Anda di halaman 1dari 64

Penanganan

Awal
Sampel

Senyawa Aktif seperti Obat memiliki


peran penting dalam tubuh kita,
terutama saat penyembuhan penyakit
Sampel Biologis adalah sample yg
diambil dari sebagian tubuh untuk
tujuan analisis , misalnya blood/darah,
urine, stomach contents ( including
stomach washing and vomit/muntah),
liver/hati, bile/empedu, brain, kidneys,
meat, hairs, atau bagian tubuh.

Penyiapan sampel
Pemisahan senyawa dari
cuplikan/sampel biologis (urin, darah,
feses)
Analisis senyawa aktif

Spektrofotometri, kromatografi, RIA, dll

Analisis senyawa aktif dalam sampel biologi


mempunyai berbagai tujuan:
1. Untuk mengetahui/menetapkan adanya atau
jumlah senyawa endogenik tertentu: kimia klinik
untuk tujuan diagnosa.
2. Untuk menetapkan adanya atau jumlah senyawa
exogenik ( berasal dari luar tubuh):analisis
metabolit, doping, keracunan, kesetaraan dan
ketersediaan hayati suatu obat.
3. Untuk memantau penggunaan obat baik dalam
analisis farmakodinamik, pemantauan maupun
kepatuhan pasien

Berbagai kendala perlu diperhatikan dalam analisis


senyawa aktif dalam sampel biologi yaitu:
1. Kadar analit biasanya rendah, oleh karena itu
perlu metode analisis yang sensitif.
2. Dalam sampel biologi biasanya mengandung
berbagai senyawa baik endogen maupun exogen
yang dapat mempengaruhi hasil analisis. Oleh
karena itu perlu analisis yang selektif atau
dilengkapi dengan teknik pemisahan sebelum
dilakukan analisis

cuplikan/sampel biologis

Darah
- plasma
- serum
Urin
Saliva
Dll

SAMPEL
DARAH

Pengumpulan sampel darah


(phlebotomy)
Ada 3 cara:
tusukan vena (venipuncture)
tusukan kulit (skinpuncture)
tusukan arteri atau nadi

Ada dua cara dalam pengambilan


darah vena, yaitu cara manual dan
cara vakum.
Cara manual dilakukan dengan
menggunakan alat suntik (syring)
sedangkan cara vakum dengan
menggunakan tabung vakum
(vacutainer).

Yang tidak boleh diambil


darahnya
Darah edema
Hematoma
Daerah dimana darah sedang
ditransfusikan
Daerah bekas luka
Daerah intravena lines (tempat infus)

Pengambilan Sampel Darah


Diambil dari venipuncture
(vena)
Alat : syringe / vacutainer
apparatus / kateter vena
Volume sesuai kebutuhan
biasanya 5 15 mL
Mula-mula bagian atas
lengan diikat (torniquet)
dioleskan antiseptik
pengambilan sampel darah
dengan hati-hati

Darah vena tepi


biasanya diambil
dari lekuk siku.

Vena punggung
tangan juga dapat
digunakan, tetapi
kurang disukai.

Penanganan Sampel Darah ...


pengumpulan, penanganan,
penyimpanan, dan penandaan
contoh sampel darah yang
tepat akan meningkatkan hasil
analisis yang dilakukan.
sampel harus dianalisis segera
atau disimpan dengan teknik
penyimpanan yang sesuai
prosedur, semakin lama
serum/plasma bersentuhan
dengan eritrosit, semakin
besar penurunan kadar obat

penanganan
Sampel darah jangan digojog
karena bisa terjadi hemolisis
darah yang dianalisis dapat
berupa : darah total, serum,
plasma, fraksi bebas protein
jika obat yang akan dianalisis peka
terhadap degradasi enzim, maka
segera didinginkan atau degradasi
enzimnya.

