Anda di halaman 1dari 47

Pemeriksaan Penunjang Imunologi

(immunoassay)

Putu Oky

A non-specific immunological profile testing

1. Definisi Immunoassay
2. Prinsip Immunoassay
3. Titer
4. Komponen Penting Dalam Immunoassay
5. Macam Immunoassay
6. Imunohistokimia

1. Definisi Immunoassay
Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan
untuk mengukur kuantitas baik antigen atau antibodi
pada sampel (spesimen bilogikal)
Immunoassay dapat digunakan mendeteksi analyte
yang ingin diukur
Analyte sesuatu yg diukur dengan tes
laboratorium dapat berupa Ag atau Ab dalam
serum
Tujuan immunoassay ini adalah untuk mendiagnosa
suatu penyakit, mengukur aktivitas komponen imun
dalam tubuh (komplemen, fagositosis, dst)
4

2. Prinsip Immunoassay
Prinsip immunoassay reaksi ikatan spesifik
Ab-Ag membentuk kompleks Ag-Ab
Utk deteksi Ag pada immunoassays digunakan
baik Ab monoklonal ataupun polikonal sehingga
kompleks Imun (Ag-Ab) tsb dapat diukur secara
kualitatif atau kuantitatif
Serology : metode utk mendeteksi dan mengukur
titer antibodi dalam serum darah dengan
menambahkan Ag spesifiknya
2 tipe Antibodi yang digunakan dlm
immunoassay: poliklonal dan monoklonal
5

Pembuatan Antibodi monoklonal


spesifik

Sel B

Antibodi Poliklonal
Jika hewan coba diimunisasi dengan
protein X (Ag) yg memiliki banyak epitop
terhadap antibodi klon sel B
memproduksi antibodi thd protein X
Antibodi mungkin akan membentuk
sejumlah paratop protein yang berbeda
Campuran Ab yg diproduksi oleh respon
terhadap antigen merupakan antibodi
poliklonal
7

Sampel yang diuji dapat berasal dari :


Antigen sample
Cairan tubuh yang mengandung mikroba
penginfeksi dan toksin mikroba (mengandung Ag)
Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, cairan
amnion, mucous, etc.
Blood antiserum sample
Antiserum/ antisera darah mengandung Ab yang
dibentuk host terhadap infeksi tertentu jika
pasien terinfeksi oleh patogen yang dicurigai maka
pada serumnya akan mengandung Ab terhadap
patogen tsb.
8

3. Titer
Titer : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum
Dapat digunakan untuk menentukan sejauh mana
suatu penyakit mengalami peningkatan pada
infeksinya
Tes Aglutinasi Direct dapat digunakan untuk
mendeteksi titer Ab pada seseorang
Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab sama
sekali lalu Ab meningkat
seroconversion
9

4. Komponen Penting Dalam Immunoassay


a.
b.
c.
d.

Spesifisitas Antibodi
Valensi Antibodi
Aviditas Antibodi
Ukuran Kuantitas reaksi Ag-Ab

10

a. Spesifisitas Antibodi
Ikatan Ag-Ab spesifik key-lock
Namun terkadang terjadi reaksi silang Ab
dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip terjadi
jika kemurnian Ag rendah
Ab yang sangat spesifik : yang memiliki binding site
yang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekul
yang unik
Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi :
1. Spesifisitas Ab yang ditambahkan pd sampel
2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg
mengkontaminasi)
11

b. Valensi Antibodi
Jumlah binding site yang potensial dari Ab
terhadap Ag yg spesifik
Valensi Ab minimal 2 umumnya

12

c. Aviditas Antibodi
Ukuran kekuatan Ab untuk mengikat Ag
Ab dg Aviditas besar kecenderungan
mengikat Ag yang banyak
Aviditas refleksi afinitas (besarnya daya ikat)
dan jumlah binding site (valensi)

13

d. Ukuran Kuantitas Reaksi Ag-Ab


Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahan
tertentu dalam serum harus dapat diukur
dinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu
Beberapa cara penentuan :
1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu
bahan, baik Ab atau Ag dalam serum (uji +
atau -)
cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahan
warna pada penentuan Hbs Ag
14

2. Semikuantitatif : kadar Ab atau Ag pada


serum dengan cara pengenceran serum
secara progresif
Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer
Cth : uji Widal
3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan dengan
membuat kurva baku standar terlebih
dahulu terhadap kekeruhan (OD)
didapat nilai korelasi
Contoh : ELISA
15

5. Macam Immunoassay
Terdapat beberapa metode yang digunakan utk
mendeteksi Ag-Ab, antara lain :
Immunoassay tak berlabel :
a. Uji Presipitasi
b. Uji Aglutinasi
c. Uji Hemaglutinasi
d. Lisis Imun
e. Uji Netralisasi
16

Immunoassay berlabel :
a.
b.
c.
d.

