INSTRUKSI KERJA (IK)

PENETAPAN KADAR
ETHAMBUTOL DALAM
DRIED BLOOD SPOT
(DBS)
DENGAN LC-MS

THESIS

Kepala
Laboratorium

Dosen Pembimbing I

No. IK
Revisi
00
Exp.
JULI 2015
date
Halama
1 dari 4
n
Mahasiswa Peneliti

(
..)

Dr. rer nat. Endang

Darmawan, M.Si., Apt

Noverda Ayuchecaria,
S.Farm., Apt

1. TUJUAN
Validasi metode penetapan kadar Ethambutol dalam Dried Blood Spot (DBS) menggunakan LCMS
2. REFERENSI
Wiliam, R. M, Kim, M., Andrew. M, et.al., 2014. A Dried Blood Spot Method for Therapeutic
Drug Monitoring of Ethambutol, Pyrazinamide, and Moxifloxacin to Optimize
Tuberculosis Treatment in Children Using LC-MS/MS. KCAS.
World Health Organization. 2006. Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamide and Ethambutol
Hydrochloride Tablets Final text for addition to The International Pharmacopoeia. Jenewa
: WHO.
ICH Harmonised Tripartite Guideline. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text and
Methodology (Q2). USA; Japan; and European Union.
3. ALAT DAN BAHAN
3.1. ALAT
3.1.1. Micropipet ukuran 100 1000 L
3.1.2. Micropipet ukuran 10 100 L
3.1.3. Syringe membrane filter 0.22 m
3.1.4. LCMS Shimadzhu dan peralatan penunjang
3.1.5. Alat-alat gelas dan peralatan penunjang
3.2. BAHAN
3.2.1. Mobile Phase A : 0.1% Formic Acid in DI H2O for LCMS
3.2.2. Mobile Phase B : Acetonitrile/MeOH/Formic Acid (40:60:0.1. v/v/v) for LCMS
3.2.3. Metanol 90% pa
3.2.4. Aquabidest (Otsuka)
3.2.5. Ethambutol (Pharos)
4. PREPARASI STANDAR ETHAMBUTOL
4.1. LARUTAN INDUK
4.1.1. Standar ethambutol ditimbang sebanyak 10,0 mg.
4.1.2. Standar dilarutkan ke dalam labu takar 10 mL dengan pelarut methanol hingga tanda
(Kadar ethambutol 1 mg/mL).

INSTRUKSI KERJA (IK)

PENETAPAN KADAR
ETHAMBUTOL DALAM
DRIED BLOOD SPOT
(DBS)
DENGAN LC-MS

THESIS

Kepala
Laboratorium

Dosen Pembimbing I

No. IK
Revisi
00
Exp.
JULI 2015
date
Halama
2 dari 4
n
Mahasiswa Peneliti

(
..)

Dr. rer nat. Endang

Darmawan, M.Si., Apt

Noverda Ayuchecaria,
S.Farm., Apt

4.1.3.

Saring larutan standar tersebut dengan membrane filter 0,22 m dan selanjutnya
filtrat yang diperoleh disebut larutan induk ethambutol 1 mg/mL.

4.2. LARUTAN KURVA BAKU/LINEARITAS

4.2.1. Dibuat larutan seri kadar dari larutan induk dengan cara memipet 100; 150; 300; 600;
900; dan 1000 L masing-masing ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan
dengan metanol hingga tanda (larutan ethambutol yang diperoleh mempunyai kadar
sebesar 10; 15; 30; 60; 90; dan 100 g/mL). Sedangkan konsentrasi terendah
diperoleh dengan memipet 1000 uL konsentrasi 10 g/mL kedalam labu takar 10 mL
dan ditambahkan dengan methanol hingga tanda sehingga diproleh konsentrasi 1
g/mL.
4.2.2. Masing-masing larutan disimpan dalam vial 10 mL yang telah tertutup rapat dengan
alumunium foil dengan indentitas yang telah ditempelkan sebelumnya.
4.2.3. Vial disimpan dalam freezer suhu -60 derajat celcius agar tidak terjadi kerusakan zat
aktif.
5. PREPARASI SAMPEL
5.1. PEMBUATAN KURVA BAKU/LINEARITAS
5.1.1. Larutan kurva baku dikeluarkan dari freezer hingga suhu kamar.
5.1.2. Pipet 450 L whole blood ke dalam microtube dengan menggunakan micropipette
sesuai dengan jumlah titik kurva baku yang akan dibuat.
5.1.3. Pipet 50 L masing-masing larutan kurva baku ke dalam microtube yang sudah berisi
450 L whole blood. Konsentrasi masing-masing titik kurva baku menjadi 1/10 dari
konsentrasi semula (0,1; 1; 1.5; 3; 6; 9 dan 10 g/mL)
5.1.4. Homogenkan microtube dengan bantuan vortex selama 20 detik dengan kecepatan
maksimal.
5.1.5. Teteskan pada plate kertas DBS. Tempatkan pada suhu 37C selama 1 jam.
5.1.6. Potong punch DBS dengan diameter 7mm.
5.1.7. Masukan potongan punch kedalam perlarut Metanol 90% sebanyak 300L.
5.1.8. Campuran di sonifikasi 60 menit.

