Anda di halaman 1dari 13

Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg Terhadap Aktivitas

Hyalurodidase Streptococcus agalactie

Oleh:
Wendry Setiyadi Putranto

FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2006

Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg Terhadap Aktivitas


Hyalurodidase Streptococcus agalactie

Oleh :

Wendry Setiyadi Putranto, SPt.,MSi

Mengetahui:
Kepala Laboratorium
Teknologi Pengolahan Produk Peternakan
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran

Dr. Ir.Kusmajadi Suradi,MS.


NIP. 130780570

I. PENDAHULUAN

1.1.

Latar Belakang
Hyaluronidase merupakan enzim ekstraselluler yang menghidrolisa asam

hyaluronat, yaitu semen jaringan yang merekatkan sel-sel hidup menjadi satu.
Hyaluronidase dihasilkan oleh kebanyakan streptokokus,dan merupakan faktor
virulensi bakteri tersebut untuk melakukan invasi. Streptokokus Grup B (SGB)
atau Streptococcus agalactie telah diketahui sebagai patogen penting pada
manusia, antara lain menyebabkan abortus, ketuban pecah sebelum waktu
(KPSW), bayi berat lahir rendah (BBLR),dan infeksi neonatal (pneumonia,
septikemia,dan meningitis.
Asam hyaluronat merupakan glycosaminoglycan yang penting untuk
merekatkan sel hidup menjadi satu. Asam tersebut tersusun atas 250 25.000
rantai

(1-4) yang tersusun atas D glucoronic dengan N- acetyl- D-

glukosamine. Karakter ionik dari asam hyaluronat adalah dapat mengikat kuat
beberapa kation seperti K+, Na+, dan Ca2+. Menggunakan X-ray dapat terlihat
struktur Ca2+ hyaluronat yang merupakan kumparan tunggal terdiri dari tiga
disakarida

tiap

satu

putarannya.

Asam

hyaluronat

dan

beberapa

glycosaminoglycan yang lain (chondroitin 4- sulfate, chondroitin 6 sulfate,


drenatan sulfate, keratan sulfate, dan heparin) dapat dipotong oleh enzim
hyaluronidase pada rantai (1-4).
Hyaluronidase merupakan enzim yang mampu menghidrolisa asam
hyaluronat

menghasilkan 2-acetamido-2-deoxy-3-0- ( - D gluco 4

enepyranosyluronic acid) D glucose. Enzim tersebut diaktifkan oleh beberapa


kofaktor logam, sehingga peneliti merasa tertarik untuk mengkaji pengaruh
kofaktor Kalsium dan Magnesim terhadap aktivitasnya.

1.2.

Tujuan Penelitian
Penelitian

ini

bertujuan

melakukan

pemurnian

dan

karakterisasi biokimia dari hyaluronidase yang dihasilkan oleh

mempelajari
Streptokokus

Grup B (SGB) yaitu tentang pengaruh kofaktor Kalsium dan Magnesium.

1.3.

Waktu dan Tempat Penelitian


Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan

Biomedis PAU Bioteknologi IPB, Laboratorium Immunologi dan Produksi Bahan


Hayati, FKH IPB, dan Laboratorium Terpadu FKH IPB.

II. BAHAN DAN METODA

3.1.

Test Agar Hyaluronidase (Christ,1989)


Uji

ini

bertujuan

untuk

menentukan

isolat

yang

menghasilkan

hyaluronidase. Media tumbuh adalah terdiri dari 100 ml BHI ditambahkan 1 g


Nobel Agar, kemudian disteril dengan autoklaf. Selanjutnya ditambahkan 50 mg
asam hyaluronat dalam 25 ml akuades dan 1,25 g BSA, dituangkan dalam cawan.
Inkubasi selama 24 jam, 37 oC. Selanjutnya SGB diinokulasikan dalam media
tersebut dan diinkubasi selama 24 jam suhu 37 oC. Empat isolat SGB yang
digunakan

merupakan koleksi dari Ibu dr.Zainatul Hayati,M.Kes.,Sp.MK.,

kemudian dilakukan penggenangan dengan asetat 2 M sebanyak 5 ml dan terlihat


zona bening disekitar koloni SGB (zona bening mengindikasikan isolat SGB
tersebut mengekskresikan hyaluronidase).

3.2.

