmente ter um
nmero mpar de hidrognios. Mesma regra para
o Fsforo.
Halognios podem ser contados como
hidrognios. Essa regra pode ser til para
determinar a frmula molecular de um composto.
Uma tabela com exemplos mostrada no
prximo Slide.

Regra do Nitrognio
Composto
metano
metilamina
metanol
anilina
tioglicerol
peptdeo
carboidrato
oligonucleotdeo
fosfolipdeo

Frmula

Massa Molecular

Derivatizao
Alterao qumica de uma molcula para
aumentar a volatilidade e estabilidade
trmica, reduzindo as foras
intermoleculares.
uma etapa preparatria para o processo
de dessoro trmica de eltrons de
ionizao, pois d a volatilidade e
estabilidade trmica de molculas,
facilitando a dessoro trmica.
Aumenta o peso molecular e reduz as
foras intermoleculares, convertendo
grupos polares em grupos de menor
polaridade.

Exemplo de derivatizao
Carboidrato
no derivatizado

Carboidrato
acetilado

A reduco das foras intermoleculares, como a ligao hidrognio, acompanhada

pela remoo de tomos de hidrognio ativos. Por exemplo cidos, amidas, ou
polilcools podem se metilados,acetilados ou silanizados.

Interpretao dos espectros de

massa
fragmentos

Intensidade
regio do on molecular

Massa molecular : PM
Composio elementar: alta resoluo
Identificao do on molecular: o on de
menor massa no conjunto de ons mais a
direita do espectro
Fragmentaes lgicas

Fragmentaes lgicas
ons fragmentos na faixa de [M-3] - [M14] e [M-21] - [M-25] no so perdas
lgicas.
Nenhum on fragmento pode conter um
nmero maior de tomos de qualquer
elemento do que o on molecular
Observar a perda de 14 unidades como
perdas de impurezas homlogas
Por exemplo o metilbenzeno e
dimetilbenzeno: massas 92 e 106

Regio dos fragmentos

Mecanismos

de fragmentao
Princpios gerais
A intensidade relativa dos
fragmentos est relacionada a
estabilidade dos ons.
CH3
+

C
H3C

CH2

H3C

CH3

mais estvel (ction tercirio)

Intensidade dos fragmentos no espectro de massas

H2N

CH 2
CH 2

fragmentao

H2N

CH2

H
H

maior n de estruturas

CH2

+ estvel

H2C

Aspectos gerais sobre os

mecanismos de fragmentao

Incio da reao
Promovido no stio radicalar ou de carga
Como localizar os stios
EI Impacto de eltron qual eltron retirado?
CH2

Sigma ()

H3C

CH2

H3C

e-

Pi ()

No- ligante ()

saturada

CH3

H2C

H
HN

C
+

H3C

CH2

e-

ou

C
H3C

CH2

CH2

H
+
HN

2 e-

Facilidade em perder eltrons

No-

ligante
Sigma ()

() > Pi () >

Tipos

principais de
fragmentao
Dissociao - sigma
Clivagem
Clivagem

- alfa

indutiva
Rearranjo de hidrognio

movimento de um eltron

movimento de dois eltrons

Dissociao sigma
.

H3C

+
CH2

eCH3

H3C

+
H2C

CH3

Clivagem alfa
CH2
H3 C
m/z 46

OH

CH3

H2 C

perda de 15 unidades

O
m/z 31

Clivagem indutiva
O

eH3C

CH3
clivagem alfa

H3C

CH3

-CH 3
+

CH 3
m/z 15

clivagem indutiva

-CO

O
C

H3C
m/z 43

Processo de ionizao

Qual o tipo de fragmentao?

RESPOSTA: CLIVAGEM ALFA

Retro- Diels-Alder
Anis insaturados podem sofrer clivagem atrves de reao
Retro-Diels-Alder

A carga pode ficar no dieno ou dienfilo, o mais comum no

dieno

Rearranjos

Quais seriam os fragmentos principais

do paraclorobenzofenona?

Espectro de massas

Fragmentos principais

Istopos

Todo composto puro na realidade

uma mistura de compostos
isotopicamente diferentes

Abundncia relativa dos istopos

de elementos comuns

M + 1 , M+2 ...

contribui com M+2 com

aproximadamente 4,4 % , Si com
3,35 %, Cl com 33% e Br com 98%.

IDH
IDH

= C - ( H + X)/2 + N/2 + 1

Para molculas de Si vale a mesma

frmula, mudando-se C por Si.
N pode ser contado como tomo
trivalente, como P por exemplo

Exerccios IDH
Interpretao

dos resultados

Alta resoluo
Calcular

as massas moleculares
dos compostos : CO, N2 e C2H4

Qual a frmula molecular do composto abaixo?

Tentar chegar a sua estrutura , explicar fragmento.

Determinar estrutura do composto

com espectro de massa abaixo :

Qual a frmula molecular do composto abaixo?

Tentar chegar a sua estrutura , explicar fragmento.

3.1

Fragmentos comuns

Fragmentos comuns

Fragmentos comuns

Fragmentaes classes de compostos

Hidrocarbonetos
Tendncia

a sofrer rearranjos ao
acaso principalmente envolvendo
Hs.
Principal sigma () fragmentos:
m/z 15, 29 , 43. , 57.....
.
.

H3C

e.

C+ C
.

C+
.

CH3

 Forma

Ramificaes

radical ou carboction mais

estvel
CH3
CH3
H3C

HC Insaturaes
Fragmentao no permite localizar
a dupla ligao ons 27 41, 55,
69... para dupla e
15 , 29, 43 , 57 para parte saturada