Berlabel Flouresens
Berlabel Radioisotop
Luminescent Assay (LIA)
Berlabel Enzim

17

Immunoasay tak berlabel


a. Uji presipitasi
Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya
Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai :
1. Uji presipitasi lempeng/ slide
cth : uji VDRL mikro
2. Uji presipitasi tabung
3. Uji presipitasi tabung kapiler
cth : uji CRP
4. Uji presipitasi cincin
terbentuk cincin presipitasi (uji +)
5. Imunoelektroforesis
prinsip sama dengan elektroforesis

18

Liquid Precipitation

b. Uji Aglutinasi
Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel
Macam-macam uji Aglutinasi :
1. Uji Aglutinasi lempeng
cth : uji Widal Lempeng deteksi Ab thd S.
Paratyphi
2. Uji Aglutinasi tabung
- Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat
3. Uji Hambatan Aglutinasi
utk menentukan Ag larut yg tdk diketahui
identitasnya
cth : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive
Hemagglutination Test) utk penentuan
HBs Ag
20

c. Uji Hemaglutinasi
Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah
Sel darah diaglutinasikan karena antigen yang ada
pada darah
Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah
Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tes
agutinasi
Cth : uji penentuan golongan darah
Jika darah memiliki Ag bergolongan A
aglutinasi jika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A
21

Viral Hemagglutination
Beberapa virus dapat mengaglutinasi RBC :
Mumps, measles, influenza
Jika Ab mengikat virus lebih dahulu maka
selanjutnya virus tsb tdk dpt menggumpalkan RBC yg
ditambahkan
Test:
Ambil sampel serum dari pasien dan campurkan
dengan patogen virus yg dicuigai (Ag)
Tambahkan darah
Jika terjadi penggumpalan, uji positif atau
negatif ?

Viral Hemagglutination Test

d. Lisis imun dan Fiksasi Komponen


Kompleks imun tidak selalu terjadi antara Abx
terhadap Ag pada permukaan sel
Kompleks imun baru terbentuk jika ditambahkan antiimunoglobulin/ Ab thd Abx
Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen
lisis sel
Macam uji lisis imun :
Uji Fiksasi Komplemen
cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit
Interpretasi : + jika tidak hemolisis
- hemolisis
24

Fiksasi Komplemen
Fiksasi komplemen

Eritrosit

Ag

+
+

+
Hemolisin

tidak hemolisis

Ab
Eritrosit

Ag

+
Hemolisin

c
C - Komplemen

hemolisis

Immunoassay berlabel
1. Berlabel flourescent
Uji immunoflourescent (IFA) ikatan/ kompleks
Ag-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaran
flouresen dibawah mikroskop
Immunoflourecent :
1. Direct immunoflourescent :
Ab dilabel dg marker flourescent Ab secara
langsung diberikan pada jaringan yg diinginkan
2. In-direct immunoflourescent
Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji
dengan Ab sekunder yang berlabel (yang
berikatan spesifik dg Ab pertama)
Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyal
floresen semakin meningkat
26

Direct Immunoflourescent
Fluorescent marker
antibody

antigen

Frozen tissue
section
27

Indirect immunofluorescece
2nd antibody with
label

antigen

1st antibody

28

Immunofluorescence microscopy of kidney glomeruli

29

2. Berlabel radioisotop
uji laboratoris yg sensitif utk penentuan
kadar beberapa bahan (hormon)
Diperlukan sampel dg bahan yg sedikit
sudah dpt terdeteksi
Cth : Uji RIA (Radioimmunoassay)
Radioisotop yg dipakai pada uji RIA : 3H,
14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I
Semakin sedikit Ag pada sampel
semakin sedikit Radioaktif yang ada di
presipitat
30