Isolasi Hyaluronidase pada Supernatan


Setelah diperoleh isolat SGB yang menghasilkan hyaluronidase maka

bakteri ditumbuhkan pada 50 ml THB , diinkubasi pada suhu 37 oC, selama


kurang lebih 5 jam (nilai absorbansi 0,8 pada 650 nm).

Selanjutnya

diinokulasikan kembali dalam 500 ml THB (mengandung 0,2% asam hyaluronat),


dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC. Untuk mengamati pertumbuhan
Streptokokus Grup B, dilakukan pengamatan dengan melihat nilai optical density
( 650 nm) selama masa inkubasi. Dilakukan pengujian pula terhadap aktivitas

hyaluronidase dan kadar protein (Bradford 1976), sehingga berdasarkan data


tersebut dapat kita tentukan waktu produksi hyaluronidase dari SGB, sebagai
patokan untuk produksi selanjutnya.
Hyaluronidase diperoleh dengan memisahkan enzim dengan sel bakteri
SGB tersebut menggunakan sentrifugasi 4000 rpm, selama 15 menit , suhu 4 oC.
Supernatan merupakan enzim kasar hyaluronidase.

Selanjutnya dilakukan

pengujian aktivitas hyaluronidase dan penentuan kadar protein enzim (Bradford,


1976).

3.3.

Pengendapan dengan Amonium Sulfat


Pengendapan protein dengan amonium sulfat dilakukan dengan metoda

Scope (1982). Sebanyak 10 ml supernatan enzim ditambahkan amonium sulfat


dengan berbagai kadar berdasarkan kejenuhan (40%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%)
untuk mendapatkan kadar amonium sulfat yang optimum. Penambahan amonium
sulfat dilakukan sedikit demi sedikit dengan magnetic stirer pada suhu dingin.
Setelah semua amonium sulfat larut, didiamkan semalam pada suhu 4 oC.
Endapan yang terbentuk dipisahkan dari supernatan dengan sentrifius 4000 rpm,
15 menit, 4 oC. Endapan ditambahkan bufer pospat pH 6,4 satu kali volume.
Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas hyaluronidase dan kadar proteinnya.
Pengandapan amonium sulfat yang menghasilkan aktivitas tertinggi pada endapan
dan aktivitas yang rendah pada supernatan digunakan sebagai patokan untuk
pengendapan selanjutnya.

3.4.

Pengukuran Konsentrasi Protein (Bradford, 1976)


Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine

Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Setiap 100 l
konsentrasi BSA ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi
Bradford dan diinkubasi selama 5 menit, suhu 37

C, kemudian diukur

absorbansinya pada 595 nm. Sehingga didapat kurva standar yang merupakan
persamaan garis regresi ( y = ax + b, dengan nilai r mendekati satu ) antara nilai
absorbansi sebagai ordinat dan konsentrasi protein BSA sebagai absis.
Dengan metoda yang sama untuk sampel hyaluronidase, yaitu sebanyak
100 l hyaluronidase ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford dan diinkubasi 37 oC, 5
menit, dan dilihat nilai absorbansinya pada 595 nm.

Selanjutnya

untuk

mendapatkan kadar protein hyaluronidase tersebut, dengan memasukkan nilai


absorbansi tersebut ke dalam persamaan daris yang telah dibuat.

3.5.

Pengukuran Aktivitas Hyaluronidase (Bergmeyer, 1987)


Aktivitas hyaluronidase diukur berdasarkan jumlah 2-acetamido-2-deoxy-

3-0- ( - D gluco 4 enepyranosyluronic acid) D glucose dari asam


hyaluronat.
Bahan yang diperlukan:
1. Bufer phospat (67 mmol/liter, pH 6,4), pembuatannya dengan melarutkan
66 ml Na2HPO4 2H2O (11,876 g/liter) dengan KH2PO4 (9,078g/liter)
dalam volume 250 ml.

