Project TA DNA 2014

Handojo, dkk

IDENTIFIKASI BAKTERI PENDEGRADASI 2,4

DICHLOROPHENOXYACETIC ACID
Jeanny Dwijayanti Handojo (7121016), Agnesia Christiena (7121029), Albastomi Eridian Putra (7121040), Nur
Sadrina Jayanti (7121047),
jeannydwijayanti.handojo@gmail.com
Abtrak
Senyawa 2,4 Diklorofenoksiasetat (2,4-D) banyak digunakan sebagai pestisida dalam bidang pertanian.
Senyawa kimia ini menimbulkan kontaminasi dalam lingkungan. Kemampuan mikroorganisme untuk
mendegradasi suatu senyawa sangat dipengaruhi toksisitasnya. Bioremediasi menjadi salah satu cara
penetralan maupun membersihkan lingkungan tercemar. Bioremediasi ini menggunakan bakteri indiganous
bakteria yang merupakan bakteri asli penghuni tanah terkontaminasi. Karena itu perlunya mempelajari
biodegradasi 2,4-D menggunakan teknik PCR-RFLP untuk mendeteksi jenis bakteri. Hasil identifikasi
berdasarkan metode yang analisa terdapat homologi antara isolat jenis bakteri yaitu Alkaligenes eutrophus
JMP134 dan Burkholderia sp. RASC .
Kata kunci: degradasi; 2,4-D; bioremediasi; PCR-RFLP.

1.

Pendahuluan
Dewasa ini penggunaan bahan-bahan kimia dianggap sebagai hal umum di masyarakat.
Termasuk penggunaan pestisida pada bidang pertanian. Namun penggunaan pestisida ini menjadi
masalah besar karena menimbulkan kontaminasi (polusi) senyawa-senyawa kimia beracun dalam
lingkungan. Senyawa kimia berupa limbah/polutan. Untuk itu perlu dilakukan penanganan yang
serius agar senyawa-senyawa kimia ini tidak menimbulkan gangguan pada ekosistem.
Bioremediasi merupakan proses penggunaan mikroorganisme untuk menetralkan atau
membersihkan lingkungan tercemar dari limbah. Bioremediasi tergolong aman bagi lingkungan
karena menggunakan agen-agen alamiah (seperti mikroba) yang hidup ditanah. Dalam dekade
terakhir, bioremediasi memegang peranan penting dalam mengatasi permasalahan lingkungan
karena diketahui lebih efektif dari segi pembiayaan dibandingkan penerapan teknologi lainnya.
Bioremediasi yang akan dibahas pada makalah ini ialah bioremediasi limbah pestisida berjenis
asam 2,4-Diklorofenoksiasetat. Asam 2,4-Diklorofenoksiasetik (2,4-D) adalah salah satu jenis
herbisida dan regulator sekunder pertumbuhan sebuah tanaman. Herbisida ini sangat banyak
digunakan sekarang ini. Dengan menggunakan indiganous bakteria yaitu bakteri asli penghuni
tanah terkontaminasi, maka dapat dilakukan bioremediasi. Namun tidak semua indiganous
bakteria dapat mendegradasi herbisida ini karena toksisitasnya. Adapun sejumlah bakteri yang
memiliki kemampuan untuk menetralkan 2,4-D meliputi Alcaligenes, Arthrobacter,
Flavobacterium, Pseudomonas dan Sphingomonas (Loos et al,1967.; Don & Pemberton, 1981;
Chaudrhry & Huang, 1988; Bhat et al, 1994.; Ka et al., 1994a ).
Melalui makalah ini penulis ingin mempelajari biodegradasi 2,4-D menggunakan teknik
molekuler berbasis PCR (polymerase chain reaction) dan teknik DNA fingerprinting RFLP
(restriction fragment length polymorphism) untuk mendeteksi jenis-jenis bakteri pendegradasi
2,4-D. Pemilihan RFLP didasrkan pada fakta bahwa pelaksanaannya cukup praktis dan
memberikan data yang informatif tentang keanekaragaman gen-gen (bakteri) pendegradasi 2,4-D.

2.

Metode

Dalam analisis bakteri pendegradasi 2,4-D, adapun tahapan untuk mendeteksi jenis-jenis
bakteri ialah menggunakan metode PCR dan RFLP. Proses meliputi:
2.1 Persiapan Sampel Tanah
Tanah yang digunakan sebagai sampel uji untuk isolasi bakteria pendegradasi herbisida jenis
2,4-D ini adalah tanah sawah, dimana tanah ini diduga mengandung herbisida jenis 2,4-D akibat
adanya aktivitas pertanian. Tanah yang diambil ialah hanya bagian lapis atas atau bagian O layer
saja, dengan rentang kira-kira 0-20 cm dari permukaan tanah. Sampel tanah yang diambil ialah
dari 8 tempat berbeda (sawah).