Secara umum dikenal 4 macam


turunan sampel darah vena :
- Darah total (whole blood)
- Serum
- Plasma
- Fraksi bebas protein

Komposisi darah
Whole Blood
Plasma

Serum
Fibrinogen

Unsur-unsur cellular (cell)

Eritrosit
Leukosit
Platelet (trombosit)

Komposisi darah
Darah terdiri daripada beberapa jenis korpuskula
yang membentuk 45% bagian dari darah, angka
ini dinyatakan dalam nilai hermatokrit atau
volume sel darah merah yang dipadatkan yang
berkisar antara 40 sampai 47. Bagian 55% yang
lain berupa cairan kekuningan yang membentuk
medium cairan darah yang disebut plasma darah
serum darah atau plasma terdiri atas:
Air: 91,0%
Protein: 8,0% (Albumin, globulin, protrombin dan
fibrinogen)
Mineral: 0.9% (natrium klorida, natrium bikarbonat,
garam dari kalsium, fosfor, magnesium dan zat besi,
dll)
Garam

Serum dan Plasma Darah


Untuk mendapatkan serum :
darah utuh didiamkan 20
menit , disentrifuge kemudian
diambil beningannya
Untuk mendapatkan plasma :
Darah utuh + antikoagulan
disentrifuge, diambil
beningannya
Penggunaan plasma untuk
analisis lebih sering dipakai
karena jumlah obat lebih banyak
(bebas & terikat protein plasma)

Perbedaan plasma dengan


serum
Plasma = diperoleh dengan
menambahkan suatu pencegah
penjedalan ke dalam darah.
Serum = plasma yg
fibrinogennya telah
dihilangkan dengan proses
penjedalan.

Bila darah
tidak diberi
antikoagulan
terjadilah
penjedalan,
bila
diputarkan,
maka
beningannya
adalah serum.

Analisis sampel plasma


darah dikumpulkan dalam tabung
yang berisi anti koagulan
Anti koagulan :
heparin (garam Na)
kalium oksalat (1 mg K2C2O4 / mL
darah)

Plasma dan Serum


Sampel plasma dan serum
yang baru saja disentrifugasi akan disimpan,
gunakan aturan berikut :
1. Pada suhu kamar, 6 jam, tidak terjadi

peru-bahan metabolit atau enzim


2. Pada suhu 4 0C, 24 jam , plasma dan
serum dapat disimpan tertutup, tanpa
perubahan
3. Untuk penyimpanan dalam waktu
yang lama, sampel dapat dibekukan
atau diliofilisasi (freeze drying)

Sampel Darah

SAMPEL URINE

Sampel Urine
Untuk studi obat atau metabolitnya melalui
ginjal
Mudah dilakukan & banyak
lama dan selang waktu penampungan urin
sesuai dengan karakteristik obat yang akan
diuji
Umumnya tidak mengandung lipid dan protein,
mudah diekstraksi menggunakan pelarut
organik.

Pengertian Urin
Air seni alias air kencing atau urin
adalah cairan sisa yang dilepaskan
oleh ginjal, yang kemudian
dikeluarkan dari tubuh melalui proses
urinasi (berkemih). Ekskresi urin
diperlukan untuk membuang
molekul-molekul sisa dalam darah
yang disaring ginjal dan untuk
menjaga kestabilan cairan tubuh.

Ginjal merupakan organ yang penting


dalam pengaturan kadar cairan tubuh,
keseimbanganelektrolit dan pembuangan
metabolit-metabolit sisa dan obat dari
tubuh.
Kerusakan atau degenerasi fungsiginjal
akan mempunyai pengaruh pada
farmakokinetika obat. Beberapa
penyebab yang umum dari kegagalan
ginjal yaitu penyakit, cidera dan
intoksikasi obat

cara pengambilan sampel


urin

Urin sewaktu: urin dikeluarkan pada waktu yang tidak ditentukan


secara khusus.
Tujuan :
Untuk pemeriksaan urin : volume, makroskopi (warna, kejernihan
urin) dan urin lengkap.

Urin pagi: urin yang pertama-tama dikeluarkan di pagi hari setelah


bangun tidur
Tujuan :
Untuk pemeriksaan sedimen, berat jenis, protein, dan test
kehamilan berdasarkan HCG (Human Chorionic Gonadotropin).

Urin postprandial ; urin yang pertama kali dikeluarkan 1,5 3 jam


sehabis makan. Tujuan :
Sampel ini berguna untuk pemeriksaan glukosuria.