INSTRUKSI KERJA (IK)

PENETAPAN KADAR
ETHAMBUTOL DALAM
DRIED BLOOD SPOT
(DBS)
DENGAN LC-MS

THESIS

Kepala
Laboratorium

Dosen Pembimbing I

No. IK
Revisi
00
Exp.
JULI 2015
date
Halama
3 dari 4
n
Mahasiswa Peneliti

(
..)

Dr. rer nat. Endang

Darmawan, M.Si., Apt

Noverda Ayuchecaria,
S.Farm., Apt

5.1.9.

100 L larutan hasil sonifikasi ditambah 300 L 0.1% Formic Acid dalam deionized
water.
5.1.10. Injeksikan ke dalam sistem sebanyak 8 L.
5.1.11. Data yang diperoleh antara zat aktif ethambutol diolah untuk membuat persamaan
regresi linear dengan ketentuan persyaratan R>0.99 dan %Error untuk nilai
LOQ<20% dan titik kurva baku yang lain <15%.
5.2. PRESISI DAN AKURASI
5.2.1. Dibuat dari larutan induk dengan konsentrasi:
Larutan I dengan kadar 1 g/mL : Lower Limit of Quantification
Larutan II dengan kadar 15 g/mL : QC Low
Larutan III dengan kadar 45 g/mL : QC Medium
Larutan IV dengan kadar 90 g/mL : QC High
5.2.2. Pipet 50 L masing-masing larutan I-IV ke dalam microtube yang sudah berisi 450
L whole blood. Konsentrasi masing-masing larutan menjadi 1/10 dari konsentrasi
semula (0.1; 1.5; 4.5; dan 9 g/mL)
5.2.3. Lakukan langkah 5.1.5 sampai 5.1.10 seperti diatas.
5.2.4. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan persamaan regresi linear yang telah
diperoleh untuk memperoleh kadar ethambutol untuk menghitung akurasi dan presisi.
Presisi dinilai dari Relative Standar Deviation (RSD) dan akurasi dinilai dari Relative
Error (RE).
5.3. UJI STABILITAS
5.3.1. Uji stabilitas dilakukan dengan menempatkan plate DBS yang telah ditetesi darah
dalam kondisi :
- Kondisi Suhu ruang (37C) selama 1 minggu, 2 minggu dan 1 bulan
- Kondisi Suhu ekstrim (50C) selama 1 hari, 2 hari dan 1 minggu
5.3.2. Lakukan langkah 5.1.6 sampai 5.1.10 seperti diatas.
5.3.3. Data yang diperoleh diolah dengan menggunakan persamaan regresi linear yang telah
diperoleh untuk memperoleh kadar ethambutol.
5.4. PENETAPAN KADAR SAMPEL
5.4.1. Sampel plate DBS dikeluarkan dari plastic box penyimpanan.

INSTRUKSI KERJA (IK)

PENETAPAN KADAR
ETHAMBUTOL DALAM
DRIED BLOOD SPOT
(DBS)
DENGAN LC-MS

THESIS

Kepala
Laboratorium

Dosen Pembimbing I

No. IK
Revisi
00
Exp.
JULI 2015
date
Halama
4 dari 4
n
Mahasiswa Peneliti

(
..)

Dr. rer nat. Endang

Darmawan, M.Si., Apt

Noverda Ayuchecaria,
S.Farm., Apt

5.4.2.
5.4.3.

Lakukan langkah 5.1.6 sampai 5.1.10 seperti diatas.

Area Under Curve (AUC) yang diperoleh diolah dengan menggunakan persamaan
regresi linear yang telah diperoleh untuk memperoleh kadar ethambutol dalam
sampel.

6. PARAMETER INSTRUMENT
Liquid Chromatograpy
Autosampler
Column
Fase gerak
Kecepatan alir
Detektor
Waktu Retensi
Volume injek
Mass Spectrometry
Polarity
Scan type

: Shimadzu
: Perkin Elmer 200
: Prodigy ODS3 (50x2 mm) by Phenomenex
: Phase A (0.1% Formic Acid in DI H2O
Phase B Acetonitrile/MeOH/Formic Acid (40:60:0.1, v/v/v)
: 0.3 mL/min
: UV 210 nm
: 0.8 min
: 8 L
: AB Sciex API 3000
: Positive
: Multiple Reaction Monitoring
Ethambutol : m/z 205.0 116.0

7. DOKUMEN TERKAIT
7.1. Laporan hasil validasi metode penetapan kadar ethambutol dalam DBS.
7.2. Laporan hasil penetapan kadar ethambutol dalam DBS.