PEWARNAAN KUMAN

Dian Widiyanti, SSi., MSi., Ph.D

Bagian Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas YARSI

Pemeriksaan mikroskopik kuman

pewarnaan sediaan

Tujuan pemeriksaan mikroskopik adalah :

melihat bentuk/morfologi kuman
melihat struktur sel kuman
mengetahui sifat kuman terhadap zat warna
Zat warna basa, asam dan netral
Zat warna basa (positif/kation berwarna)
asam nukleat kuman kuman terwarnai
Zat warna asam mewarnai latar belakang
sel kuman disebut pewarnaan negatif

Hasil pewarnaan baik harus memperhatikan

hal berikut :
1. preparat/sediaan kuman baik
2. zat warna harus baik/baru
3. waktu harus tepat
Syarat memperoleh sediaan kuman yang baik:
1. kaca/gelas objek bersih & bebas lemak
2. biakan kuman muda (18-24 jam), kecuali
M. tuberculosis.
3. preparat tipis & rata kuman tersebar &
zat warna merata

Sediaan fiksasi dgn api atau etil alkohol

perekatan kuman, kuman mati/kurang berbahaya,
zat warna mudah meresap, sediaan dpt disimpan
Jenis Pewarnaan
Positif
1. Sederhana
2. Diferensial (Gram &
tahan asam)
3. Khusus

Negatif
1. Pewarnaan
negatif

JENIS PEWARNAAN :
1. PEWARNAAN NEGATIF

Yang diwarnai latar belakang

kuman
(back ground) karena
kuman
sukar mengikat zat
warna
Contoh : kuman Spirochaeta dan
simpai/ kapsul kuman

2. PEWARNAAN SEDERHANA
Satu macam zat warna
Hasilnya sesuai dgn zat warna yang digunakan,
biru metilen (kuman berwarna biru), air fuchsin
(merah), ungu gentian (ungu)

Bacillus sp (pew. biru metilen)

Bacillus sp (pew. karbol fuchsin)

3. PEWARNAAN DIFERENSIAL
Dua macam zat warna diferensiasi sifat kuman
terhadap zat warna
Ada 2 (dua) jenis pewarnaan diferensial :
a. pewarnaan Gram
b. pewarnaan Tahan Asam

a. Pewarnaan Gram
Membedakan kuman Gram positif (ungu) dgn kuman
Gram negatif (merah)
Pewarnaan paling penting untuk identifikasi spesies
kuman langkah pertama

 Perbedaan sifat Gram karena perbedaan komposisi

dinding sel kuman

Skema dinding sel bakteri Gram negatif & positif

Preparat difiksasi
Dituang zat warna UKK
(5 menit)
Lugol (45 60 detik)

Kuman berwarna ungu

Terbentuk kompleks
UKK-lugol

Alkohol (30 detik)

Dekolorisasi (Gram neg

tdk berwarna, Gram
pos tetap ungu)

Air fuchsin (1 2 menit)

Warna pembanding
(Gram neg berwarna
merah)

Perbedaaan sifat pewarnaan Gram :

1. Teori Salton
2. Permeabilitas dinding sel

Kuman kokus umumnya bersifat Gram

positif,kecuali Neisseriaceae
Kuman batang/basil umumnya bersifat Gram
negatif, kecuali genus Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium, Listeria, Mycobacterium

Kuman Gram negatif

Kuman Gram positif

b. Pewarnaan Tahan Asam

Diferensiasi kuman bersifat tahan asam dgn tidak
tahan asam
Dinding sel kuman tahan asam disusun terutama
oleh asam mikolat
Ada 3 jenis pewarnaan tahan asam :
1. pewarnaan Ziehl-Neelsen
2. pewarnaan Kinyoun-Gabbett
3. pewarnaan Tan Thian Hok

 Hasil : kuman tahan asam berwarna merah,

kuman tdk tahan asam berwarna biru
Contoh kuman tahan asam : Mycobacterium
tuberculosis dan M. leprae.

Pewarnaan tahan asam

4. PEWARNAAN KHUSUS
Pewarnaan bagian tertentu sel kuman atau kuman yang
tidak dapat diwarnai dgn cara biasa
Jenis pewarnaan khusus, antara lain :
1. Pewarnaan flagel ( Gray, Novel, Zettnow dan FontanaTribondeau)
2. Pewarnaan simpai/kapsul (Muir, Hiss,Gins-Burri)
3. Pewarnaan spora (Klein)
4. Pewarnaan nucleus/inti (Feulgen)
5. Pewarnaan Neisser untuk kuman C. diphtheriae
6. Pewarnaan kuman Spirochaeta (Becker-Krantz dan
Fontana-Tribondeau)

Pewarnaan kapsul

Pewarnaan Neisser

Pewarnaan spora

Pewarnaan flagel

ISOLASI & KOLONI KUMAN

CARA MELAKUKAN ISOLASI

(MEMBIAK/MENANAM) KUMAN
Tujuan melihat/identifikasi koloni kuman untuk identifikasi

spesies kuman, memperbanyak jumlah kuman

serta mendapatkan biakan murni (pure culture)

