Anda di halaman 1dari 21

Di dalam bab ini akan dibicarakan pengertian teknologi DNA rekombinan beserta

tahapan-tahapan kloning gen, yang secara garis besar meliputi isolasi DNA
kromosom dan DNA vektor, pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi,
pembentukan molekul DNA rekombinan, dan transformasi sel inang oleh molekul
DNA rekombinan. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa
diharapkan mampu menjelaskan:
1. pengertian teknologi DNA rekombinan,
2. dua segi manfaat teknologi DNA rekombinan,
3. tahapan-tahapan kloning gen,
4. pengertian dan cara kerja enzim restriksi, dan
5. garis besar cara seleksi transforman dan seleksi rekombinan.
Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok
bahasan ini dengan lebih baik adalah struktur dan sifat-sifat asam nukleat seperti
yang telah dibahas pada Bab II.
Pengertian Teknologi DNA Rekombinan
Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan
organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan
untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an
berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam
mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang
bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah
yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen
tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan
sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan
pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin
paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul
DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan
mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai
sel inang.
Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan
mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan
tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan
diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar
daripada produksi secara konvensional.
Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui
teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1).
Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon,
pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran,
isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan
molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA
rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA
rekombinan.
Isolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang
dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, bekuleleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya
adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang
lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau
dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai
dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukanremukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan
sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut
organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara
enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan
sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk
membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian
dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan
sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (lihat Bab II).
Gambar 9.1. Skema tahapan kloning gen
Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun
DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul
DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid
pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan
mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom
jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat
tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap

denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi
kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat
pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul
DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah
yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian,
perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA
kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat
dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.
Enzim Restriksi
Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik
maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat
ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang
berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk
menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C. Jika l yang telah menginfeksi
strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi
strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama
banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini,
dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1.
Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K,
maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak
1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K
mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun

pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada
strain K.
Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul
DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K.
Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K
juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa
pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan
(recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut.
DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada
siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan
terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus
dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang
diinfeksikan dari strain K ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi
rentan terhadap enzim restriksi.
Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA.
Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga
molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi.
Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim
ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi
tipe I. Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies
bakteri lainnya.
Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan
ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia

mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak
saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan
strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam
tata kerja rekayasa genetika.
Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai
berikut:
1.

mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di

dalam molekul DNA


2.

memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat

tempat pengenalannya
3.

menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan

basa.
Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan
pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Gambar 11.3 memperlihatkan
beberapa enzim restriksi beserta tempat pengenalannya.
Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. Huruf
pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan
huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama
petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal
dari nama strain bakteri, dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim
yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama.

Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa
pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan
menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5 yang runcing karena masingmasing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan
ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung
runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung
kohesif.
Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat
pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya
akan mempunyai ujung 5 yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya
sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan
sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk
menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul
linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk
menyintesis untai tunggal homopolimerik 3.
Ligasi Molekul molekul DNA
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus
menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen
DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor
yang sudah berbentuk linier.
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in
vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi
menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag

T4 atau lazim disebut sebagai enzim T 4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat
digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan
baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang
ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase
untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3. Dengan untai tunggal semacam
ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi
menggunakan DNA ligase.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37C. Akan tetapi, pada suhu
ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan
menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan
tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15C
dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).
Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor,
khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga
plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler
kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi
ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan
konsentrasi tinggi (lebih dari 100g/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase
untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5 pada molekul DNA yang telah
terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3
seperti telah disebutkan di atas.
Transformasi Sel Inang

Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA
genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut.
menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis
menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik
pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi
ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat.
Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA
rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak
terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel
inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami
perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel
dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi
pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami
seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis
pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak
dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium
minimal) dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu
kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya
juga dikembangkan pada transformasi E.coli.
Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium
klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari
bakteriofag l. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan
bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl 2 dapat juga mengambil DNA plasmid.

Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di
dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5C. Perlakuan kejut panas antara 37 dan
45C selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA
dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi
tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi
transformasinya daripada molekul DNA kecil.
Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidaktidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl 2 akan
menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang
kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang
ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase
dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian
diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan.
Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA
rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang
transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel
transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk
mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen
yang diinginkan.
Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang
plasmid (lihat Bab XI). Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi
setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau

berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi
gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan
atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan
kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang
memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan
kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua
dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang
hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat
dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang
pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi
berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang
teknik PCR dapat dilihat pada Bab XII. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara
lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (lihat Bab X).
Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya
keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya
saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak.
Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan
posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa
menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.

Bab ini akan membahas pengertian dan macam-macam vektor kloning, baik yang
digunakan pada sel inang prokariot maupun eukariot. Setelah mempelajari pokok
bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan:
1. pengertian vektor kloning,
2. ciri-ciri plasmid,
3. ciri-ciri kosmid,
4. ciri-ciri bakteriofag, dan
5. ciri-ciri vektor kloning pada khamir dan eukariot tingkat tinggi.
Untuk dapat mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini dengan lebih baik
mahasiswa disarankan telah memahami pokok bahasan tentang dasar-dasar
teknologi DNA rekombinan dan konstruksi perpustakaan gen, yang masing-masing
telah diberikan pada Bab IX dan X.
Pengertian dan Macam-macam Vektor Kloning
Pada Bab IX antara lain telah dibicarakan bahwa transformasi sel inang dilakukan
menggunakan perantara vektor. Jadi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi
sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk
ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen
DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot,
khususnya E. coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu,
vektor YACs dan YEps dapat digunakan pada khamir. Plasmid Ti, baculovirus, SV40,

dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot
tingkat tinggi.
Plasmid
Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda
di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Plasmid tersebar luas di
antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga
lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syaratsyarat berikut ini:
1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel
inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,
2. mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai
masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,
3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah
satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA,
dan
4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di
dalam sel inang.
Salah satu contoh plasmid buatan yang banyak digunakan dalam kloning gen adalah
pBR322. Plasmid ini dikonstruksi oleh F. Bolivar dan kawan-kawanya pada tahun
1977. Urutan basa lengkapnya telah ditentukan sehingga baik tempat marker
maupun pengenalan restriksinya juga telah diketahui. Sayangnya, tempat

pengenalan EcoR I, salah satu enzim restriksi yang sangat umum digunakan,
terletak di luar marker. Oleh karena salah satu marker akan menjadi tempat
penyisipan fragmen DNA asing, maka EcoR I tidak dapat digunakan untuk
memotong pBR322 di tempat penyisipan tersebut. Namun, saat ini telah dikonstruksi
derivat-derivat pBR322 yang mempunyai tempat pengenalan EcoR I di dalam
marker, misalnya plasmid pBR324 dan pBR325 yang masing-masing mempunyai
tempat pengenalan EcoR I di dalam gen struktural kolisin dan di dalam gen resisten
kloramfenikol.
Gambar 11.1. Plasmid pBR322
ampR = marker resisten ampisilin
tetR = marker resisten tetrasiklin
Misalnya saja kita menyisipkan suatu fragmen DNA pada daerah marker resisten
ampisilin dengan memotong daerah ini menggunakan enzim restriksi tertentu selain
EcoR I (mengapa harus selain EcoR I?). Plasmid pBR322 yang tersisipi oleh
fragmen DNA akan kehilangan sifat resistensinya terhadap ampisilin, tetapi masih
mempunyai sifat resistensi terhadap tetrasiklin. Oleh karena itu, ketika plasmid
pBR322 rekombinan ini dimasukkan ke dalam sel inangnya, yakni E. coli, bakteri
transforman ini tidak mampu tumbuh pada medium yang mengandung ampisilin,
tetapi tumbuh pada medium tetrasiklin. Secara alami E. coli tidak mampu tumbuh
baik pada medium ampisilin maupun tetrasiklin sehingga sel transforman dapat
dengan mudah dibedakan dengan sel nontransforman yang tidak mengandung
pBR322 sama sekali. Sementara itu, E. coli transforman yang membawa plasmid
pBR322 utuh (religasi) mampu tumbuh pada kedua medium antibiotik tersebut. Jadi,
untuk memperoleh sel E. coli transforman yang membawa DNA rekombinan dicari

koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di ampisilin. Secara teknis pekerjaan ini
dilakukan menggunakan transfer koloni atau replica plating (lihat Bab X).
Plasmid yang digunakan pada bakteri gram negatif seperti halnya pBR322 tidak
dapat digunakan pada bakteri gram positif. Namun, saat ini telah tersedia plasmid
untuk kloning pada bakteri gram positif, misalnya pT127 dan pC194, yang
dikonstruksi oleh S.D. Erlich pada tahun 1977 dari bakteri Staphylococcus aureus.
Demikian juga, telah ditemukan plasmid untuk kloning pada eukariot, khususnya
pada khamir, misalnya yeast integrating plasmids (YIps), yeast episomal plasmids
(YEps), yeast replicating plasmids (YRps), dan yeast centromere plasmid (YCps).
Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya
yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning
pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan
sebagai vektor kloning. Dua di antaranya akan dijelaskan berikut ini.
Bakteriofag l
Bakteriofag atau fag l merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. coli.
Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya
sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa
genetika. DNA l yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai
ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa
untai tunggal sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga
memungkinkan DNA l untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk
sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut
dinamakan kos.
Seluruh urutan basa DNA l telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu

tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh
karena itu, DNA l tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning.
Akan tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yang memenuhi
syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA
l, yaitu
vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing,
vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang
sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan
menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.
Di antara kedua macam vektor l tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan
karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb. Salah
satu contohnya adalah vektor WES, yang mempunyai mutasi pada tiga gen esensial,
yaitu gen W, E, dan S. Vektor ini hanya dapat digunakan pada sel inang yang dapat
menekan mutasi tersebut.
Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua
tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restrisksi
memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA l di
antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh
fragmen DNA asing. Jika pembuangan segmen DNA l tidak diikuti oleh substitusi
fragmen DNA asing, maka akan terjadi religasi vektor DNA l yang kehilangan
sebagian segmen pada daerah nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan
mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme
seleksi automatis yang dapat membedakan antara sel inang dengan vektor
rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.

Gambar 11.2. DNA bakteriofag l


konformasi linier (di luar sel inang)
konformasi sirkuler (di dalam sel inang)
Bakteriofag l mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik.
Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah transformasi untuk DNA fag) dimulai
dengan masuknya DNA l yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan
mengalami replikasi secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom
sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA l sirkuler, masingmasing DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid
(kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas (packaged) dalam kapsid sehingga
dihasilkan partikel l baru yang akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang
lainnya. Sementara itu, pada fase lisogenik DNA l akan terintegrasi ke dalam
kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang.
Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang.
Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak
(plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh
karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya
plak tersebut.
Bakteriofag M13
Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli. Berbeda dengan l yang
mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai struktur
berupa filamen. Contoh yang paling penting adalah M13, yang mempunyai genom
berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa. Infeksinya pada sel inang
berlangsung melalui pili, suatu penonjolan pada permukaan sitoplasma.
Ketika berada di dalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda sirkuler

yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 salinan. Salinansalinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian bergerak ke
permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA M13 akan terselubungi oleh
membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang infektif tanpa
menyebabkan lisis. Oleh karena fag M13 terselubungi dengan cara pembentukan
kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA asing yang
dapat disisipkan kepadanya. Inilah salah satu keuntungan penggunaan M13 sebagai
vektor kloning bila dibandingkan dengan plasmid dan l. Keuntungan lainnya adalah
bahwa M13 dapat digunakan untuk sekuensing (penentuan urutan basa) DNA dan
mutagenesis tapak terarah (site directed mutagenesis) karena untai tunggal DNA
M13 dapat dijadikan cetakan (templat) di dalam kedua proses tersebut.
Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada DNAnya
yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan restriksinya
pun sangat sedikit. Namun, sejumlah derivat M13 telah dikonstruksi untuk mengatasi
masalah tersebut.
Kosmid
Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA l
dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32
hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid.
Fasmid
Selain kosmid, ada kelompok vektor sintetis yang merupakan gabungan antara
plasmid dan fag l. Vektor yang dinamakan fasmid ini membawa segmen DNA l yang
berisi tempat att. Tempat att digunakan oleh DNA l untuk berintegrasi dengan
kromosom sel inang pada fase lisogenik.
Vektor YACs

