VALIDASI METODE BIOANALITIK

8.1 Perkenalan
8.1.1 Definisi
Validasi Metode Bioanalitik merupakan prosedur kerja untuk mendemonstrasi bahwa
metode analisis yang digunakan untuk analisis kuantitatif dari analit pada matriks biologi dapat
dipercaya dan reproducible sehingga dapat mencapai tujuan; kuantitas dari analit dengan derajat
akurasi dan presisi yang tinggi. Metode kuantitatif yang digunakan termasuk metode kurva
standar dari standar internal. Konsentrasi analit dapat dilihat dari respon sampel yang disebut
standar kalibrasi. Blangko digunakan untuk mengetahui ada tidaknya interferen dalam matriks.
Akurasi dan presisi dari metode dapat dikalkulasi dengan mengkalkulasikan sampel yang telah
diketahui konsentrasinya atau disebut Quality Control samples (QCs).
Hal hal tersebut di atas penting untuk jaminan kepercayaan dari selektifitas dan
sensitifitas metode bioanalitik sebelum digunakan untuk evaluasi kuantitatif dari obat dan
metabolismenya. Data yang dihasilkan dari metode ini harus reproducible dan terpercaya karena
digunakan untuk evaluasi dan interpretasi dari bioavailibilitas, bioequivalen, farmakokinetik dan
pre-clinical findings. Validasi yang dapat digunakan untuk metode bioanalitik dapat
menggunakan teknik analisis seperti: GC (Gas Chromatography); HPLC (High-Pressure Liquid
Chromatography); teknik mass spectrometric seperti: LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS dan GCMS/MS; atau immunological dan prosedur mikrobiologi seperti radioimmunoassay (RIA) dan
enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) untuk pemisahan kuantitatif obat dan/atau
metabolit dalam matriks biologi seperti sampel darah, serum, plasma, urin, feses, saliva, septum
(dahak), CSF (cerebrospinal fluid), jaringan-jaringan dan kulit.
Meskipun terdapat banyak prosedur dalam validasi bioanalitik, proses pengujian yang
spesifik dikembangkan, divalidasi, dan digunakan dalam analisis sampel rutin dapat dibagi
dalam 4 tahap utama:
-

Preparasi standar referensi (larutan stok, pelarut, spiked calibrators, dan QCs.
Pengembangan metode bioanalitik dimana prosedur pengujian ditetapkan.
Validasi metode bioanalitik dan definisi kriteria penerimaan untuk analisis.

Aplikasi metode validasi untuk sampel rutin.

Parameter dasar dalam validasi bioanalitik termasuk akurasi, presisi, selektifitas, sensitifitas,
reproducible, stabilitas obat dalam matriks pada kondisi penyimpanan, range, recovery dan
fungsi

respon.

Bagaimanapun,

pengujian

memiliki

karakteristik

unik

yang

harus

dipertimbangkan dalam validasi metode seperti selektifitas dan hasil kuantifikasi.

8.1.2 Pedoman Peraturan Mengenai Validasi Metode Bioanalitik
Sejak tahun 1990 dalam Washington Conference dalam validasi metode analisis seperti:
bioavailabilitas, bioequivalen, studi farmakokinetik, merupakan parameter yang harus digunakan
untuk menggambarkan validasi metode. Hasil akhir dari konferensi ini adalah pertimbangan
dokumen yang paling komferhensif dalam validasi pada metode bioanalitik. Banyak perusahaan
farmasi yang berkontribusi didalamnya.
Bagaimanpun, pada akhir decade sudah ada kemajuan dalam teknik yang digunakan
untuk preparasi sampel dan analisis. Contohnya, medan massa spektrometri, alat penghubung
baru, ionisasi, dan teknik deteksi telah berkembang.
Sesuai dengan pedoman FDA, dapat dianggap sebagai persyaratan minimum untuk
menguji kinerja dari metode bioanalytical. Karena proses validasi harus mensimulasikan analisis
sampel, dimana pada tes akhir metode yang sudah 'divalidasi' akan selalu menjadi analisis
sampel itu sendiri. Ada kemungkinan bahkan jika semua kriteria validasi terpenuhi, metode
bioanalytical mungkin tidak dapat dipercaya untuk analisis sampel yang sebenarnya. situasi yang
tidak diinginkan ini bisa terjadi ketika sampel yang sebenarnya (sampel in vivo) mengandung
interferen baru tidak hadir dalam sampel (sampel in vitro) karena proses metabolisme dan/atau
biotransformations lainnya. Untuk alasan ini, laboratorium bioanalytical bisa memutuskan untuk
menggunakan kriteria dan prosedur yang lebih ketat dan/atau menggunakan sampel yang
sebenarnya selama pengembangan metode untuk lebih menjamin validitas metode divalidasi.
Maka kami merangkum rekomendasi umum saat praktek validasi metode bioanalitis
sesuai dengan pedoman FDA, dengan pendekatan alternatif lain yang akan dibahas kemudian.

8.2 PRAKTEK VALIDASI YANG BERLAKU

Prosedur validasi untuk metode bioanalitik dalam evolusi yang berkelanjutan sejak
metode bioanalitik terus mengalami perubahan perbaikan, dan dalam banyak kasus teknologi
canggih.
8.2.1 Definisi
Sebagai langkah awal, penting untuk memiliki jelas dalam definisi pikiran istilah analisis
yang digunakan antara lain :

Akurasi : tingkat keeratan nilai terdekat untuk nilai sebenarnya nominal atau dikenal

dengan kondisi yang ditentukan. Ini kadang-kadang disebut trueness.

Analit : suatu bagian kimia tertentu yang diukur, yang bisa menjadi obat utuh,
biomolekul, atau turunannya, metabolit, dan / atau produk degradasi dalam matriks

biologi.
Analitik (atau batch) : satu set lengkap sampel analitis dan studi dengan jumlah yang
sesuai standar dan QCs untuk validasi mereka. Beberapa berjalan (atau batch) dapat
diselesaikan dalam satu hari, atau satu run (atau batch) dapat memakan waktu beberapa

hari untuk menyelesaikan.

Matriks biologi : bahan diskrit asal biologis yang dapat dicicipi dan diproses dengan cara
yang direproduksi. Contohnya adalah darah, serum, plasma, urin, feses, air liur, dahak,

dan berbagai jaringan diskrit.

Larutan stok : Larutan yang disiapkan langsung oleh berat standar referensi analit dan
melarutkannya dalam pelarut yang sesuai. Biasanya, larutan stok yang disiapkan pada
konsentrasi 1 mg / mL dalam metanol dan terus didinginkan di -20C jika tidak ada

masalah stabilitas atau kelarutan.

Standar kalibrasi : matriks biologis yang jumlah dikenal analit telah ditambahkan atau
berduri. Standar kalibrasi yang digunakan untuk membangun kurva kalibrasi dari mana

konsentrasi analit dalam QCs dan dalam sampel penelitian diketahui ditentukan.
Standar internal : Uji senyawa (s) (misalnya, struktural analog yang sama, senyawa
berlabel stabil) ditambahkan ke kedua standar kalibrasi dan sampel pada konsentrasi yang

diketahui dan konstan untuk memfasilitasi kuantifikasi analit target (s).

Batas deteksi (LOD) : konsentrasi terendah suatu analit bahwa prosedur bioanalitis

dipercaya bisa membedakan dari latar belakang noise.

Batas bawah kuantifikasi (LLOQ) : jumlah terendah dari analit sampel yang dapat
ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi cocok.