Fakultas Teknobiologi / Universitas Surabaya

Halaman

Project TA DNA 2014

Handojo, dkk

2.2 Isolasi Bakteri Pendegradasi 2,4 D

Tanah yang diambil terdapat organisme. Langkah awal ialah melakukan pengkayaan sampel
tanah dan inkubasi. Setelah inkubasi, dilanjutkan proses isolasi bakteri pada 2,4-D minimal media
agar. Di inkubasi pada 20oC selama beberapa hari.
2.2 Metode Molekular
a) PCR (polymerase chain reaction)
Isolasi DNA dilakukan dengan mengekstraksi DNA. Proses awalnya ialah pelisisan sel
sehingga DNA didalam sel dapat terekspos keluar sel. Lalu proses purifikasi yang dilakukan
dengan penambahan proteinase K yang mendegradasi protein yang terlepas dari sel. DNA
yang telah terekstraksi digunakan sebagai template untuk proses amplifikasi PCR. Tahapannya
yaitu denaturasi yaitu untai DNA dipanaskan pada suhu 92-95 oC, lalu annealing dimana terjadi
penempelan primer dan tahap extension dimana terjadi sintesis untai baru DNA. TAE buffer
(40 mM Tris-HCl, 4 mM sodium acetate, 1 mM EDTA, pH 7.9) ditambahkan dan terjadi
sintesis untai yang dikatalisa oleh Ex-Taq Polymerase. Proses extention dimulai dengan
penambahan dNTP pada ujung 3 primer yang telah menempel pada DNA template.
Tabel 1. Primer PCR yang digunakan dalam study ini.

Primer

Primer sequence (5 3)

tfdA-1

AACGCAGCGRTTRTCCA
ACGGAGTTCTGYGAYAT
G
ATAGCGCTGRTTCATYT
C
CGCAYATCACAAAYCAR
C

tfdA-2
tfdB-1
tfdB-2

Target

Ukuran
(bp)
produk
dari C.
necator
JMP 134

Suhu
Annealing
(oC) untuk
PCR

Referensi
untuk
primer

tfdA

363

59

Vallaeys,dk
k. 1999

tfdB

1172

54

Vallaeys,dk
k. 1999

b) RFLP (restriction fragment length polymorphism)

Total DNA dari strain, yang mana mempunyai kesamaan yang tinggi pada gen
homolog pendegradasi 2,4D dengan Burkholderia cepacia strain RASC 45, 48, 51
diperpendek dengan enzim restriksi EcoRI dan HindIII berdasarkan instruksi manufacturer.
Potongan kecil DNA dielektroforesis pada 0.7% gel agarose. Southern hybridization
selanjutnya akan dilakukan seperti pada umumnya, kecuali bahwa membran hibridisasi dicuci
dua kali di 2 x SSC, 0.1% SDS dan dua kali di 0.1-0.2 x SSC, 0.1% SDS . Probe untuk
hibridisasi ini (probe tfdC RASC) telah disiapkan seperti yang telah dideskripsikan diatas dari
tipe RASC tfdC produk PCR DARI STRAIN Y212.

3.

Hasil dan Pembahasan

Pola RsaI , masing-masing (Tabel 1 ) .Mayoritas pola yang diamati hanya dalam satu agregat
(pola 4, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16 dan 17) dan memiliki rendahnya jumlah perwakilan sementara
yang lain yang diamati antara isolat dari tiga agregat (pola 1 , 2 , 5 dan 7). Individu 2,4-D isolat
merendahkan diperiksa untuk degradasi rantai samping dan cincin 1 C-berlabel 2,4-D setelah
penyimpanan pada minimal 2,4- D lereng agar. Meskipun 2,4-D digunakan sebagai sumber
karbon selama semua budidaya dan pemurnian langkah, isolat disajikan berbagai intensitas
kegiatan degradatif rantai samping. Sebuah ketidakstabilan kemampuan degradasi 2,4- D diamati
sebagai sekitar 25 % dari subkultur yang diuji disajikan kurang lengkap degradasi rantai samping
berlabel 2,4- D . Sebagian besar dari strain ( tambahan 25 % ) menunjukkan signal. Lack positif
kurang lebih lemah dari aktivitas merendahkan rantai samping dan degradasi miskin dapat

