III.

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang telah
dilaksanakan di Laboratorium Teknobio-Industri, Fakultas Teknobiologi,
Universitas Atma Jaya Yogyakarta. Penelitian ini telah dilaksanakan mulai
pada bulan Oktober 2013 sampai Januari 2014. Jadwal penelitian dapat
dilihat pada Lampiran 1.

B. Alat dan bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain laminair air
flow ESCO, erlemeyer, petridish, tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas
ukur, gelas beker, panci, pinset, botol kaca, mikroskop RRC L-301,
autoklaf STMN-Y222 OMRON, microwave Panasonic, inkubator
Memmert,

oven,

spektrofotometer

rotary
UV-1800

evaporator

RV06-ML

KIKA

WERKE,

Shimadzu, pipet ukur dan pro-pipet,

mikropipet, tips, jarum ose, jarum tusuk, timbangan elektrik AL204,

lampu spiritus, vortex 37600 Mixer Termolyne, kertas payung, plastik
wrap, karet, label, tabung Durham, blender Maspion MT-1207, ayakan,
trigalski, pembolong kertas, aluminium foil, corong, kertas saring, tissue,
korek api, dan kamera digital Canon.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain daun
pohpohan segar sebanyak 1 kg yang berasal dari perkebunan Ibu Ade yang

26

27

berada di Tamansari, Ciapus-Bogor, isolat Escherichia coli, dan

Streptococcus aureus, ampisilin 500 mg, etil asetat teknis, n-heksan teknis,
methanol, akuades steril, alkohol 70%, medium Nutrient Agar, medium
Nutrient Broth, pati, cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, cat Gram D,
cat nigrosin, minyak emersi, H2O2 3%, medium glukosa cair, medium
sukrosa cair, medium laktosa cair, larutan phenol red, medium casein, eter,
larutan erlich, deterjen, akuades, metanol 30%, kloroform, amoniak,
larutan Dragendorf, larutan Meyer, larutan Wagner, eter, larutan
Lieberman, dan asetat anhidrat.

C. Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial
dengan perlakuan variasi pelarut dan lima (5) kali ulangan pada setiap
perlakuan yang diujikan pada bakteri Escherichia coli, dan Staphylococcus
aureus. Kontrol positif menggunakan ampisilin dan kontrol negatif
menggunakan metanol tanpa ekstrak, etil asetat tanpa ekstrak, dan nheksana tanpa ekstrak. Rancangan percobaan dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 3. Pengaruh Variasi Pelarut Daun Pohpohan terhadap Zona Hambat
bakteri uji.
Bakteri
Jenis Pelarut Pengulangan
E.coli
S.aureus
EE1SA
1
EM1EC
EE2SA
2
EM2EC
Metanol +
EE3SA
3
EM3EC
Ekstrak
EE4SA
4
EM4EC
EE5SA
5
EM5EC
1
EA1EC
EA1SA
Etil asetat +
Ekstrak
2
EA2EC
EA2SA

28

n-heksana +
Ekstrak

Metanol

Etil asetat

n-heksana

Ampisilin

3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5

EA3EC
EA4EC
EA5EC
EH1EC
EH2EC
EH3EC
EH4EC
EH5EC
KM1EC
KM2EC
KM3EC
KM4EC
KM5EC
KA1EC
KA2EC
KA3EC
KA4EC
KA5EC
KH1EC
KH2EC
KH3EC
KH4EC
KH5EC
KP1EC
KP2EC
KP3EC
KP4EC
KP5EC

EA3SA
EA4SA
EA5SA
EH1SA
EH2SA
EH3SA
EH4SA
EH5SA
KM1SA
KM2SA
KM3SA
KM4SA
KM5SA
KA1SA
KA2SA
KA3SA
KA4SA
KA5SA
KH1SA
KH2SA
KH3SA
KH4SA
KH5SA
KP1SA
KP2SA
KP3SA
KP4SA
KP5SA

Keterangan :
EM
= Ekstrak daun pohpohan dengan pelarut metanol
EA
= Ekstrak daun pohpohan dengan pelarut etil asetat
EH
= Ekstrak daun pohpohan dengan pelarut n-heksana
KM = Kontrol pelarut metanol
KA
= Kontrol pelarut etil asetat
= Kontrol pelarut n-heksana
KH
KP
= Kontrol positif ampisilin