Efek Matrix : perubahan langsung atau tidak langsung atau gangguan dalam menanggapi
karena adanya analit yang tidak diinginkan (untuk analisis) atau zat mengganggu lainnya

dalam sampel.
Metode : deskripsi komprehensif dari semua prosedur yang digunakan dalam analisis

sampel.
Presisi : kedekatan perjanjian (derajat scatter) antara serangkaian pengukuran yang
diperoleh dari beberapa sampel dari sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang

ditentukan.
Olahan sampel : ekstrak akhir (sebelum analisis instrumental) dari sampel yang telah

mengalami berbagai manipulasi (misalnya, ekstraksi, pengenceran, konsentrasi).

Kisaran Kuantifikasi : kisaran konsentrasi, termasuk ULOQ dan LLOQ, yang dapat
diukur dengan andal dan reprodusibel dengan akurasi dan presisi melalui penggunaan

hubungan konsentrasi-respon.
Recovery : efisiensi ekstraksi dari proses analisis, dilaporkan sebagai persentase dari
jumlah dikenal dari suatu analit dilakukan melalui langkah-langkah ekstraksi sampel dan

pengolahan metode.
Reprodusibel : ketepatan antara dua laboratorium. Ini juga merupakan ketepatan metode

di bawah kondisi operasi yang sama selama periode waktu yang singkat.
Sampel : istilah umum meliputi kontrol, kosong, tidak diketahui, dan sampel diproses,
seperti yang dijelaskan di bawah ini:
o Kosong : sampel matriks biologi yang ada analit telah ditambahkan yang digunakan
untuk menilai spesifisitas metode bioanalisis.
o Sampel kontrol kualitas (QC) : Contoh yang digunakan untuk memantau kinerja
metode bioanalitis dan untuk menilai integritas dan validitas hasil sampel yang tidak

diketahui dianalisis dalam batch individu.

o Diketahui : sampel biologis yang merupakan subjek dari analisis.
Selektivitas : kemampuan metode bioanalitis untuk mengukur dan membedakan analit
dengan adanya komponen yang dapat diharapkan untuk ada. Ini dapat mencakup

metabolit, kotoran, degradants, atau komponen matriks.

Stabilitas : stabilitas kimia dari suatu analit dalam matriks yang diberikan dalam kondisi

tertentu untuk interval waktu tertentu.

Kurva standar : hubungan antara nilai respon eksperimental dan konsentrasi analitis (juga

disebut kurva kalibrasi).

Kesesuaian sistem : penentuan kinerja instrumen (misalnya, sensitivitas dan retensi
kromatografi) dengan analisis dari standar acuan sebelum menjalankan batch analitis.

Batas atas kuantifikasi (ULOQ) : jumlah tertinggi analit dalam sampel yang dapat

ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi.

Validasi
o Validasi penuh : pembentukan semua parameter validasi untuk menerapkan analisis
sampel untuk metode bioanalisis untuk setiap analit.
o Validasi parsial : modifikasi divalidasi metode bioanalitik yang belum tentu panggilan
untuk revalidasi penuh.
o Cross-validasi : perbandingan parameter validasi dari dua metode bioanalitik.
o Larutan bekerja : Larutan disiapkan dari larutan stok melalui pengenceran dalam
pelarut yang sesuai pada konsentrasi diminta untuk spiking matriks biologi.
8.2.2 Selektivitas
Untuk selektivitas, analisis sampel kosong dari matriks yang sesuai biologis (plasma,
urin, atau matriks lainnya) harus diperoleh dari sedikitnya enam sumber.
Potensi zat campur dalam matriks biologi mencakup komponen matriks endogen,
metabolit, produk dekomposisi, dan dalam studi yang sebenarnya, obat bersamaan. Metode
selektivitas harus dievaluasi selama pengembangan metode dan metode validasi serta dapat terus
selama analisis sampel penelitian yang sebenarnya.
Berikut rekomendasi untuk menangani dua isu selektivitas harus dipertimbangkan:
1. Gangguan spesifik dari sifat fisika-kimia zat yang mirip dengan analit:
a. Reaktivitas silang metabolit, obat bersamaan, atau senyawa endogen harus dievaluasi
secara individu dan dalam kombinasi dengan analit kepentingan.
b. Bila mungkin, immunoassay harus dibandingkan dengan metode referensi divalidasi
(seperti LC-MS) menggunakan sampel dikeluarkan dan kriteria yang telah ditentukan
untuk persetujuan akurasi immunoassay dan metode referensi.
c. The linearitas pengenceran dengan standar referensi harus dinilai dengan menggunakan
studi (dikeluarkan) sampel.
d. Selektivitas dapat ditingkatkan untuk beberapa analit dengan penggabungan langkah
pemisahan sebelum immunoassay.
2. Nonspesifik efek matriks:
a. Kurva standar dalam cairan biologis harus dibandingkan dengan standar dalam buffer
untuk mendeteksi efek matriks.
b. Paralelisme sampel penelitian diencerkan harus dievaluasi dengan standar diencerkan
untuk mendeteksi efek matriks.

c. Spesifik mengikat harus ditentukan.

8.2.3 Standar Referensi
Kemurnian standar referensi yang digunakan untuk menyiapkan sampel yang di spike dapat
memengaruhi data studi. Untuk alasan ini, sebuah standar referensi analitis harus diketahui
identitas dan kemurniannya untuk dapat digunakan dalam penyiapan larutan yang sudah
diketahui konsentrasinya. Ada 3 tipe standar referensi umum yang digunakan :
1. Standar referensi tersertifikasi ( USP compendial standards)
2. Standar referensi yang tersedia secara komersial yang diperoleh dari sumber komersial
bereputasi
3. Bahan lainnya dengan kemurnian yang terdokumentasi,disintesis oleh laboratorium
analitis atau buatan nonkomersial lainnya.
Tiap standar referensi harus dilengkapi dengan sumber dan jumlah, tanggal kadaluarsa, sertfikat
analisis, dan/atau bukti identitas dan kemurnian.
8.2.4 Kurva Standar
Kurva kalibrasi harus dihasilkan dari tiap analit dalam sampel. Jumlah standar yang digunakan
harus cukup menegaskan hubungan antara konsentrasi dan respon. Kurva kalibrasi harus
disiapkan dalam matriks biologis yang sama seperti sampel dalam studi dengan mengadisi
(spike) matriks dengan analit yang konsentrasinya sudah diketahui. Jumlah standar akan menjadi
fungsi range yang diantisipasi pada nilai analitis dan hubungan analit-respon (sensitivitas
detektor dan range linier detektor). Konsentrasi standar dipilih berdasarkan range konsentrasi
yang diharapkan pada studi tertentu. Kurva kalibrasi harus mengandung sampel blanko (matriks
sampel di proses tanpa standar internal), zero matriks sampel yang diproses dengan standar
internal, dan enam sampai delapan nonzero sampel dengan range yang diharapkan, termasuk
LLOQ.
Lower Limit of Quantification. Standar terendah pada kurva kalibrasi yang diterima sebagai
batas kuantifikasi jika ditemui kondisi berikut :
1. Respon analit pada LLOQ harus setidaknya lima kali respon blanko.
2. Puncak analit (respon) haris dapat diidentifikasi, memiliki ciri khas, dan reprodusibel, dengan
presisi CV kurang dari 20% dan akurasi 80-120%.