Urin 24 jam: urin yang dikumpulkan selama 24 jam dalam botol


besar yang bersih dan diberi bahan pengawet.
Tujuan :
Untuk menentukan kuantitas suatu zat dalam urin.

Pengujian umum

Color
Clarity
Odor
Specific gravity.
pH
Protein.
Glucose.
Nitrites.
Ketones.
Microscopic analysis (Red or white
blood cells, Casts, Crystals, Bacteria,
yeast cells, or parasites.)

warna urin
Kuning: Zat warna normal dalam jumlah besar:
urobilin, urochrom. Zat warna abnormal:
bilirubin. Pengaruh obat-obat: santonin,
riboflavin, atau pengaruh permen.
Indikasi penyakit: tidak ada (normal).
Hijau : Zat warna normal dalam jumlah besar:
indikan (indoxilsulfat). Pengaruh obat-obat:
methyleneblue, evans blue. Indikasi penyakit:
obstruksi (penyumbatan usus kecil).
Merah: Zat warna normal dalam jumlah besar:
uroerythrin. Zat warna abnormal: hemoglobin,
porfirin, porfobilin. Pengaruh obat-obat: santonin,
amidopyrin, congored, atau juga zat warna
makanan. Indikasi penyakit: glomerulonefritis
akut (penyakit ginjal), kanker kandung kencing.

Cokelat
Zat warna normal dalam jumlah besar: urobilin.
Zat warna abnormal: bilirubin, hematin,
porfobilin. Indikasi penyakit: hepatitis.
1. Cokelat tua atau hitam
Zat warna normal dalam jumlah besar: indikan.
Zat warna abnormal: darah tua, alkapton,
melamin. Pengaruh obat-obat: derivat fenol,
argyrol. Indikasi penyakit: sindroma nefrotika
(penyakit ginjal).
2. Serupa susu
Zat warna normal dalam jumlah besar: fosfat,
urat. Zat warna abnormal: pus, getah prostat,
chylus, zat-zat lemak, bakteri-bakteri, protein
yang membeku. Indikasi penyakit: infeksi
saluran kencing, kebocoran kelenjar limfa

Penanganan Sampel Urine


wadah penampung urine
harus inert dan bebas dari
bahan pengganggu analisi
untuk menghindari
kontaminasi mikroba urin
dapat disimpan dalam lemari
pendingin
untuk analisi biasanya
diperlukan 1015 ml urine
hasil penetapan obat dari
urine memberi informasi
yang penting tentang
timbunan obat dalam tubuh

Gambaran yg teramati pd
analisa obat dalam urin

T obat
Kec ekskresi
Kec eliminasi
% obat yang di metabolisme
% obat yang diekskresi

Sampel Urin

Sampel Feses
Untuk studi
metabolisme
kesetimbangan massa,
dan analisis obat dan
metabolitnya yang
terlihat di empedu
Mudah & banyak
dalam analisis perlu
diperhatikan
homogenasi dari feses
untuk dianalisis
selanjutnya

Feses:
ditampungmenggunakanallumi
nium
foil
*Liofilisasi
*Banyakprotein
*Materialpadatbanyak

Contoh pengujian
Alergi atau peradangan di tubuh, untuk
evaluasi terhadap alergi protein susu pada
bayi.
Infeksi, yang disebabkan oleh beberapa jenis
bakteri, virus, atau parasit yang menyerang
sistem pencernaan.
Masalah pencernaan seperti malabsorpsi
tertentu seperti gula, lemak, atau bahan gizi
lainnya.
Perdarahan di dalam saluran gastrointestinal.

Sampel Saliva
Orang normal mampu
memproduksi saliva lebih
dari 2 L dalam sehari.
Sebagai alternatif jika tidak
memungkinkan mengambil
darah
Mengandung obat dalam
bentuk tidak terionisasi &
tidak terikat protein
Tratmen untuk analisis lebih
mudah dan sederhana.