Fakultas Teknobiologi / Universitas Surabaya

Halaman

Project TA DNA 2014

Handojo, dkk

berkorelasi dengan kurangnya pertumbuhan atau pertumbuhan yang buruk pada 2,4- D medium
minimal cair digunakan dalam penelitian ini (hasil tidak ditunjukkan) ,menunjukkan bahwa strain
ini tidak dapat menggunakan 2,4-D sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi dan bukan
menggunakan karbon jejak agar sebagai substrat dan co - metabolisme 2,4- D . Selain itu, sekitar
6 % dari isolat disajikan cincin 14C berlabel 2,4- D mineralizing signifikan analisis activity.
PCR-RFLP dari tfdA dan gen tfdB seperti dilakukan . Sebuah produk PCR dapat diperkuat dari
dua strain menggunakan kedua tfdA dan tfdB primer set dan enam strain menghasilkan produk
PCR menggunakan primer tfdB ditetapkan tetapi tidak tfdA primer set . Diperoleh pola satu tfdA
dan dua tfdB PCR-RFLP yang berbeda, masing-masing. Strain yang menghasilkan produk PCR
menggunakan kedua tfdA dan tfdB primer set menunjukkan pola PCR - RFLP identik untuk
kedua gen. Pola-pola ini berhubungan dengan yang dijelaskan sebelumnya untuk tfdA
dan gen tfdB di Alkaligenes eutrophus JMP134 dan Burkholderia sp. RASC, masing-masing.
Namun, isolat disajikan secara berbeda di 16S PCR - RFLP patterns ( nomor 4 dan 7 yang juga
berbeda dari A. eutrophus JMP134 dan yang Burkholderia sp.RASC ) menunjukkan bahwa
mereka milik spesies bakteri yang berbeda ( Tabel 1 , Gambar . 1).

Gambar 1. keragaman pola 16S PCR-RFLP oleh Rsa1 (p1-p7) yang diperoleh dari 2,4-D merendahkan strain
diisolasi dari dua agregat tanah yang berbeda (c4 dan h9). Panah menunjukkan pola strain yang menghasilkan
produk PCR menggunakan tfdA dan / atau tfdB primer set. Jalur pertama dan terakhir mengandung Boehringer
VIII penanda massa molekul. Ukuran fragmen tangga ditunjukkan di bp di sisi kiri gel.

Sebagai strain diisolasi dari agregat tanah yang berbeda, hasil ini tidak bisa menjadi
konsekuensi dari peristiwa transfer gen selama langkah pengayaan dan refects distribusi alami
merendahkan kemampuan antara mikroorganisme tanah sebelum aplikasi 2,4- D . Sebaliknya,
strain terisolasi dari agregat tanah yang sama ( h9 ) dan menyajikan pola identik 16S PCR - RFLP
( nomor 7 ), tetapi di tfdB pola PCR - RFLP juga diamati (Gambar 1 , Gambar . 2 ) yang tidak
termasuk asal klonal penambahan isolates. Kami menemukan bahwa strain yang amplifed
menggunakan primer tfdB ditetapkan hanya disajikan dua jenis pola tfdB PCR - RFLP . TfdB
jenis pola mereka dalam banyak kasus identik dengan yang dijelaskan untuk Burkholderia sp .
ASC. Namun, satu isolat menunjukkan pola tfdB PCR-RFLP yang muncul berbeda dari semua
pola PCR-RFLP gen tfdB seperti dijelaskan sebelumnya. Dalam hal ini, amplikon PCR fragmen
adalah ukuran yang benar dan berbagi band umum dengan tfdB pola PCR - RFLP telah dijelaskan
sebelumnya oleh kami , sehingga menunjukkan adanya hubungan evolusi antara fragmen ini dan
kelompok genes. Empat tfdB seperti strain sehingga dapat dibedakan menurut perilaku
merendahkan mereka dan hasil analisis PCR-RFLP gen tfd seperti mereka. Kelompok pertama
berhubungan dengan tidak stabil 2,4-D merendahkan isolat di mana kehadiran tfd seperti gen
menggunakan tfdA dan tfdB primer set tidak dapat dideteksi .Strain ini menunjukkan sinyal
degradasi rantai samping lemah segera setelah pemurnian dan kurangnya baik rantai samping dan
degradasi cincin setelah penyimpanan dan langkah-langkah subkultur . Mereka milik berbagai