Hubungan Konsentrasi-Respon
Kondisi berikut dapat ditemui dalam mengembangkan kurva kalibrasi :
1. Deviasi LLOQ kurang dari 20% dari nominal konsentrasi.
2. Deviasi 15% dari standar selain LLOQ dari nominal konsentrasi.
Setidaknya pada 4-6 nonzero standar harus ditemukan kriteria di atas, termasuk LLOQ dan
standar kalibrasi pada konsentrasi tertinggi. Dalam penambahan, kecuali standar yang tidak
ditemukan kriteria di atas tidak boleh mengubah model respon konsentrasi yang digunakan.
Microbiological and Immunoassay. Kurva standar microbiologi dan immunoassay nonlinear,
dan umumnya, lebih banyak titik konsentrasi mungkin di rekomendasikan untuk menetapkan
range kurva standar daripada pengujian kadar senyawa kimia. Terkait karakteristik nonlinear,
hubungan respon-kesalahan untuk kurva standar immunoassay merupakan fungsi varibel dari
respon (heteroscedisticity).
Untuk alasan ini, sebuah jumlah paling kecil dari 6 nonzero konsentrasi kalibrator di
rekomendasikan untuk diduplikasi. Penggunaan titik penjangkaran yang sejajar dengan
konsentrasi tinggi dan rendah yang mengakhiri kurva standar dapat memberikan peningkatan
pada kurva secara keseluruhan. Umumnya, titik penjangkaran ini akan ada pada konsentrasi
dibawah LLOQ dan di atas ULOQ. Sampel replikasi harus diukur selama validasi untuk
meningkatkan akurasi, prosedur sama harus diikuti untuk sampel yang tidak diketahui.
8.2.5 Precision and Accuracy
Akurasi ditetapkan mereplikasi analisis sampel yang mengandung jumlah analit yang diketahui.
Akurasi diukur menggunakan minimal lima kali penetapan per konsentrasi. Nilai rata-rata harus
kurang dari 15% dari nilai sebenarnya kecuali pada LLOQ, dimana itu tidak boleh menyimpang
lebih dari 20%. Deviasi pada rata-rata dari nilai sebenarnya dijadikan sebagai akurasi.
Presisi harus diukur menggunakan minimal lima kali penetapan per konsentrasi. Presisi
ditetapkan pada tiap level konsentrasi tidak melebihi 15% dari CV kecuali untuk LLOQ, dimana
itu tidak melebihi 20% dari CV
Presisi dibagi menjadi :

Presisi intrabatch atau repeatability, dimana menilai presisi selama analisis tunggal
berlangsung

Presisi interbatch atau presisi intermediate, dimana penilaian presisi dengan waktu dan
melibatkan analisis, peralatan, reagen, dan laboratorium yang berbeda

Pada nilai terendah, tiga konsentrasi yang mewakili keseluruhan range dari kurva standar harus
dipelajari : satu dalam tiga kali LLOQ (sampel QC rendah), satu dekat pusat (pertengahan QC)
dan satu dekat batas teratas dari kurva standar (QC tinggi). Perhitungan akurasi dan presisi, tidak
termasuk nilai-nilai yang secara statistik ditetapkan sebagai penyimpangan, dapat juga di
laporkan pada data validasi metode.
8.2.6 Pengenceran
Kemampuan untuk mengencerkan sampel asli di atas batas tertinggi pada kurva standar harus di
demonstrasikan dengan parameter akurasi dan presisi pada validasi.
8.2.7 Recovery
Recovery dari analit tidak perlu 100%, tapi tingkat recovery analit dan dari standar internal harus
konsisten,

presisi,

dan

reprodusibel.

Recovery

percobaan

harus

dilakukan

dengan

membandingkan hasil analisis untuk sampel yang diekstraksi pada 3 konsentrasi (rendah, sedang,
tinggi) dengan standar yang tidak diekstraksi mewakili recovery 100%.
Untuk Microbiological dan immunoassay, jika pemisahan dilakukan sampai pengujian kadar
dalam studi sampel tapi tidak untuk standar, penting untuk menetapkan recovery dan
menggunakannya dalam menentukan hasil. Pendekatan yang dapat dilakukan untuk menilai
efisiensi dan reprodusibilitas dari recovery :

Penggunaan trace analit (jumlah terlalu sedikit untuk berpengaruh pada pengujian kadar)
Peningkatan dalam penentuan recovery yang reprodusibel
Penggunaan standar internal yang tidak dikenali oleh antibodi tapi dapat ditentukan
dengan teknik lainnya

8.2.8 Stabilitas
Stabilitas dari analit yang ada dalam matrix dan sistem tidak boleh diektrapolasi ke dalam
matrix dan sistem lainnya. Prosedur untuk menentukan stabilitas harus dapat mengevaluasi
stabilitas dari analit selama pengumpulan sampel dan handling sampel setelah mengalami
beberapa perlakuan.
Kondisi yang digunakan adalah kondisi yang menggambarkan keadaan yang sama seperti

keadaan sampel yang sebenarnya di dalam proses handling dan analisis. Prosedur uji stabilitas
harus dilakukan juga untuk evaluasi dari stabilitas larutan stok dan sampel yang digunakan
disiapkan dari larutan stok yang dibuat.
Ada beberapa macam uji stabilitas, yaitu :
a. Freeze and Thaw Stability
Stabilitas analit dapat diketahui jika sudah dilakukan siklus 3 kali. Setiap bagian dengan
konsentrasi berbeda disimpan di suhu penyimpanan selama 24 jam dan dilelehkan di
temperatur ruangan, setelah leleh dibekukan kembali 12 sampai 24 jam dalam kondisi
yang sama dan diulangi sampai 3 siklus
b. Short-Term Temperature Stability
3 bagian dengan berbagai konsentrasi rendah dan tinggi dilelehkan dalam suhu ruangan
dan suhu dijaga selama 4 sampai 24 jam kemudian dilakukan analisis.
c. Long term stability
waktu penyimpanan untuk evaluasi stabilitas jangka panjang harus melewati waktu antara
tanggal pertama kali pengumpulan sampel dan tanggal terakhir kali sampel dianalisis.
Stabilitas jangka panjang dapat ditentukan dengan menyimpan setidaknya tiga bagian
dari setiap konsentrasi rendah dan tinggi pada kondisi yang sama dan dilihat
konsentrasinya dari awal pengujian hingga hari terakhir.
d. Stock Solution Stability
Stabilitas larutan stok dari suatu obat atau standar internal harus dievaluasi pada suhu
ruangan sedikitnya 6 jam. Kalau stok pernah dibekukan maka stabilitas harus dicatat dan
setelah waktu penyimpanan, stabilitasnya harus dites dengan membandingkan dengan
larutan yang baru
e. Postpreparative Stability
Stabilitas sampel harus dideterminasi dan reprodusibilitas dari penginjekan ulang harus
dievaluasi sehingga jika terjadi kesalahan dalam instrumen dapat dianalisis ulang.
8.2.9 Verifikasi tambahan
Ada berbagai macam verifikasi tambahan:
a.

Full Validation
Hal ini penting dilakukan ketika mengembangkan dan menerapkan metode baru maupun

menggunakan zat uji yang baru.

b.

Partial Validation.
Partial Validation ini dapat menjangkau penentuan nilai akurasi dan presisi yang kecil dan
dilakukan untuk modifikasi dari metode yang sudah divalidasi. Partial validation dapat
meliputi:

c.

Metode bioanalytical transfer antara laboratorium atau analis

Perubahan metode analisis

Perubahan matriks pada spesies yang sama

Perubahan spesies dengan matriks yang sama

Perubahan pada prosedur pengolahan sampel

Perubahan instrument

Keterbatasan volume sampel

Selektivitas untuk memisahkan analit dengan adanya senyawa lain secara bersamaan

Selektivitas untuk memisahkan analit dengan adanya metabolit yang spesifik

Cross-Validation
Merupakan perbandingan ketika dua atau lebih metode bioanalytical digunakan untuk
mengolah data dengan studi yang sama atau antar studi yang berbeda. Contohnya metode
yang sudah divalidasi dijadikan referensi dan metode lain dijadikan pembandingnya.