D. Pelaksanaan
1. Penentuan waktu pengeringan daun pohpohan
Penentuan waktu pengeringan daun pohpohan dilakukan
dengan suhu optimal pengeringan daun menggunakan oven adalah

29

40oC (Rivai dkk., 2010). Pada proses pengeringan dilakukan

pengukuran setiap 2 jam sekali dengan mengurangi berat awal
sebelum dikeringkan dengan berat setelah kering. Dalam menentukan
berat kering, proses pengeringan dilakukan sampai berat yang hilang
tidak mengalami perubahan yang signifikan.
2. Pembuatan serbuk daun pohpohan (Rivai dkk., 2010)
Daun pohpohan yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu
untuk menghilangan kotoran yang masih menempel pada bahan
kemudian ditiriskan. Daun pohpohan dikeringkan menggunakan oven
pada suhu 40 oC selama 9 jam. Daun yang telah kering kemudian
dibuat serbuk menggunakan blender.
3. Ekstraksi (Korompis dkk., 2010 dengan modifikasi)
Serbuk daun pohpohan sebanyak 50 gram direndam pelarut nheksan, etil asetat, dan metanol masing-masing 500 ml (perbandingan
1:10 (w/v)) direndam selama 24 jam, kemudian disaring sehingga
diperoleh filtrat I dan debris I. Debris I dimaserasi kembali dalam
pelarut dengan perbandingan 1:10 (w/v) selama 24 jam. Setelah itu,
disaring lagi untuk mendapatkan filtrat II dan debris II. Hal yang sama
dilakukan untuk memperolah debris III. Selanjutnya, filtrat I, II, dan
III digabungkan kemudian pelarut diuapkan menggunakan rotary
evaporator.

Suhu

yang

digunakan

untuk

proses

penguapan

menggunakan rotary evaporator sebesar 65 oC untuk pelarut heksan,

30

75 oC untuk pelarut etil asetat dan 60 oC untuk pelarut metanol. Suhu

yang digunakan mendekati titik didih dari masing-masing pelarut.
4. Pembuatan medium pertumbuhan untuk bakteri uji
a. Medium Nutrien Agar (NA) (Johnson dan Case, 2010)
Nutrien Agar (NA) dapat dibuat dengan mencampurkan
1000 ml aquades (distilled water), dengan 5 g peptone, 3 g beef
extract, dan

ditambahkan 15 g agar. Pelarutan bahan-bahan

tersebut dilakukan dengan suhu 100 oC kemudian didinginkan pada

suhu 40 oC hingga agar mengeras. Setelah pembuatan medium,
tahap selanjutnya adalah sterilisasi medium. Sterilisasi yang paling
umum dengan menggunakan panas salah satunya adalah dengan
menggunakan panas bertekanan dengan suhu 121 oC selama 15
menit, dengan tekanan 1 atm atau 15 psi (pounds of pressure).
b. Medium Nutrien Broth Cair (Cappucinno dan Sherman, 2011)
Nutrien broth (NB) Cair merupakan medium komplek
dasar yang dapat dibuat dengan menggabungkan 1000 ml aquades
(distilled water), dengan 5 g peptone yang merupakan protein yang
tidak kompleks sebagai sumber nitrogen, dan ditambahkan ekstrak
daging 3 g yang mengandung turunan dari daging, sumber karbon
organik, nitrogen, vitamin, dan garam anorganik. Setelah
pembuatan medium, tahap selanjutnya adalah sterilisasi medium.