Fakultas Teknobiologi / Universitas Surabaya

Halaman

Project TA DNA 2014

Handojo, dkk

kelompok filogenetik karena mereka disajikan tiga di 16S pola PCR - RFLP ( pola 2 , 12 dan 16).
Di antara degraders stabil ( strain yang mempertahankan aktivitas merendahkan rantai samping
setelah penyimpanan dan langkah-langkah subkultur ) , kelompok pertama dari dua isolat
menghasilkan produk PCR menggunakan kedua tfdA dan tfdB primer set dan tampaknya
membawa gen degradatif dentical . Namun, mereka milik kelompok bakteri sesuai dengan hasil
analisis PCR-RFLP mereka gen 16S rRNA ( pola 4 dan 7 ) . Kelompok kedua disajikan kegiatan
rantai merendahkan sisi stabil tetapi tidak teramplifikasi mampu gen tfdA . Gen tfdB dari strain
ini bisa, bagaimanapun , terdeteksi oleh PCR. 16S PCR-RFLP analisis menunjukkan bahwa
mereka semua milik kelompok filogenetik yang sama ( pola 7 ) . Sebuah kelompok terakhir
degraders stabil menunjukkan baik amplicable tfdA dan tfdB gen non. Ini termasuk strain dari 12
kelompok bakteri yang berbeda sebagai akibat dari analisis pembatasan mereka gen 16S rRNA
dengan enzim RsaI ( pola 1 , 3 , 5 , 6 , 8 , 9 , 10 ,11 , 13 ,14 , 15 , dan 17)

4.

Kesimpulan
Berdasarkan metode molekuler yang diterapkan untuk mendeteksi bakteri-bakteri yang
mampu mendegradasi 2,4-D maka penulis telah berhasil mengidentifikasi bakteri pada tanah
dipersawahan yang tercemar. Adapun metode yang digunakan ialah PCR-RFLP. Melalui teknik
molekular tersebut, jenis bakteri yang teridentifikasi kemungkinan adalah strain baru.
Dalam penggunaan teknik PCR-RFLP memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya
antara lain:nilai polimorfisme tinggi, jumlah loci tinggi, menghasilkan hasil yang konstan pada
waktu dan lokasi, sedangkan kekurangannya adalah:lambat dan mahal, DNA harus berkualitas
tinggi dan berjumlah besar, sering harus menggunakan radioaktivitas, disain probe membutuhkan
informasi soal sekuen, sebuah probe yang pendek mungkin menghasilakan terlalu banyak
polimorfisme.

5.

Daftar Pustaka
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]

Vallaeys, T.,dkk. (1997). PCR-RFLP analysis of 16S rRNA tfdA dan tfdB genes reveals
and diversity of 2,4-D degraders in soil aggregates,CMSE-INRA Laboratoire de Microbiologie des
SolsB V. 1540,21034 Dijon Cadex France.
Gonod,Laure Vieuble,dkk.(2006). 2,4-D impact on bacterial communities,and the activity and
genetic potential of 2,4-D degrading communities in soil. France: INAPG-INRA, Batiment EGER.
Sakai, Yoriko.,dkk. (2007). 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-degrading Genes from
Bacteria Isolated from Soil in Japan: Spread of Burkholderia cepacia RASC-typeDegrading Genes
Harbored on Large Plasmids. Japan: National Institute for Agro-Environmental Sciences.
Jensen, H.L. and Petersen, H.I. (1952) Detoxication of hormone herbicides by soil
bacteria. Nature 170.
National
Pesticide
Information
Center.
2,4-D
Technical
Fact
Sheet.
http://npic.orst.edu/factsheets/2,4-DTech.pdf, diakses terakhir tanggal 23 Mei 2014.
Evan, W.C., Smith, B.S.W., Fernley, H.N. and Davies, J.I. (1971) Bacterial metabolism of
2,4-dichlorphenoxyacetate. Bi-ochem. J., 122, 543-551
US National Library of Medicine National Institutes of Health. Advantage of Using
Inosine at the 3 Termini of 16S rRNA Gene Universal Primers for the Study of Microbial Diversity.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1636166/, diakses terakhir tanggal 26 Mei 2014.

Fakultas Teknobiologi / Universitas Surabaya

Halaman

Project TA DNA 2014

Handojo, dkk

(Tabel. 1)Distribusi pola 16S PCR-RFLP dengan pembatasan RsaI enzim antara isolat dari tiga agregat dari
tanah pertanian dari Citeaux (Prancis) Area

(*, n) menunjukkan jumlah n isolat menyajikan baik tfdA terdeteksi dan gen tfdB seperti dengan PCR. (+, n)
menunjukkan jumlah isolat menyajikan gen tfdB seperti terdeteksi oleh PCR .
Gambar 2.

Gambar. 2 PCR-RFLP analisis oleh HaeIII dari tfdA (A) dan tdfB seperti (B) gen dari tiga strain diisolasi dari
tanah Citeaux. Isolat 1 dan 2 memberikan sinyal amplifikasi dengan baik dan tfdA, tfdB primer set. Isolat 3
menghasilkan produk PCR menggunakan tfdB primer hanya menetapkan. Jalur berlabel pJP4 berisi sampel
kontrol (Analisis RFLP dari A. eutrophus JMP134 (pJP4) PCR fragmen). Jalur kanan di A dan B mengandung
Boehr inger VIII penanda massa molekul.

Fakultas Teknobiologi / Universitas Surabaya

Halaman