8.2.10 Dokumentasi
Detail dari metode bioanalytical harus ditulis. Tulisan ini bisa dijadikan lembar protokol,
lembar perencanaan pembelajaran, laporan, dan/atau SOP
8.3

MASALAH DAN SOLUSI

8.3.1

Definisi (Perbandingan definisi dari berbagai sumber)

Lower Limit of Quantification (LLOQ)

2000 Conference: Jumlah terendah dari analit didalam sample yang dapat ditentukan secara
kuantitatif dengan presisi dan akurasi. Ini berhubungan dengan definisi dari sensitivity suatu
metode dimana konsentrasi terendah standar memiliki koefisien variasi (CV) 20%.

1990 Conference:

Konsentrasi terendah dari analit yang dapat diukur dengan tingkat

kepercayaan.
IUPAC: Konsentrasi yang memberikan signal 10 kalli dari standar deviasi blanko.
Upper Limit of Quantification
2000 Conference:Jumlah teritinggi dari analit dalam sample yang dapat ditentukan secara
kuantitatif dengan presisi dan akurasi.
Accuracy
2000 Confernece: Derajat kedekatan untuk mengetahui nilai sebenaranya dibawah suatu kondisi.
Uraian:

dapat dinyatakan sebagai persen relative error (&RE)

RE bisa positif, negatif atau nol
%RE = [(nilai sebenarnya/nilai teoritis) 1] x 100
konsentrasi yang diukur dari sampel yang diketahui dibandingkan dengan konsentrasi

teoritis, kisaran konsentrasi yang tepat dianggap sebagai indikasi akurasi

intraassay accuracy: RE dari mean replikasi analisis dari validasi sample selama validasi

satu batch.
Interassay accuracy: RE dari mean replikasi analisis dari validasi sample selama validasi
semua batch.

1990 Conference: kedekatan nilai untuk mengetahui nilai sebenarnya. umumnya, recovery dari
penambahan analit untuk kisaran konsentrasi yang tepat dari sebagai indikasi akurasi.
ISO: Pernyataan kedekatan antara hasil tes dengan nilai referensi yang diterima.
8.3.2. Selektivitas / spesifisitas
Selektivitas merupakan suatu kemampuan pengukuran dari metode bioanalytical dan
membedakan kehadiran dari analit di komponen tersebut, sedangkan spesifisitas adalah
kemampuan untuk mengukur dengan tepat kehadiran analit yang diharapkan pada komponen
tersebut. Pada umumnya, metode analitis sudah selektif, hanya dibeberapa kasus juga sudah
spesifik (misalnya LC-MS/MS sebuah metode bioanalytical termasuk metode dengan
selektivitas yang tinggi tapi tidak selalu spesifik dikarenakan adanya kemungkinan untuk

munculnya matriks kompleks biologis sebagai pengganggu dengan waktu retensi, berat molekul,
dan struktur utama yang sama dengan analit).
Selektivitas (spesifisitas) dari metode ini untuk memverifikasi bahwa:

Respon dari puncak pengganggu pada waktu retensi analit kurang dari 20% dari respon
LLOQ standar, atau respon pada konsentrasi LLOQ lima kali lebih besar dari

pengganggu yang ada di blangko pada waktu retensi analit.

Respon dari puncak pengganggu pada waktu retensi internal standar 5% dari respon
konsentrasi standar internal yang dipakai.

8.3.3. Standar Referensi

Standar referensi digunakan sebagai standar utama dalam determinasi dengan karakteristik yang
sudah terdokumentasi yang meliputi (1) kemurnian tertinggi yang bisa didapat, (2) karakteristik
diantaranya identitas, kekuatan atau potensi, dan kemurnian yang sudah ditetapkan, (3) bentuk
yang paling stabil, dan (4) penyimpanannya ditempat dan kondisi yang sesuai. Informasi tersebut
harus terdapat pada certificate of analysis (CoA), test article characterization (TAC), dan
reference standard profile.

8.3.4. Kurva Standar

Ketika kurva standar telah ditetapkan dan nilai dari LLOD dan ULOQ telah
tervalidasi, maka analisis dari konsentrasi yang tidak diketahui dengan ekstrapolasi tidak
boleh melebihi range dari validasi. Akurasi dan presisi yang paling baik diperkirakan
dengan konsentrasi yang berada pada porsi kurva linier.
Untuk kriteria penerimaan, 2000 Washington conference guidelines tidak memakan
aturan r = 0.95 atau lebih, tetapi menggunakan kriteria 20/15 sebagai contoh akurasi dari
standar kalibrasi harus diantara 20/15. Model regresi harus ditetapkan selama
pengembangan metode berlangsung yaitu ketika mengaplikasikan standar kalibrasi dan

metode yang telah ditetapkan tidak boleh diganti selama proses validasi, atau bahkan
selama analisis sample.
Dalam model regresi, fungsi polynominal yang dipertimbangkan adalah y = b0 + b1x +
b2x2 + b3x3 + ...., untuk model linier kondisi x2 atau lebih dari itu diabaikan, sedangkan
untuk model kuadratik term lebih besar dari x2 tidak dipertimbangkan. Meskipun model
kuadratik diperbolehkan di beberapa laboratorium bioanalisis, namun penggunaan model
linier harus dilakukan atau dicoba terlebih dahulu. Hasil yang tidak linier tergantung pada :
a.
b.
c.
d.
e.

Teknik injeksi
Kehilangan sample karena adanya kontak dengan peralatan kaca
Cross-talk di MS/MS
Adanya interferensi
Range konsentrasi yang terlalu besar
Pada tahun 2000, Washington conference guideline menyebutkan bahwa pemilihan

penimbangan harus dilakuakan dengan benar. Fungsi penimbangan yakni adalah untuk
mengurangi pengaruh hasil yang didapatkan untuk konsentrasi tinggi di slope dan
intercept. Berdasarkan pertimbangan statistik, fungsi penimbangan yang paling umum
digunakan untuk LC-MS dan LC-MS/MS-berbasis penetapan kadar harus 1/x, karena fakta
bahwa variansi di y meningkan di proporsi konsentrasi. Di HPLC-UV-berbasis penetapan
kadar, penggunaan 1/x2 dalam analisis regresi linear secara signifikan dapat mengurangi
nilai LLOQ yang didapatkan. Keuntungan dalam kasus ini untuk studi farmakologi dan
farrmakokinetik adalah ketika nilai konsentrasi yang diukur mendekati nilai LLOQ.
Penolakan Standar Kalibrasi Standar kalibrasi harus dieliminasi atau dihilangkan
dalam perhitungan jika : (a) Suatu masalah ditemukan dan di dokumentasi selama
pemrosesan sampel, (b) Suatu masalah kromatografi atau malfungsi sistem ditemukan dan
didokumentasikan.
Jika nilai % recovery > 20 % lebih tinggi atau lebih rendah dari pada nilai teoritis atau
>15 % lebih tinggi atau lebih rendah dari nilai teoritis untuk semua standar lainnya. Dua
pendekatan berbeda yang dapat diambil :

1.

Pendekatan yang paling sederhana dan tepat, digunakan di banyak laboratorium, yakni
untuk mengeliminasi semua standar kalibrasi yang tidak termasuk kurang lebih 15%

2.

nilai teorical, atau kurang lebih 20% teori untuk LLOQ.