31

5. Sterilisasi alat dan medium (Zimbro dkk., 2009 dengan modifikasi)

Alat-alat dicuci bersih dan dikeringkan, kemudian dibungkus
dengan kertas payung. Medium yang masih cair dimasukan ke dalam
erlenmeyer kemudian ditutup dengan kapas dan kertas payung. Alat
dan bahan yang akan disterilisasi dimasukan ke dalam autoclave dan
dipanaskan pada suhu 121oC tekanan 1 atm (atmosfer) selama 15
menit untuk medium dan 20 menit untuk alat.
6. Indentifikasi bakteri uji
a. Pengamatan morfologi koloni (Cappucinno dan Sherman, 2011)
Biakan mikrobia diambil sebanyak satu ose kemudian
diinokulasikan pada medium NA dengan metode streak plate, dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Setelah 24 jam
dilakukan pengamatan terhadap morfologi koloni yang meliputi
bentuk, tepian, dan kenaikan (elevation) koloni, kemudian difoto.
b. Pengamatan morfologi sel (Cappucinno dan Sherman, 2011)
Gelas benda dibersihkan secara aseptis menggunakan
alkohol. Larutan nigrosin diteteskan pada ujung gelas benda,
kemudian diambil satu ose biakan mikrobia dan dicampurkan pada
larutan nigrosin. Gelas benda yang lain digunakan untuk meratakan
larutan nigrosin yang sudah dicampur dengan biakan mikrobia
dengan cara menarik larutan menggunakan ujung gelas benda ke
bagian lain dari gelas benda hingga terbentuk lapisan. Kemudian

32

ditunggu hingga sedikit mengering dan diamati di bawah

mikroskop perbesaran 100-400 kali, kemudian difoto.
c. Pengecatan Gram (Cappucinno dan Sherman, 2011)
Gelas benda dibersihkan secara aseptis menggunakan
alkohol. Aquades diteteskan sebanyak satu tetes di atas gelas
benda. Satu ose biakan mikrobia diambil dan dicampur tetesan
aquades yang ada di gelas benda, kemudian difiksasi menggunakan
pengeringan udara atau pemanasan dengan api. Biakan yang telah
difiksasi ditetesi secara hati-hati dengan larutan crystal violet
(Gram A) dan dibiarkan selama satu menit. Setelah selesai
dibersihkan dengan akuades, kemudian ditetesi larutan Iodin
mordant (Gram B) dan dibiarkan selama satu menit, kemudian
dibersihkan dengaan akuades. Alkohol 95% (Gram C) dialirkan
tetes demi tetes untuk menghilangkan pewarnaan (decolorize)
sampai menunjukan noda biru, kemudian dibersihkan dengan
akuades. Dilakukan pewarnaan kembali dengan larutan safranin
(Gram D) selama 45 detik, kemudian dibersihkan dengan akuades
dan dikeringkan dengan kertas saring. Hasil pewarnaan diamati di
bawah mikroskop dengan perbesaran 100-400 kali, kemudian
difoto.
d. Uji motilitas (Cappucinno dan Sherman, 2011)
Biakan mikrobia diambil menggunakan jarum steril dan
diinokulasikan dengan cara ditusukkan pada medium agar padat

33

(Nutrient Agar) pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi selama

24 jam pada suhu 37 oC. Setelah 24 jam dilakukan pengamatan
dengan melihat pola pertumbuhan dan penyebaran mikrobia pada
agar padat, kemudian difoto.
e. Uji katalase (Cappucinno dan Sherman, 2011)
Gelas benda dibersihkan secara aseptis menggunakan
alkohol. Satu ose biakan mikrobia diambil dari koloni biakan dan
dipindahkan pada gelas benda yang sudah dibersihkan. Ditetesi
hidrogen peroksida (H2O2) kemudian diamati adanya gelembung
udara atau tidak. Hasil positif menunjukkan adanya gelembung
udara sedangkan hasil negatif tidak menunjukkan adanya
gelembung udara, kemudian difoto.
f. Uji sifat biokimia
Menurut Waluyo (2010) sifat biokimia bakteri dapat diuji
dengan uji fermentasi karbohidrat, uji reduksi nitrat, dan uji
pembentukan indol. Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan
cara, satu ose biakan mikrobia diambil kemudian diinokulasikan
pada medium cair laktosa, dekstrosa (glukosa), sukrosa, kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Setelah 24 jam
dilakukan pengamatan terhadap perubahan warna medium dan
pembentukan gas, kemudian difoto.
Uji reduksi nitrat dilakukan dengan cara, satu ose biakan
mikrobia diambil kemudian diinokulasikan pada medium nitrat cair