Prinsip dasar RIA


Ag

I
I
I

+
I

I
I

cuci
Ab pada
sampel

Ag label
radioisotop

Pancaran
radioaktif diukur

3. Berlabel luminescent
uji immunoluminescent (LIA) prinsip sama dg
RIA dan IFA, hanya pada LIA label pada reaksi
Ag-Ab menggunakan luminescent
luminescent : a. bioluminescent : kunang2
b. chemiluninescent
4. Berlabel enzim
pemberian label enzim pada Ag (ELISA)
Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produk
reaksi berwarna (chromogen) intensitas warna
menunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel
Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase
32

ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Prinsip menggunakan reaksi perubahan warna
(Colorimetric assay)
Enzim yg ditambahkan akan bereaksi dengan substrat
memproduksi produk yg berubah warna
Direct
- cth. Pada test kehamilan / test pack (hormon hCG)

Indirect
Test HIV (rapid test)

35

ELISA
iMark Microplate
Absorbance Reader

Micro-plate reader

Positive result

96-well micro-plate

8. Imunohistokimia
Immunohistochemistry (IHC) mengkombinasikan
teknik histologi, imunologi dan biokimia
identifikasi komponen jaringan tertentu dg reaksi
spesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg
penempelan label
Label : flourescent, enzym, hapten, radioaktif
Ab mengikat Ag secara spesifik
Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein pada
jaringan/ organ di preparat/ slide
Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2
selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis
37

Human ovarian Tumor, HE staining


Sediaan tumor ovarium
pada obyek glass
Pada sediaan, ingin
dilihat sel yg apoptosis

label

Pada sel yg apoptosis


trdpt protein Fas L
(sebagai Ag)

Di inkubasi dengan anti


protein FasL (sebagai Ab)
Label akan tervisualisasi
jika ada kompleks Ag-Ab

Apoptotic cell

38

Pemberian Label
Immunolabeling
1. Direct Method
Ab Primer

39

2. Indirect Method

P = peroxidase
AP = alkaline phosphatase
= secondary antibody
= link antibody

40

Aplikasi immunoassay
1. Deteksi hormon polipeptida ; cth : insulin and
glucagon, hCG
2. Deteksi hormon steroid
3. Deteksi agen therapeutic pada pemantauan
terapi obat; dan penyalahgunaan obat
4. Pengukuran enzim , protein dan komponen
terlarut dalam darah lainnya; cth : pengukuran
protein plasma, komplemen
5. Penggunaan penanda penyakit (disease marker)
41

Advantages of Immunoassays :
sensitif untuk jumlah sampel yg rendah (ug/L (ppb)
pemeriksaan cepat
pemeriksaan relatif mudah dilakukan
Pemeriksaan dapat dilakukan dimana saja (dg alat
penunjang)
Disadvantages of Immunoassays:
reaksi silang /cross reaction Ab mungkin dapat
berikatan silang dg struktur Ag yg serupa
Relatif susah untuk menganalisa larutan yang bermacammacam

Pemeriksaan Alergi
Terdapat beberapa tes digunakan untuk mendiagnosa
pemicu alergi, antara lain : skin test dan blood test
Skin test :
Alergi :
Diagnosa alergi bergantung pada rekam medis
seseorang
Rekam medis, pemeriksaan fisik akan mengarahkan
pada tes sensitivitas Ig E, selain itu perlu dilakukan Skin
test
Skin-prick testing (SPTs) menggunakan ekstrak dari
alergen yang dicurigai metode yg sering digunakan
utk melihat sensitifitas / alergi yang dimediasioleh IgE
43

Lanjutan..
Blood test
Blood test : Ig E total digunakan pada awal
diagnosa alergi, tetapi ada keterbatasannya
yaitu IgE akan meningkat selain pada reaksi
alergi, juga pada kondisi non alergi spt infeksi
oleh parasit.
radioallergosorbent test(RAST) : mengukur
alergen- IgE spesifik thd alergen di serum
pasien in-vitro
RAST test saat ini digantikan dg ImunoCAP, krn
kurang sensitif
44

Skin-Prick Test

45

Pustaka
Baratawijaya, 29, Imunologi dasar, edisi 9, UI
Press.
Bush, RK., Diagnostic Test and AllergyChapter 1
Handojo, I., 2003, Pengantar Imunoasai Dasar,
Airlangga University Press, Surabaya
Zabriskie, JB., 2009, Essential Clinical :
Immunological Techniques, Cambridge
University Press
46

47