Pendekatan yang kedua untuk mendefinisikan apakah standar kalibrasi berada diluar
atau masuk kedalam kriteria yang dapat diterima. Semua standar kalibrasi yang
diidentifikasi secara statistik dinyatakan ditolak karena diluar kriteria yang dapat
diterima, maka tidak dapat dimasukkan dalam kurva regresi.
Q-test digunakan untuk menemukan outlier (deviasi rata-rata). Jika Q observed > Q

teori artinya data tidak diterima. Q-test yang bagus lebih dari 5 dengan batas kepercayaan
teori 95%.

Pendekatan lain yakni menggunakan table distribusi T dengan probabilitas 95%. Jika
rasio relative error dan SD lebih dari nilai t 95 pada derajat keadaan (nilai kalibrasi -1).
RE/SD lebih besar t95, tidak diterima. RE beda dengan % akurasi dan rata-rata. Deviasi ratarata ditolak saat keluar dari limit 95%.
8.3.5. Presisi dan Akurasi
Besar dari ketidakpastian dihubungkan dengan pengukuran yang seharusnya selalu
dievalusi hingga diperoleh hasil terbaik, yakni bebas kesalahan kurva standar dan bebas dari
kesalahan konsentrasi . Presisi dan akurasi penting untuk standar metode bioanalitical.
Sistematik error dan random error Hasil dari suatu analisis dapat dipengaruhi oleh
suatu kombinasi dari dua macam experimental error yakni sistematik error dan random error.
Sistematik error berhubungan dengan akurasi dari suatu metode analisis dan merupakan
perbedaan antara rata-rata nilai yang didapat dengan nilai sebenarnya.
Random error berhubungan dengan presisi dari metode analisa. Menurut definisi ICH,
presisi dibedakan menjadi tiga yakni :

a. Repeatibility didefinisikan sebagai kedekatan hasil percobaan independent dengan

metode yang sama pada uji identifikasi material tertentu (pada laboratorium,
operator, dan peralatan yang sama serta interval waktu yang pendek).
b. Reproducibility didefinisikan sebagai kedekatan hasil percobaan independent
dengan metode yang sama pada uji identifikasi material tertentu (pada laboratorium,
operator, dan peralatan yang berbeda, tidak harus interval waktu yang pendek).
c. Intermediet pressicion didefinisikan sebagai kedekatan hasil percobaan independent
dengan metode yang sama pada uji identifikasi material tertentu (pada satu
laboratorium, namun operator, peralatan dan waktu berbeda.
Analisis varians (ANOVA) dilakukan untuk mengetahui presisi intrabatch dan interatch
sebagai bagian dari proses validasi yang disarankan oleh 2000 Washington conference
guideline. Presisi intrabatch dilihat sama dengan repeatabilitas dan presisi interbatch dilihat
sama dengan intermediate presisi dan reprodusibilitas. Perhitungan interbacth dipengaruhi
oleh operator, instrument dan laboratorium. Umumnya dikarenakan banyak nya langkah
percobaan membuat nilai intrabacth kurang dari interbatch.
Penggolongan 2 jenis error ini dimaksudkan untuk mengetahui langkah mana yang
salah dalam analisis sehingga bisa diperbaiki. Presisis dapat ditingkatkan dengan
meningkatkan jumlah replikasi tetapi apabila metode sudah bias tidak berpengaruh.
Dibutuhkan investigasi metode untuk mengetahui biasnya. Sumber bias penting diketahui
dengan cara membandingkan dengan metode standar, kesetimbangan kalibrasi, kemurnian,
kalibrasi alat gelas, kalibrasi pipet dan analit bebas matrix. Kalibrasi yang tidak sempurna
dikarenakan kurangnya persiapan standar, adanya interaksi analit dan wadah. Pengatasannya
yaitu dengan menurunkan sampel QC dalam jumlah besar terpisah dari kalibrator dan
sampel dibuat pada sebelum analisis (fresh).
15/20% Kriteria. Konferensi Washington Tahun 1990 dan 2002 menggunakan %
kriteria 15/20 untuk akurasi dan presisi. Kesimpulan dari perhitungan menyatakan bahwa
kriteria : 15% mengharuskan bias dan presisi yang 8% pada 5 kali replikasi. Ketika bias
menjadi lebih besar, presisi harus ditingkatkan untuk memenuhi batas penerimaan dengan
probabilitas yang cukup, dan sebaliknya. Ketika kedua presisi dan bias yang > 8% (n = 5),
ukuran sampel harus ditingkatkan (yaitu, lebih dari lima replikasi harus dianalisis sehingga
keputusan dapat dibuat untuk menerima atau menolak metode analisis). Konferensi

Washington Tahun 1990 dan 2002 mengharuskan presisi harus lebih baik dari 15/20% untuk
intra dan interbatch. Namun, dalam praktiknya penerimaan metode ketika presisi intrabatch
dekat 15/20% dapat menyebabkan metode gagal divalidasi lebih lanjut.
Syarat persetujuan
Dua pendekatan digunakan untuk mendefinisikan syarat persetujuan: (1) dengan mematuhi
standar deviasi data yang didapatkan ketika validasi dan (2) dengan referensi dengan syarat
eksternal yang ditentukan. Aspek dari pengujian yang dapat atau boleh diberikan di Syarat
persetujuan meliputi:

Akurasi
Presisi
Jumlah standar yang bisa menggagalkan syarat persetujuan
Jumlah QC yang dapat menggagalkan syarat persetujuan
Kontaminasi dari blangko dari asalnya
Variasi maksimal dalam intensitas standar internal
Persetujuan minimum intensitas standar internal
Jika golongan kurva belajar sampel
Bagaimana QC dapat didistribusikan dalam suatu batch
Perbedaan yang luas
Hasil dari kesesuaian system sampel

Standar Internal
Penggunaan standar internal sangat penting dalam metode bioanalytical untuk memperbaiki
presisi dan akurasi. Peran dari standar internal adalah untuk meniru kepentingan analit. Standar
internal harus ditambahkan sebelum preparasi sampel/ekstraksi sebagai pencegahan kehilangan
atau kesalahan yang terjadi selama proses. Semakin banyak langkah-langkah penanganan
sampel, maka semakin besar kesalahan terjadi. Pada kasus ini, penggunaan standar internal
adalah untuk meminimalisir kesalahan yang signifikan.
Standar internal yang benar harus memiliki sifat fisika dan kimia yang mirip dengan analit.
Dalam pengujian LC-MS dan LC-MS/MS, coelution standar internal merepresentasikan situasi
yang ideal. Maka dari itu, kedua struktur analog dan bentuk labeled isotop yang stabil dapat
digunakan. Standar internal labeled isotope yang stabil adalah pilihan yang ideal untuk pengujian
menggunakan mass spektrofotometer karena mereka menawarkan tingkat ketelitian yang tinggi.

