Anda di halaman 1dari 23

RISA INDRIANI, R.

M ABDUL
ADJID, DARMINTO, dan
HELMY HAMID
Balai Penelitian Veteriner, PO
BOX 151, Bogor 16114,
Indonesia
Pengembangan Teknik

Enzyme Linked
Immunosorbent Assay untuk
Mendeteksi adanya Antibodi Terhadap
Virus Infectious Laryngotrachitis dalam
Serum Ayam

ANGGOTA KELOMPOK
UUM UMAYAH (H1A012005)
HERLINA (H1A012009)
RITA YULIYATI (H1A012012)
HIKMAH TUSSIAMI (H1A012014)
AGUSTINUS RIO KELVIN (H1A012018)
THIKA CAHYATI (H1A012024)
AGUS SHOLEH (H1A012028)
FILLIANI AKANA DEWI (H1A012038)
EMAH DIANA (H1A012049)
DIAN NOVIYANTI (H1A012051)

PENDAHULUAN

Infetious
Laryngotrachitis
(ILT)

Perangkat uji
ELISA dalam
negeri

Gallid herpes
virus

Kit ELISA
komersial ILT

Karakterisasi
virus

ELISA

PERSIAPAN ANTIGEN ELISA


ILT
Virus ILT

Ditumbuhkan pada biakan sel hati embrio ayam spesific


phatogenic free (SPF) dalam labu plastik 175 cm3
Cell Liver (CELi)
Diinkubasi pada 37oC selama 48-72 jam
Bila terlihat cytophatogenic effect, dibeku cairkan 2 kali

Supernatan dari biakan


sel

Disentrifuse 5000rpm selama 30 menit


Supernatan

Disentrifuse 50000 rpm pada 4oC selama 120 menit


Pelet

Ditambahkan larutan Tris buffer pH 7.4


Disimpan pada -30oC
Kontrol antigen dibuat dari biakan jaringan CELi yang
tak terinfeki virus dengan perlakuan yang sama
Antigen ELISA ditetapkan kandungannya dengan
metode Lowry

Antigen ELISA

PEMBUATAN SERUM
STANDAR ILT

Serum standar negatif diperoleh dari 8 ekor ayam SPF


berumur 6 minggu
Serum standar ILT dibuat pada 8 ekor ayam SPF berumur 6
minggu yang divaksin dengan vaksin komersil

Virus vaksin ILT komersil


Dibiakkkan pada jaringan CELi
Disentrifuse 50000 rpm pada 4oC selama
120 menit

Pelet
Dimasukkan pada sukrosa gradient dengan konsentrsi
30% dan 50%
Disentrifuse 50000 rpm pada 4oC selama 120 menit

Lapisan awal antigen


Dicampur dengan Freunds Complete Adjuvant
dengan perbandingan 1:1

Vaksin ILT

PEMBUATAN SERUM
STANDAR ILT
Ayam
Diberikan vaksinasi pertaa dengan
dosis 2.4 TCID50
Setelah 3 minggu diinfeksi dengan
vaksin ILT komersial

Darah Ayam
Diambil pada minggu ke-2 dan
ke-3
Dipisahkan serumnya dan
dikumpulkan

Standar positif serum terhadap


virus ILT

PROSEDUR ELISA
Lempeng mikrotiter dari
polystirene
Tiap lubang diidi dengan 50 L antigen
Diinkubasi pada 37oC selama 60 menit
Dicuci 3 kali dengan PBS pH 7,2 mengandung 0,05%
tween 20
Ditambahkan serum ayam yang telah diencerkan (50 L
dalam TEN dan 5% kasein dengan perbandingan 1:1000)
dalam lempeng mikrotiter
Diinkubasi pada suhu kamar selama 60 menit
Dicuci dengan PBST 3 kali
Ditambah 100 L substrat ABTS
Dibiarkan pada suhu kamar selama 60 menit

Intensitas warna

Diukur dengan alat


pembaca ELISA pada490
nm

Hasil

PENENTUAN ENCERAN OPTIMAL DARI ANTIGEN,


SERUM, DAN KONJUGAT

Stok antigen
(mengandun
g 1295
g/mL)