34

dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 oC. Setelah 2 hari

dilakukan pengujian adanya nitrit dengan menambahkan 1 ml asam
sulfanilat dan 1 ml -naftalamin dan digojog hingga terjadi
perubahan warna menjadi merah yang menunjukkan hasil positif,
kemudian difoto.
Uji pembentukan indol dilakukan dengan cara, satu ose
biakan mikrobia diambil kemudian diinokulasikan pada medium
triptofan cair atau hidrolisat kasein, kemudian diinkubasi selama 4
hari pada suhu 37 oC. Setelah 4 hari pengujian indol dilakukan
dengan metode Coles dan Onslow (untuk indol dalam bentuk uap),
kapas penutup tabung bagian bawah ditetesi dengan reagen
Ehrlich, kemudian tabung direndam pada suhu 80 oC sehingga
terjadi perubahan warna kapas menjadi merah ungu yang
menunjukkan adanya indol, kemudian difoto.
7. Identifikasi kandungan kimia tumbuhan (Harborne, 1987)
a. Uji Flavonoid
Ekstrak daun pohpohan sebanyak 0,1 g ditambahkan
dengan 5 ml metanol 30 % kemudian dipanaskan selama 5 menit.
Filtrat ditambahkan dengan H2SO4. Hasil positif ditunjukkan
dengan

adanya

perubahan

warna

menjadi

merah

setelah

ditambahkan H2SO4, kemudian difoto.

b. Uji Alkaloid
Ekstrak daun pohpohan sebanyak 0,1 g ditambah dengan 5
ml kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan

35

dan diasamkan dengan 2 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam dibagi

menjadi 3 tabung yang masing-masing ditambah pereaksi
Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Alkaloid pada sampel ditandai
dengan adanya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah
pada pereaksi Dragendof, dan endapan coklat pada pereaksi
Wagner, kemudian difoto.
c. Uji Triterpenoid dan Steroid
Ekstrak daun pohpohan sebanyak 0,1 g ditambah 5 ml
etanol 30 % kemudian dipanaskan selama 5 menit, kemudian
didinginkan dan disaring. Filtrat diuapkan, kemudian ditambah
larutan eter. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi Lieberman
Burchard (3 tetes asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat).
Perubahan warna menjadi merah atau ungu menandakan adanya
triterpenoid sedangkan warna hijau menandakan steroid, kemudian
difoto.
8. Perbanyakan bakteri uji (Cappucino dan Sherman, 2011 dengan
modifikasi)
Kultur mikrobia yang dihasilkan dari tahap uji kemurnian
masing-masing diinokulasikan ke dalam medium NA miring
menggunakan jarum ose secara aseptis, kemudian diinkubasi pada
suhu 37

C selama 24 jam. Selanjutnya, isolat bakteri hasil

perbanyakan diambil sebanyak 1-2 ose kemudian dimasukkan ke

dalam 20 ml medium cair pada Erlenmeyer secara aseptis kemudian
diinkubasi pada shaker incubator selama 24 jam suhu 37 oC.

36

9. Pembuatan kurva standar bakteri (Handayani dkk. 2006 dengan

modifikasi).
Tabung reaksi sebanyak enam masing-masing diisi starter
bakteri uji dan medium nutrient broth dengan perbandingan 0:6; 1:5;
2:4; 3:3; 4:2; 5:1. Kultur bakteri diukur absorbansinya dengan panjang
gelombang optimum masing-masing bakteri E. coli = 580-630 nm,
S. aureus = 580-630 nm), selanjutnya dilakukan perhitungan total
plate count (TPC) pada masing-masing tabung reaksi dan dilakukan
perhitungan untuk mendapatkan rumor regresi linearnya.
10. Pengukuran kurva pertumbuhan bakteri (Johnson dan Case, 2010
dengan modifikasi)
Kultur mikrobia diambil sebanyak 10 ml dan diinokulasikan ke
dalam medium NA cair 100 ml, kemudian diinkubasi selama 24 jam.
Pada saat inkubasi, setiap 2 jam dilakukan pengukuran absorbansi
dengan spektrofotometer. Pengukuran absorbansi dilakukan pula pada
medium NA tanpa bakteri yang disebut kontrol, kemudian medium
NA setelah diinokulasi bakteri sebagai 0 jam, dengan panjang
gelombang optimum masing-masing bakteri (E. coli = 580-630 nm,
S. aureus = 580-630 nm) dan dilakukan perhitungan total plate
count (TPC) pada kultur bakteri dari 0 jam sampai 24 jam, setiap 2
jam (Kusmiati, dan Agustini, 2006; dan Dewi, 2010).
11. Uji antibakteri berdasarkan zona hambat dengan paper disk (Waluyo,
2010)
Kultur mikrobia diambil 0,1 ml diinokulasikan pada medium
NA dengan metode spread plate. Paper disk ditetesi ekstrak daun