2. Sodium Chloride (0,15 mol/liter) dengan melarutkan 0,877 g NaCl dengan


100 ml air.
3. Perhloric acid (20%w/v) dengan melarutkan 13 ml HclO4 (70% w/v)
dengan 75 ml air.
4. Hyaluronate lyase standar ( 1 mg protein/ml; 100 U/litter) 7 mg enzim
dalam 7 ml larutan NaCl.
5. Asam hyaluronate 200 mg dalam 1000 ml bufer posat.
Tabel.1.
Larutan

Prosedur pengujian aktivitas hyaluronidase (Bergmeyer,1987)


Sampel
Standar
Konsentrasi

Buffer phospat

1ml

1,5 ml

37 mmol/liter

Asam hyaluronat

0,5 ml

0,5 ml

27,8 mg/liter

Larutan NaCL

0,5 ml

1 ml

45,8 mmol/liter

0,1 ml

3 U/liter

Inkubasi pada 70 oC, selama 10 menit


Hyaluronidase

0,1 ml

Inkubasi pada 37 oC, selama 6 jam


Perkhlorit acid

0,5 ml

0,5 ml

Sentrifugasi 5000 g, selama 20 menit, selanjutnya dilihat absorbansinya pada


232 nm. Absorbansi sampel (A1) dan absorbansi standar (A2)
Aktivitas (U/ml) = A1 / A2 x 0,003 U/ml
3.6.

Pengaruh Kation Ca 2+ dan Mg2+


Pengaruh kation Ca2+(CaCl2) dan Mg2+(MgCl2) masing-masing 1 dan 5

mM dalam campuran raksi, selanjutnya diukur pada pH dan suhu optimum.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.

Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg


Merupakan salah satu sifat khas dari enzim yaitu membutuhkan tambahan

komponen kimia untuk aktivitasnya. Senyawa tersebut disebut kofaktor


(merupakan senyawa anorganik) atau koenzim
organik).

(merupakan suatu molekul

Dalam penelitian ini digunakan dua kofaktor logam (Ca2+ dan

Mg2+).Ion kalsium terletak dipermukaan enzim dan memiliki fungsi untuk


mempertahankan kestabilan panas enzim (Dahiquist,et al. 1976). Berdasarkan
data yang diperoleh menunjukkan bahwa hyaluronidase diaktifkan oleh kofaktor

Aktivitas hyaluronidase (U/ml)

Ca2+ dan Mg2+.

0.14
0.1162

0.12
0.1
0.08

0.1002
0.0782

0.06
0.04
0.02

0.0075

0.008

0.012

0
0

Konsentrasi Ca (m M)
Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)
Aktivitas hyaluronidase hasil pengendapan amoinum sulfat 45% (U/ml)

Gambar 1. Pengaruh kofaktor Ca2+ terhadap aktivitas hyaluronidase

Aktivitas hyaluronidase (U/ml)

0.14

0.122

0.12
0.1

0.086

0.0782

0.08
0.06
0.04
0.02

0.009

0.0075

0.013

Konsentrasi Mg (m M)
Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)
Aktivitas hyaluronidase hasil pengendapan amoinum sulfat 45%
(U/ml)

Gambar.2. Pengaruh kofaktor Mg2+ terhadap aktivitas hyaluronidase

10

IV. KESIMPULAN

Hyaluronidase dari Streptokokus Grup B (SGB)

merupakan enzim

ekstraseluler diaktifkan oleh kofaktor logam (Ca2+ dan Mg2+). Berdasarkan hasil
karakterisasi dapat memberikan informasi untuk penelitian lebih jauh dalam
bidang kesehatan.

DAFTAR PUSTAKA

Bradford,MM.1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram


quantitaties of protein in utilizing the principle of protein-dye
binding.Anal.Biochem.72:248-254.
Bergmeyer,H.U.1987.Method of Enzymatic Analysis. VCH.Vol.IV:45-49.
Christ.D.1989,Untersuchungen an Streptococcus uberis unter besonder
Berucksichtigung mutmaBlicher pathogenitatsfatoren. Aus der professur fur
Bakteriologie und immunologie der Justus-Universitat GiBen.33-34.
Dahlquist FW,Long JW, Bigbec WL.1976. Role of Calcium in The Thermal
Stability of Thermolysin.Biochemistry 15:1103-1111.
Hynes.W.L.,Dixon.A.R, Walton S.R. Aridgides.L.J .2000.The Extracellular
hyaluronidase gene (hyl A) of Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiology
Letter 184.109-112.
Scopes RK.1987. Protein Purification Principles and Practice. Edisi ke-2. New
York: SpringerVerlag.

13

Anda mungkin juga menyukai