Pengambilan Sampel Saliva

Dlmfarmakokinetikklinik:monitoringdanpe
netapan
aturandosistheofilindilakukanmonitoringk
adarobatdalamdarahdenganmenggunaka
nsamplesaliva.
Saliva:harusdiketahuirasiokadarsaliva/pla
sma
Bbrpobatdiketahuiratiokadarsaliva/plasm
akonstan
Jumlahobatyg diekskresikan kesaliva
berhubungan dengan
derajadionisasidlmpHfisiologis
danprotein-binding
Bentuk obat takterionkanakanterdapat
paling banyak
Terapetikindekteofilinsangatsempit

Deproteinisasi

Bagian darah yg tertinggal setelah


komponen sel & protein plasma
dihilangkan. Fraksi ini mengandung
bahan yg tidak terikat pd protein plasma
(elektrolit, glukosa, dll).
Pengukuran kadar obat dalam fraksi
bebas protein berguna untuk
menentukan senyawa bebas dan yang
terikat pd protein.
Fraksi ini didapat dengan cara
ultrafiltrasi, yg membiarkan air dan
molekul kecil menerobos lewat
penyaring, sedangkan molekul besar
(albumin dan globulin) tertahan.

Deproteinisasi

Mengapa Sampel
Perlu
Di-Deproteinisasi
???

Deproteinisasi
Metode yang paling
umum
digunakan adalah :
Pengendapan protein
sebagai garam yang
tidak
larut

Pengaruh pH
Protein

pH rendah ( asam kuat )

pH tinggi ( basa kuat )

muatan positif
negatif

muatan

Pengaturan pH
Sampel (protein)

Sampel (protein)

pH larutan <

pH larutan >

titik isoelektrik

titik isoelektrik

protein sbg kation

protein sbg anion

bereaksi dng
anion ttt.
membentuk garam
tak larut

bereaksi dng kation


ttt. membentuk
garam tak larut

Precipitating Agents
Anionik

pikrat

molibdat
tungstat
sulfosalisila
t
metafosfat
perklorat
trikloroaset
at

Kationik
Ion-ion
spt. :
-

logam

seng
merkuri
Kadmiu
m
uranium
besi
tembag
a
timbal

berat

(Zn)
(Hg)
(Cd)
(U)
(Fe)
(Cu)
(Pb)

Titik Isoelektrik (TI) adalah


daerah pH tertentu di mana protein
tidak mempunyai selisih muatan atau
jumlah muatan positif dan negatifnya
sama, sehingga tidak bergerak ketika
diletakkan dalam medan listrik.
Pada pH isoelektrik (pI), suatu protein
sangat mudah diendapkan karena
pada saat itu muatan listriknya nol.

Protein akan mengalami perubahan


muatan pd pH di atas & di bawah titik
isoelektriknya. Pada pH di bawah TI
muatan positifnya lebih besar,
sedangkan di atas TI muatan negatifnya
lebih besar. Perubahan muatan
menyebabkan menurunnya daya tarik
menarik antara molekul protein shg
molekul lebih mudah terurai. Semakin
jauh perbedaannya dari TI maka
kelarutan protein semakin meningkat.

Deproteinisasi dgn dehidrasi


Bila sejumlah tertentu air
dihilangkan dari protein

Protein akan mengendap

SENTRIFUGASI

Deproteinisasi

dengan cara dehidrasi

Solvent

Salting out

( suhu rendah )

( protein pada
titik isoelektrik )
+

Asetonitril
Aseton
Metanol
Etanol

Garam
( Na sulfat, Na
sulfit )

(menarik mantel air yg


melingkupi molekul2 protein)

Protein mengendap

Salting out :
kebanyakan protein tidak larut
dalam larutan garam pekat &
mengendap atau didesak
keluar dari larutan dalam
keadaan tidak berubah. Prinsip
ini digunakan utk memisahkan
protein dari darah.

Karakteristik cairan pelarut untuk


mempersiapkan sampel biologis untuk
proses ekstraksi

Alat yang digunakan dalam


bioanalisis
Tersedia dan terjangkau
Sesuai untuk sampel
maupun senyawa yang
dianalisis
Selalu dikalibrasi dengan
baik
Terawat dan memiliki
performa yang baik
Tujuannya :
data yang dihasilkan dari alat
reliabel
data tidak hilang atau
menghasilkan data yang
inaccurate

Sampel biologis
Salivaperludipertimbangkansebagaisampel
yg
idealmengingatpengambilannyatidakinvasiv
dengansyaratapabilakadarobatdalamsaliv
a menggambarkankadarobatdalamdarah.
Cairancerebrospinaljugadapatdigunakansb
g sampel,utamanyauntukobat yang bekerja
diCNS, mengingat kedekatan
fisiologisdengan organtarget, yaituotak
Sampelhayatiyangjarangdianalisiskandung
an
obat/metabolitnyaadalahempedu,keringat,ai
rsusu, airmata.