37

pohpohan kemudian diletakkan di atas medium sebanyak 4-6 paper

disk secara simetri dengan jarak paling kecil 20 mm dari tepi cawan
petri. Kemudian diinkubasi selama 16-18 jam dengan suhu 37 oC.
Setelah diinkubasi, zona hambat yang terjadi diamati, diukur dan
difoto. Kemudian sebagai pembanding digunakan antibiotik ampisilin
yang dilihat zona hambatnya pada mikrobia uji. Luas zona hambat
dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

Keterangan:
d1
: diameter kertas saring (cm)
d2
: rata-rata diameter zona hambat (cm)
12. Pengukuran Konsentrasi Hambat Minimum (Cappucino dan Sherman,
2011 dengan modifikasi)
Pengukuran Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dapat
dilakukan dengan menggunakan metode seri pengenceran. Tabung
reaksi disiapkan 8 buah untuk setiap pengenceran ekstrak. Masingmasing tabung reaksi diberi label dari 1 sampai 8 pada masing-masing
seri pengenceran ekstrak, kemudian ditambahkan pelarut yang sesuai
dengan ekstrak masing-masing sebanyak 9 ml dari tabung reaksi no 2
sampai 8.
Ekstrak daun pohpohan yang sudah dipekatkan dengan rotary
evaporator dianggap memiliki konsentrasi 100%. Ekstrak daun
pohpohan 100% dimasukkan ke dalam tabung no 1 sebanyak 10 ml,
kemudian diambil dan ditambahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung 2

38

dan dihomogenkan dengan vortex. Dilakukan pengenceran konsentrasi

hingga mendapat konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,625, 1,8125,
dan 0,90625% dengan cara: 1 ml larutan pada tabung 2 diambil dan
dimasukkan ke dalam tabung 3 kemudian divortex. Larutan dari
tabung 3 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung 4 kemudian
divortex, langkah ini diulang hingga sampai pada tabung 8. Pada
tabung 8, 1 ml larutan dibuang agar volume total setiap tabung adalah
9 ml.
Tabel 4. Serial Pengenceran ekstrak daun pohpohan untuk mengetahui
KHM.
Penambahan
(ml):

Nomor Tabung Reaksi

4
5
6
7

Pelarut
Ekstrak
10 1 1
1
1
1
1
1
daun
pohpohan
Presentase
100 50 25 12,25 6,25 3,625 1,8125 0,90625
ekstrak (%)
Volume
9
9 9
9
9
9
9
9
total
Kultur mikrobia diambil 0,1 ml diinokulasikan pada medium
NA dengan metode spread plate. Paper disk ditetesi ekstrak daun
pohpohan kemudian diletakkan di atas medium sebanyak 4-6 paper
disk secara simetri dengan jarak paling kecil 20 mm dari tepi cawan
petri. Kemudian diinkubasi selama 16-18 jam dengan suhu 37 oC.
Setelah diinkubasi, zona hambat yang terjadi diamati, diukur dan
difoto. Kemudian sebagai pembanding digunakan antibiotik ampisilin
yang dilihat zona hambatnya pada mikrobia uji. Luas zona hambat
dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

39

Keterangan:
d1
: diameter kertas saring (cm)
d2
: rata-rata diameter zona hambat (cm)

E. Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan ANAVA dengan
tingkat kepercayaan sebesar 95%. Apabila hasil ANAVA menunjukkan
hasil yang beda nyata, analisis dilanjutkan dengan Duncans Multiple
Range Test (DMRT) untuk mengetahui beda nyata antara perlakuan
(Gazpers, 1994). Analisis ANAVA dan DMRT dilakukan dengan
menggunakan program SPSS 15.0.