Tetapi bagaimanapun juga, tidak semua bentuk labeled isotope yang stabil dari analit memiliki
sifat yang sama ketika digunakan sebagai standar internal. Sebenarnya, komponen analog dapat
berkelakuan lebih baik daripada standar internal labeled isotope yang salah.
Karena itu, labeled isotope stabil yang sempurna harus memenuhi persyaratan berikut ini:
1. Dia harus bisa bergabung dengan C,N, dan O daripada deuterium (H) sebagai pilihan
pertama untuk meminimalisis efek isotop dan kemungkinan untuk berubah. Atom
deuterium yang banyak dapat menghasilkan efek isotop yang signifikan.
2. Labeled isotope harus memiliki lebih dari dua atom labeled, untuk menghindari
kontribusi isotop ke dalam analit.
3. Labeled isotope harus memiliki kemurnian isotopic yang tinggi untuk mencegah
beberapa puncak berjarak hanya 1 amu karena bentuk labeled yang hanya sebagian.
4. Isotop yang tidak labeled harus dihilangkan karena dapat memengaruhi kuantifikasi analit
dan menghasilkan hasil yang bias.
5. Atom labeled harus tidak mengalami pertukaran pada tahap-tahap analisis manapun.
Kerugian dari standar internal labeled isotop yang stabil adalah harganya tidak murah dan
ketersediaannya terbatas. Standar internal labeled isotop sangat mahal karena mereka
membutuhkan sintesis yang dimodifikasi.
Sejumlah standar internal yang ditambahkan harus mendekati dengan jumlah analit yang terdapat
dalam sampel. Pada kenyataannya, kesalahan dapat diminimalisisr ketika respon relative untuk
analit dan standar internal adalah sebanding.
Seperti peraturan pada umumnya, dengan 6 ringkatan kurva kalibrasi, konsentrasi standar
internal harus berada diantara tingkatan kedua dan ketiga dari konsentrasi standar kalibrasi
tergantung dari respon alat relative untuk analit dan standar internal dan presisi pada saat level
LLOQ.

8.3.6 Pengenceran
Validasi dari pengenceran pada matriks biological dapat dibutuhkan ketika validasi
metode atau setelah validasi initial apabila konsentrasi sampel diharapkan lebih tinggi dari
ULOQ dan/atau apabila volume sampel untuk bebrapa sampel itu sedikit yang digunakan untuk

poengujian. Biasanya, pengenceran harus divalidasi menggunakan 5 replikasi dalam 3 batch

analisis yang berbeda. Sampel harus diencerkan dengan tipe matrix blanko yang sama yang
digunakan dalam validasi dan analisis sampel, memberikan hasil konsentrasi pada upper half dari
kisaran kurva standard. Akurasi dan Presisi untuk pengenceran harus kurang dari sama dengan
15%.
8.3.7 Recovery, Carryover dan Tes Kesesuaian Sistem
Recovery/ persen kesalahan. Persen kesalahan yang dihitung pada setiap langkah
preparasi sampel dan analisis adalah alat diagnosis yang kuat untuk memperbaiki metode apabila
diperlukan. Persen kesalahan sangat penting untuk memverifikasi apakah standar internal benarbenar cocok dengan analit. Penemuan dari perbedaan yang signifikan dan perbedaan yang tidak
tetap dalam persen kesalahan antara analit dan standar internal pada langkah-langkah cleanup
sampel yang berbeda dan analisis dapat mengindikasikan kegagalan metode yang mungkin
terjadi ketika validasi.
Persen kesalahan dapat dibagi menjadi beberapat tipe dan dapat dihitung sendiri-sendiri:
-

Persen kesalahan total

- Perbandingan dari tinggi puncak dan area dari standar sampel dengan ketinggian
atau puncak yang didapatkan ketika larutan standar diinjeksikan dengan

konsentrasi yang sama dengan sampel yang terkestraksi.

Efisiensi Ekstraksi persen kesalahan dari analit yang berasal dari matrix biological

setelah sample pretreatment (co: LLE, SPE, pengendapan protein, dll) untuk menghilangkan
zat-zat endogen
- Perbandingan dari tinggi puncak atau area dari sampel standard yang terekstraksi
dengan tinggi puncak atau area yang didapatkan ketika blangko yang terekstraksi
di-spike dengan analit yang diinjeksikan dengan konsentrasi yang sama dengan
-

sampel terekstraksi.
Efek Matrix (peningkatan atau penekanan) efek dari matrix biological dalam respon
instrument dengan analit
- Perbandingan dari tinggi puncak atau area dari blangko yang di-spike dengan
analit dengan tinggi puncak atau area yang didapatkan ketika larutan standar
disuntukkan dengan konsentrasi yang sama dengan sampel blangko yang di-spike

Derivatisasi atau hasil reaksi (apabila ada). Derivatisasi digunakan ketika analit tidak
stabil atau tidak terlalu sensitive dalam bentuk struktur kimia aslinya untuk teknik yang
nanti digunakan.

Carryover: Peak kromatografi pada waktu retensi dari analit atau standar internal dapat
dideteksi dengan salah satu kondisi tertentu, yaitu :
1. Blank (kosong)
2. Pada STD0 ( matrik sampel yang sudah diekstraksi tidak mengandung analit, akan tetapi
mengandung standar internal pada level yang spesifik dalam assay)
3. Rekonstitusi pelarut kosong yang disebabkan karena terdapat sisa analit ( atau standar
internal ) dari penginjekkan sampel sebelumnya
Carryover harus dievaluasi dengan cara menginjeksikan rekonstitusi pelarut kosong
secepatnya setelah didapatkan ULOQ dari kurva standar. Kriteria umum yang biasa digunakan
dapat dilihat di 2000 Washington conference, yaitu ULOQ 20% dari LLOQ.
Kecocokan sistem
Tes kecocokan sistem dilakukan pada sistem yang spesifik secara periodik (biasanya
harian) atau pada setiap batch selama validasi dan analisi sampel untuk mendeterminasi kinerja
dari sistem.
Tes kecocokan sistem meliputi :
1. Reprodusibilitas waktu retensi
2. Sensitifitas yang adekuat untuk mengkuantifikasi LLOQ (minimum respon detektor)
3. Ketepatan sensitifitas pada perhitungan ULOQ (masuk rentang dari detetor)
4. Pemisahan kromatografi
Pengujian menggunakan LC-MS/MS-based assay sangat mungkin untuk tes
kecocokan sistem dengan penggunaan paling tidak 5 kali replikasi dari konsentrasi
larutan dibandingkan dengan kalibrasi yang paling mendekati LLOQ.
Untuk memenuhi kriteria larutan ini harus mempunyai presisi untuk 5
replikasinya, yaitu 5% (dalam keadaan sistem seluruhnya sudah setimbang /
terekuilibrasi ).
Sensitifitas tidak boleh kerang dari sama dengan 40% karena sensitifitas 40%
belum cukup adekuat untuk mengkuantifikasi LLOQ.

8.3.8 Stabilitas
Stabilitas analit akan memburuk apabila:

Penguapan dari analit yang bersifat volatil

Reaksi dengan udara dapat mengakibatkan oksidasi

Interaksi dengan permukaan wadah seperti:

1. Adsobsi selektif dari analit
2. Menempel pada kaca atau plastik (contoh: protein), khususnya jika konsentrasi
analit rendah
3. Pencucian untuk mengeluarkan kontaminan: Kaca mungkin meninggalkan sisa
unsur (Analisis natrium clustering MS); plastik dapat melepaskan plasticizer,
yang akan terdeteksi pada MS.