Seperti halnya kosmid, YACs (yeast artifisial chromosomes atau kromosom buatan
dari khamir) dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid dan segmen
tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang digunakan terdiri
atas sekuens telomir, sentromir, dan titik awal replikasi.
YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh
karena itu, YACs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia, misalnya gen
penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs
sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada
Proyek Genom Manusia.
Vektor YEps
Vektor-vektor untuk keperluan kloning dan ekspresi gen pada Saccharomyces
cerevisiae dirancang atas dasar plasmid alami berukuran 2 m, yang selanjutnya
dikenal dengan nama plasmid 2 mikron. Plasmid ini memiliki sekuens DNA
sepanjang 6 kb, yang mencakup titik awal replikasi dan dua gen yang terlibat dalam
replikasi.
Vektor-vektor yang dirancang atas dasar plasmid 2 mikron disebut YEps (yeast
episomal plasmids). Segmen plasmid 2 mikronnya membawa titik awal replikasi,
sedangkan segmen kromosom khamirnya membawa suatu gen yang berfungsi
sebagai penanda seleksi, misalnya gen LEU2 yang terlibat dalam biosintesis leusin.
Meskipun biasanya bereplikasi seperti plasmid pada umumnya, YEps dapat
terintegrasi ke dalam kromosom khamir inangnya.
Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens
Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat digunakan sebagai
vektor kloning. Akan tetapi, ada suatu bakteri, yaitu Agrobacterium tumefaciens,
yang membawa plasmid berukuran 200 kb dan disebut plasmid Ti (tumor inducing

atau penyebab tumor). Bakteri A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil


seperti tomat dan tembakau serta tanaman monokotil, khususnya padi. Ketika infeksi
berlangsung bagian tertentu plasmid Ti, yang disebut T-DNA, akan terintegrasi ke
dalam DNA kromosom tanaman, mengakibatkan terjadinya pertumbuhan sel-sel
tanaman yang tidak terkendali. Akibatnya, akan terbentuk tumor atau crown gall.
Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah T-DNA
dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Gen target ini
selanjutnya akan dieskpresikan menggunakan sistem DNA tanaman.
Dalam prakteknya, ukuran plasmid Ti yang begitu besar sangat sulit untuk
dimanipulasi. Namun, ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian
lain plasmid Ti, integrasi dengan DNA tanaman masih dapat terjadi asalkan T-DNA
dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu sel bakteri A. tumefaciens.
Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan fragmen DNA asing hanya dilakukan
pada T-DNA dengan cara seperti halnya yang dilakukan pada plasmid E.coli.
Selanjutnya, plasmid T-DNA rekombinan yang dihasilkan ditransformasikan ke
dalam sel A. tumefaciens yang membawa plasmid Ti tanpa bagian T-DNA.
Perbaikan prosedur berikutnya adalah pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang
terdapat pada T-DNA.
Baculovirus
Baculovirus merupakan virus yang menginfeksi serangga. Salah satu protein penting
yang disandi oleh genom virus ini adalah polihedrin, yang akan terakumulasi dalam
jumlah sangat besar di dalam nuklei sel-sel serangga yang diinfeksi karena gen
tersebut mempunyai promoter yang sangat aktif. Promoter ini dapat digunakan untuk
memacu overekspresi gen-gen asing yang diklon ke dalam genom bacilovirus
sehingga akan diperoleh produk protein yang sangat banyak jumlahnya di dalam

kultur sel-sel serangga yang terinfeksi.


Vektor Kloning pada Mamalia
Vektor untuk melakukan kloning pada sel-sel mamalia juga dikonstruksi atas dasar
genom virus. Salah satu di antaranya yang telah cukup lama dikenal adalah SV40,
yang menginfeksi berbagai spesies mamalia. Genom SV40 panjangnya hanya 5,2
kb. Genom ini mengalami kesulitan dalam pengepakan (packaging) sehingga
pemanfaatan SV40 untuk mentransfer fragmenfragmen berukuran besar menjadi
terbatas.
Retrovirus mempunyai genom berupa RNA untai tunggal yang ditranskripsi balik
menjadi DNA untai ganda setelah terjadi infeksi. DNA ini kemudian terintegrasi
dengan stabil ke dalam genom sel mamalia inang sehingga retrovirus telah
digunakan sebagai vektor dalam terapi gen. Retrovirus mempunyai beberapa
promoter yang kuat.