Serum
standar ILT
dan serum
negatif SPF

Dilarutkan dalam buffer


kabonat-bikarbonat pH 9.6
menjadi konsentrasi
10;5;2.5; dan 1.25 g/mL

Diencerkan
dalm TENC
1:100 dan
1:200

Konjugat
Diencerkan dalam
TENC 1:200 ,
1:5000 , dan
1:10000

Reaksi ulang dilakukan sebanyak


12 kali
Ditentukan rasio positif/negatif
(P/N)
Enceran

untuk
prosedur
ELISA

PENENTUAN NILAI CUT-OFF UNTUK ELISA

140 serum ayam SPF


Diperiksa dengan uji serum
netralisasi (SN)
Nilai rata-rata densitas optik (OD)
ditambah 3 kali nilai stadar deviasi

Nilai Cut-Off uji ELISA

EVALUASI ADANYA REAKSI SILANG DENGAN


INFEKSI FIRUS PERNAFASAN LAINNYA

Serum yang mengandung


antibodi spesifik virus IB
Diuji ELISA

Hasil

UJI SERUM NEUTRALISASI


0.05 mL serum uji
Diinaktifkan pada 56oC selma 30 menit
Diencerkan secara serial kelipatan dua dalam
0,05 mL cairan media sel yang mengandung
Chicken embrio fibroblast (CEF) dengan
konsentrasi 106sel/mL dalam media penumbuh
Diinkubasi pada 37oC
Pembacaan titer antibodi dilakukan setelah 3-4
hari inkubasi
Kontrol virus dan sel disertakan dalam tiap
lempeng mikrotiter sebagai pembanding

Hasil

EVALUASI SENSITIFITAS DAN SPESIFITAS ELISA

140 serum belum


terinfeksi ILT (SPF)

100 sampel serum SPF


yang diinfeksi buatan
dengan isolat BGR-6
dan isolat BKS-7

Diperiksa dengan uji


SN
Diuji ELISA

Hasil

APLIKASI ELISA DALAM MENDETEKSI


ANTIBODI VIRUS ILT DALAM SERUM
AYAM

6 ayam SPF umur 6


minggu
Divaksin dengan vaksin hidup
komersial dengn dosis 102,4TCID50
9 minggu pasca vaksinasi
diinveksi dengan virus ILT isolat
lapang 104EID50 per 0,1 mL

Serum

Dikoleksi
Diuji ELISA pada minggu 1-9 pasca
vaksinasi dan 1-3 minggu pasca
infeksi

Hasil

HASIL DAN PEMBAHASAN

JUMLAH ANTIGEN YANG MEMBERIKAN


REAKSI OPTIMUM DALAM ELISA

OPTIMASI PELAPISAN LEMPENG


MIKROTITER

KURVA STANDAR ILT

PENENTUAN NILAI CUT-OFF ELISA ILT


Penentuan nilai cut off ELISA ILT didasarkan atas
hasil uji 140 serum ayam SPF yang
memperlihatkan
rataan OD 0,073 0,032 dengan penambahan 3
sd.
Dengan demikian nilai cut off ELISA ILT adalah
0,169,
yang berarti bahwa setiap reaksi dalam ELISA
dengan
nilai OD di atas nilai tersebut dianggap reaksi
positif
dan sebaliknya

EVALUASI SENSITIFITAS DAN SPESIFITAS ELISA

APLIKASI ELISA DALAM MENDETEKSI ANTIBODI VIRUS ILT DALAM


SERUM AYAM

KESIMPULAN
ELISA ILT yang dikembangkan memperlihatkan
kemampuan serta akurasi yang baik dengan sensitifitas
98% dan sepesifisitasnya sebesar 97,14%, sehingga uji
ini dapat digunakan sebagai perangkat uji serologi
dalam mendeteksi adanya antibodi terhadap virus ILT
dalam serum ayam, sebagai akibat vaksinasi maupun
infeksi. ELISA ILT yang dikembangkan perlu dikaji
dan diaplikasikan pada serum ayam lapang dalam
jumlah yang lebih besar.

TERIMA KASIH