Dekomposisi photolitik

Dekomposisi thermal

Aktivitas katalitik dan enzimatik

Reaksi fisika kimia dengan komponen sampel lainnya ( contohnya: ikatan protein)

Hal-hal diatas dapat dicegah atau diminimalisir dengan langkah-langkah berikut:

1. menurunkan temperatur untuk menghambat reaksi degradatif atau kimia atau enzimatik:

Bekerja dengan es

Dinginkan autosampler

Sebelum digunakan vial, tabung, dan wadah lainnya di dingin kan terlebih dahulu

Jaga larutan dan sampel pada suhu -70oC

2. Lindungi analit dari cahaya (botol amber atau alumunium foil)

3. Tambahkan stabilizing agent ( antioksidan atau antikoagulan)
4. Mengatur pH untuk meminimalisir hidrolisis analit
5. Degradasi minimum sampel dapat di kontrol dengan penambahan standar internal isotop
yang stabil pada waktu pengambilan sampel.
6. Menggunakan derivatisasi kimia untuk menstabilkan analit
7. Menambahkan inaktiaktor enzim atau inhibitor enzim

Pengukuran metabolit
Eliminasi dari obat biasanya terjadi pada metabolit yang lebih polar dibandingkan dengan obat
itu sendiri untuk meningkatkan ekskresinya lewat urin atau empedu. Beberapa keadaan tertentu
bioavailabilitas/bioequivalen membutuhkan determinasi metabolit:
a. Saat zat aktif obat tidak dapat di ukur pada sampel biologis and hanya metabolit yang
dapat di deteksi
b. saat zat aktif bersama dengan metabolit aktif dan atau metabolit inaktif dapat terukur
c. Saat lebih dari satu metabolit yang ada
d. Saat akumulasi metabolit teraugmentasi
Semua metode yang digunakan untuk menentukan metabolit ataupun zat aktif dan level
metabolit harus divalidasi dengan parameter umum dan kriteria-kriteria yang telah ditentukan.
Pengujian stereoisomer
Banyak obat yang terdaftar merupakan campuran rasemat. Obat itu mungkin akan
melewati stereoselektif metabolisme atau eliminasi dan satu isomer dapat menjadi lebih aktif
dibandingkan dengan isomer lainnya.
8.3.9 Dokumentasi
Metode melaporkan harus mencakup:
a. Daftar yang lengkap dari perlengkapan, kondisi, reagen, dan deskripsi preparasi dari
reagen yang digunakan.
b. Prosedur kurva standar, validasi, dan quality control preparasi sampel.
c. Prosedur ekstraksi sampel atau perlakuan sampel untuk analisis.
d. Deskripsi dari sistem ketepatan uji untuk digunakan pada analisis sampel, apakah kriteria
diterima atau ditolak.
e. Limit dari batas quantifikasi.
f. Pengujian spesifik yang diterima dan kriteria penolakan untuk kurva standar dan kontrol
kualitas.
g. Rangkuman dari validasi data, termasuk hasil akurasi dan presisi.
h. Rangkuman dari perhitungan untuk memperoleh nilai kurva standar saat validasi.

i. Kromatogram representative dari blanko plasma, standar internal ditambah plasma,

kecocokan sistem larutan, LLOQ dan ULOQ.
j. Kurva represetatif standar.
k. Catatan referensi.
l. Informasi stabilitas pendukung.
m. Catatan metode khusus.
8.3.10 Teori Metode Bioanalitik Universal
Tahun 1990 dan 2000 hasil final konferensi Washington dan pedoman FDA untuk
industri mewajibkan bahwa validasi parsial diwajibkan dengan mengubah spesies dengan
matriknya dan bahwa kalibrasi standart, QCs, dan pengenceran QCs pada metode validasi harus
dalam matrik yang sama dari sampel yang sebenarnya. Kewajiban ini didasari dari analit yang
digunakan, ketika dalam matrik yang sama dari spesies yang berbeda, walaupun selektivitas
sudah ditetapkan, masih bisa memiliki stabilitas yang berbeda atau efek matriks yang berbeda.
Teori metode bioanalitik universal, didasarkan pada perkembangan dan validasi dari metode
plasma matrik independent, berikut adalah kualitas baiknya:
-

Dapat digunakan tanpa ada perubahan keduanya baik sampel hewan dan manusia
Hanya membutuhkan satu validasi untuk semua matriks plasma
Memungkinkan penggunaan kalibrator, QCs, dan sampel yang sebenarnya pada matriks

yang berbeda pada batch yang sama

Memungkinkan penggunaan disolusi dari matrik biologis di dalam air
Kemungkinan mengganti matriks plasma pelarut dengan air akan berguna pada uji

praklinis dimana range kuantifikasinya sangat luas yang digunakan untuk mengakomodasi
variabel konsentrasi dari analit pada sample. Dalam metode bioanalitical menggunakan:
LC-MS/MS-based assay
Garis linear untuk akurasi yang tinggi rasio luas vs konsentrasi
Template perkembangan metode standart sistematik mudah diaplikasikan pada bahan
apapun
Range template dapat mengcover hampir semua permintaan scientist ADME
- 0.5 sampai 500 ng/mL
- x 10 pengenceran sampai 5000 ng/mL
- x 100 pengenceran sampai 50000 ng/mL
Inhibitor enzim universal untuk semua tipe plasma
Kelebihan dari metode ini adalah:

Mudah dan prosedurnya standar untuk pengembangan metode, validasi, dan analisis
sampel:
Analisis sampel lebih sederhana dan lebih cepat jika sampel dari matriks berbeda
dapat diuji bersama pada single batch menggunakan standar yang disiapkan pada

1 tipe saja dari matriks plasma

Penyederhanaan dari preparasi sampel otomatis dan mengurangi kemungkinan dari

penyumbatan sistem penyelidikan tips karena plasma

Troughput tinggi (sampel dari matriks berbeda pada batch yang sama)
Mengurangi biaya:
Pengenceran di air menurunkan biaya pembelian matriks kosong
Matriks yang paling murah dapat digunakan sebagai kalibrator dan preparasi QC
Mengurangi dan menyederhanakan pekerjaan
Pengembangan dan validasi dari 1 metode analitik diperlukan dalam kasus ini untuk
mendukung semua penelitian pada spesies berbeda
Kelayakan pengembangan dan validasi plasma matriks-independen metode bioanalytical

pada lingkungan GLP harus mempromosikan produksi baru, SOP upgrade mengenai validasi
metode dan analisis sampel, dan bisa menjadi masukan bagi lembaga regulator untuk meninjau
kembali pedoman pada bidang bioanalytical.
Metode. Metode matrix-independen plasma sudah diperoleh dengan menambahkan
inhibitor enzim spesifik untuk semua matriks plasma, dan efek matriks yang tidak signifikan
sudah diperoleh dengan menggunakan kriteria sebagai berikut:

Standar Kalibrasi, QCs, dan sampel harus diencerkan dalam air 5 atau 10 (tergantung
pada respon LLOQ) sebelum pengolahan sampel untuk membuat matriks yang berbeda

seragam
Sumber APCI harus digunakan dalam LC-MS / MS. Sumber APCI memiliki efek matriks

lebih sedikit dari sumber ESI atau bukan efek matriks

Isotop standar internal berlabel stabil harus digunakan untuk mengkompensasi perbedaan
antara matriks. Kromatografi fase-normal (tradisional atau dengan air sebagai eluan kuat)
harus digunakan sebagai pengganti kromatografi fase terbalik. Hal ini sudah disadari
bahwa dalam kromatografi fase-normal, efek matriks diminimalkan. Nilai k dalam
kromatografi harus dinaikkan dari 2 sampai 4 sampai 8. Pemisahan kromatografi yang
diterima, diperlukan (waktu retensi, 3 sampai 5 menit) untuk memisahkan analit dari

gangguan endogen. Bahan pra dan postpeak harus dialihkan. Prosedur ini mengurangi
efek memori pada sumber ion.
Hasil. Kemungkinan mengembangkan dan memvalidasi "universal" metode bioanalytical
sudah didemonstrasikan menggunakan kedua obat komersial dan entitas kimia baru.
Pengembangan metode dan validasi untuk Gemcitabine (cytidine analog nukleosida digunakan
dalam pengobatan beberapa jenis tumor) dan metabolit yang dideaminasi akan digunakan
sebagai contoh untuk menunjukkan penerapan dari teori universal metode bioanalitis. Metode
gemcitabine memenuhi keenam kriteria di atas. Oleh karena itu metode ini memiliki efek matriks
signifikan. Kelebihan besar tetrahydrouridine (THU) sudah ditambahkan ke sampel actual dan
sampel validasi untuk mencegah konversi enzimatik dari Gemcitabine menjadi bentuk
metabolitnya. Selain validasi plasma manusia, metode ini crossvalidated pada anjing, tikus,
minipig, dan tikus kecil menggunakan kalibrator plasma manusia.
Validasi Metode Bioanalitikal
Tentukan fase gerak
menggunakan
sumber APCI