Beberapapermasalahan
dengansampelbiologis
Pemisahan/isolasianalit: Mudah-tidaknya
sampeldianalisissebanding dengan
fluiditasnya.
Cairancerebrospinalpalingmudahditangani,
sedangdarahutuhdanjaringanorgan/paling
sulit
Untukmeningkatkanfluiditas,sampelhayatiyg
solidatausemisolidseringkalimengalami
prosesmekanis,misalnyahomogenisasidll

StorageforBiologicalSa
mples

Untukmenghindaridekomposisidanperub
ahankimialainBilaobat/metabolitsensitif
thd esterase:pendinginanpd6Cdanatau
penambahanNaFpadasample
ygmengandung eritromosisinpropionat
Apomorfin:pekathdoksidasiolehO2diud
ara.
Pendinginanpada15Cmencegahterbent
uknyaquinonsd4minggu,pendinginansel
anjutnya
tdkmenjaminterjadinyadekomposisikecu
ali denganpenambahanas.askorbat
Pendinginan/pembekuan:mempertahanka
n stabilitasL-DOPAsampai16hari

Plasmadanserummemerlukansentrifugasi
dalam prosesperolehannya,Vacutainer tube
mengandung silikon yangmemudahkan
memisahkan serum/plasma daricorpusculi
Tabungpalstic(Ependorf)biasanyamengand
ung
esterftalatsbgplasticizerdanesterfosfat:
dapat menggangguanalisis
Antikoagulantbiladiperlukan:sitrat,heparin,
EDTAdll(selamatidakterjadiinteraksidenga
n analit)
Pembekuan/frozensegerasetelahpengambil
ansampel sering kalitidakdimungkinkan;
pendinginan sementara denganesdianggap
cukupsebelum dipindahketempat
penyimpanan dalamsuhu beku

Kontroltemperaturpenyimpanan:Kklorazepataka
n
mengalamidekarboksilasimenjadinordiazepamya
ng dipengaruhiolehsuhudanpH
Wadahpenyimpanan:wadahgelaslebihdisukaise
bab
kemungkinanberkurangngnyaanalitdanadanya
plasticiserbiladgplastik
Nitrogliserinterabsorpsiolehwadahplastik,adab
brp obatyg dapatterabsorpsiolehwadahgelas:
dptdiatasidengansililasi
Plastikpunyakelebihantidakmudahpecah,dalam
pengangkutanlebihdisukai
Dalambanyakhalperluverifikasidenganspiked
biologicalsampleutkmengetahuipengaruhwadah
danpenyimpanan

konsentrasi obat adalah elemen penting


untuk menentukan farmakokinetiak suatu
individu maupun populasi konsentrasi obat
diukur dalm sampel biologis seperti air susu,
saliva,plasma dan urin. Sensitivitas, akurasi,
presisi dari metode analisis harus ada untuk
pengukuran secara langsung obat dalam
matriks
biologis.
Untuk
itu
metode
penetapan kadar secara umum divalidasi
sehingga informasi akurat didapatkan untuk
dimonitoring farmkokinteika dan klinik.

obat
dalam
bentuk
aktifnya
harus
berinteraksi dengan reseptor atau tempat
aksi atau sel target,dengan kadar yang cukup
tinggi. Sebelum mencapai reseptor, obat
terlebih dahulu harus melalui proses
farmakokinetik.
Fasa farmakokinetik meliputi proses fasa II
dan fasa III. Fasa II adalah proses absorpsi
molekul
obat
yang
menghasilkan
ketersediaan biologis obat, yaitu senyawa
aktif dalam cairan darah yang akan
didistribusikan kejaringan atau organ tubuh
Fasa III adalah fasa yang melibatkan proses
distribusi, metabolisme dan ekskresi obat,
yang menentukan kadar senyawa aktif pada
kompartemen tempat reseptor berada