Sensitivitas rendah

80/20

80/20

80/20

80/20

MeOH/5 mM
CH3COONH4

ACN/5 mM
CH3COONH4

MeOH/1%/CH3COOH

ACN/1%/CH3COOH

Sensitivitas medium

Sensitivitas tinggi

Sensitivitas rendah

60/40

95/5

60/40

95/5

MeOH/5
mM/CH3COONH4

MeOH/5
mM/CH3COONH4

ACN/5
mM/CH3COONH4

ACN/5
mM/CH3COONH4

Sensitivitas rendah

Sensitivitas tinggi

Sensitivitas medium

Sensitivitas rendah

40/50

100%

MeOH/5
mM/CH3COONH4

ACN

Bagan diatas ini merupakan bentuk decision tree (pohon keputusan) dengan tahap-tahap
Sensitivitas dalam
tinggi

Sensitivitas
pengembangan metode sistematik untuk memilih
suatubagus
senyawa sebagai fase gerak

dengan melihat sensitifitas yang terbaik di LC-MS/MS menggunakan sumber APCI (sumber

Atmospheric pressure chemical ionization) dan mengurangi efek matriks. Contoh Fase gerak
yang diuji sensitivitas pada bagan di atas adalah MeOH/5mM, MeOH/1%, ACN (Asetonitril) /
5mM dan ACN/1%. Keempat fase gerak tersebut diuji sensitivitasnya masing-masing dengan
fase diam (pelarutnya) yang sama yaitu CH2COONH4 dengan masing-masing perbandingan
MeOH/5mM CH2COONH4 (80/20); ACN/5mM CH2COONH4 (80/20), MeOH/1% CH2COONH4
(80/20) dan ACN/1% CH2COONH4 (80/20). Hasilnya MeOH/5mM CH2COONH4 (80/20)
dengan sensitivitas medium ; ACN/5mM CH2COONH4 (80/20) dengan sensitivitas tinggi ; dan
MeOH/1% CH2COONH4 (80/20) dan ACN/1% CH2COONH4 (80/20) dengan sensitivitas rendah.
Kemudian yang diambil adalah sensitivitas medium dan sensitivitas tinggi untuk diuji lagi.
Sensitivitas medium dibuat 2 perbandingan yaitu MeOH/5mM CH2COONH4 (60/40) dan
MeOH/5mM CH2COONH4 (95/5) sedangkan sensitivitas tinggi dibuat juga dua perbandingan
ACN/5mM CH2COONH4 (60/40) dan ACN/5mM CH2COONH4 (95/5). Hasilnya diperoleh
MeOH/5mM CH2COONH4 (60/40) dengan sensitivitas medium, dan MeOH/5mM CH2COONH4
(95/5) dengan sensitivitas rendah sedangkan ACN/5mM CH2COONH4 (60/40) dengan
sensitivitas rendah dan ACN/5mM CH2COONH4 (95/5) dengan sensitivitas tinggi. Maka
dilanjutkan lagi uji sensitivisitasnya yaitu dengan MeOH/5mM CH2COONH4 (60/40) dengan
sensitivitas medium dan ACN/5mM CH2COONH4 (95/5) dengan sensitivitas tinggi. Kedua
perbandingan ini akan diubah konsentrasinya untuk MeOH/5mM CH2COONH4 (40/60) dan
ACN/5mM CH2COONH4 (95/5) menjadi ACN 100%. Hasilnya MeOH/5mM CH2COONH4
(40/60) dengan sensitivitas tinggi dan ACN 100% dengan sensitivitas paling bagus.

Gambar 8.2 dan 8.3 merupakan pengembangan metode sistematik fase gerak menggunakan
eksperimen infusi (percobaan fase gerak dengan infus). Tujuan infus untuk melihat sensitifisitas
fase gerak di LC-MS/MS menggunakan sumber APCI ( sumber Atmospheric pressure
chemical ionization) dan mengurangi efek matriks. Fase geraknya pada gambar 8.2 yaitu ACN
100%, 95%, 60%, dan 100% sedangkan untuk gambar 8.3 fase geraknya MeOH 100%, 60%, dan
40%. Hasilnya menunjukkan ACN dengan konsentrasinya paling tinggi 100% memiliki
sensitifitas yang tinggi sedangkan MeOH dengan konsentrasi 40% (rendah) memiliki
sensitifisitas yang tinggi. Namun antara ACN 100% dan MeOH 40% yang memiliki sensitifitas
yang lebih tinggi adalah ACN 100% yang dapat dilihat panjang pick masing-masing konsentrasi
yaitu pick metabolit dan parent (senyawa induk) dari ACN dibandingkan dengan Pick metabolit
dan parent dari MeOH

Run time adalah 3,5 menit menggunakan 96,5: 3,5 asetonitril/1mM amonium acetateas sebagai
fase gerak. Hanya puncak yang tinggi (meningkat-ningkat) yang dikumpulkan; dan sisanya
dialihkan untuk limbah (diverted to waste).

Tabel (8.1) diatas menunjukan tentang akurasi dan presisi Interbatch dari Gemcitabine
dan metabolit yang terdeaminasi yang terdapat dalam sampel-sampel plasma manusia yang

dilutionkan (pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan) dengan larutan plasma dan air.
Pada parent dan metabolit,interbatch % RE untuk Gemcitabine adalah 2,67 untuk 10
pengenceran dan 0,68 untuk 100 dilusi dalam plasma dan 2,97 untuk 10 pengenceran dan
1,34 untuk 100 pengenceran dalam air.

Total recorvery, efisiensi ekstraksi dan efek matriks untuk (a) gemcitabine dan (b)
metabolit yang terdeaminasi (reaksi kimiawi pada metabolisme yang melepaskan gugus amina
dari molekul senyawa asam amino) dari plasma manusia.

Dievaluasi pada 0,5, 250, dan 500 ng/mL menggunakan kalibrator dalam plasma manusia
dan standar QC pada manusia, anjing, tikus, minipig, dan plasma tikus. Plasma manusia
dilakukan enam replikasi pada setiap tingkat diukur dalam empat batch; plasma hewan dilakukan

enam replikasi pada setiap tingkat diukur dalam satu batch untuk setiap spesies (anjing, tikus,
minipig, mouse). Batas atas maksimum semua tingkat konsentrasi dilaporkan.
(Gambar 8.5) Efek matriks pada recovery itu diminimalkan hanya 5-8,2 % (Tabel 8.2).

Kesimpulan
Metode analisis otomatis ekstraksi fase padat LC-MS / MS telah dikembangkan untuk mengukur
Gemcitabine dan metabolit dideaminasi pada sampel plasma manusia dan hewan. Sejak validasi
bersilang pada anjing, tikus, minipig, dan sampel plasma tikus menggunakan kalibrator plasma
manusia yang berhasil untuk kedua obat induk dan metabolit, kemungkinan menggunakan
kalibrator plasma manusia untuk mengukur analit dalam matriks hewan yang telah ditunjukkan
bersama-sama dengan kemungkinan menggunakan air bukan matriks kosong sebagai pengencer
atau diluen.