Pada media cair :

mencelupkan 1 se/sengkelit (inoculating loop) berisi kuman
dalam spesimen/suspensi
dengan pipet tetes, diteteskan beberapa tetes (2-5 tetes)
spesimen/suspensi kuman

Pada media padat :

1. Streak culture (metode goresan)
dengan membuat goresan-goresan pada permukaan
media padat (plat) memakai se yang berisi kuman
(biakan lempeng/plat)
Goresan-goresan dibuat sejajar tdk bersentuhan
supaya terjadi penipisan jumlah kuman, sehingga
diperoleh koloni-koloni terpisah (tdk berhimpitan)
untuk memudahkan identifikasi koloni kuman

2. Slant culture
dengan membuat goresan-goresan pada permukaan
media padat di tabung (permukaannya dibuat
miring) biakan miring
3. Stab culture (biakan tusuk)
dengan cara menusukkan se berisi kuman secara
tegak lurus pada media padat dalam tabung
(misalnya media agar tegak)

4. Pour culture (biakan tuang)

biakan kuman yg dibuat dengan cara mencampurkan
kuman yang akan dibiak ke dalam media agar yang
belum membeku (suhunya tidak terlalu panas sehingga
kuman tidak mati), kemudian campuran tersebut
dituang ke dalam plat dan dibiarkan membeku (dingin)

 Setelah melakukan inokulasi

(penanaman) dilanjutkan dgn
inkubasi (pengeraman) dalam alat
inkubator pada suhu yg sesuai
(biasanya 37C) selama 18-24 jam
(kuman aerob)

Untuk kuman anaerob sebelum

dimasukkan ke dalam inkubator,
dimasukkan dahulu ke dalam
anaerob jar (sungkup anaerob)
untuk menciptakan suasana
anaerob, karena kuman anaerob
tdk dpt hidup pada suasana aerob
(suasana yg terdpt oksigen)

KOLONI KUMAN
Kuman pada media padat membentuk koloni
Koloni kuman
sekelompok/kumpulan kuman sebagai hasil
pertumbuhan dan perkembangbiakan suatu kuman
Koloni kuman dapat dilihat dan diamati berbeda
bentuk dan sifatnya, tergantung jenis kumannya maka
koloni kuman dapat digunakan untuk membantu identifikasi
spesies kuman (langkah kedua)

 Untuk identifikasi koloni kuman, diperlukan

pengamatan suatu koloni yang terpisah tidak saling
berhimpitan koloni terpisah diperoleh dengan cara
inokulasi penipisan goresan yang sejajar tidak saling
bersentuhan

Hal-hal yang diperhatikan dalam identifikasi koloni kuman :

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

ukuran/diameter koloni kuman dlm. mm

bentuk koloni (bulat/menjalar/bersulam /tidak teratur)
penampang permukaan koloni (cekung/cembung/datar)
permukaan & tepi halus (Smooth = S) atau kasar
(Rough = R)
mengkilap/buram (glossy/opaque)
warna koloni (pigmen : putih/kekuningan /kuning emas/
kehijauan/ ungu/merah)
jernih atau keruh
viskositas koloni : lunak seperti mentega, kering, keras,
berlendir/mukoid = M (koloni kuman yg punya kapsul)

9. bila kuman tumbuh pd media agar darah zona

hemolisis.
Jenis zona hemolisis :
> hemolisis (ada zona kehijauan di sekitar koloni)
> hemolisis (ada zona hemolisis jernih transparan
di sekitar koloni)
> hemolisis gamma (tidak ada zona hemolisis di
sekitar koloni)

 kadang-kadang dijumpai koloni yang kerdil (koloni D =

dwarf)
Beberapa contoh koloni berpigmen :
> koloni pigmen merah mis. Serratia marcesens
> koloni pigmen ungu mis. Chromobacterium

violaceum
> koloni hijau mis. Pseudomonas aeruginosa
> koloni kuning emas mis. Staphylococcus aureus
> koloni putih mis. Staphylococcus epidermidis
> koloni kuning kering mis. M. tuberculosis

Serratia
marcescens colony

Chromobacterium
violaceum colony

Pseudomonas
aeruginosa colony

Mycobacterium
tuberculosis colony

Staphylococcus
aureus colony

Staphylococcus
epidermidis colony

 Beberapa contoh bentuk koloni kuman :

> koloni menjalar mis. kuman Proteus vulgaris
> koloni bersulam mis. kuman Bacillus mycoides
> koloni mukoid mis. kuman Klebsiella pneumoniae
> koloni jernih seperti titik-titik air, dgn zona
hemolisis beta mis. Streptococcus pyogenes
> koloni jernih dengan zona hemolisis alpha, mis.

Streptococcus viridans

Koloni mukoid

Koloni menjalar

Koloni rough

Koloni bersulam

Koloni smooth
(Staphylococcus)

Koloni smooth
(Streptococcus)

PERBENIHAN/MEDIA
KUMAN

Manfaat membiak/ isolasi kuman

Tujuan mempelajari koloni kuman guna
mengidentifikasi spesies kuman
Syarat perbenihan/media kuman :
1. mengandung bahan nutrisi, garam, air
yang diperlukan kuman (dalam jumlah
cukup)
2. bebas bahan kimia,dll. yang menghambat
pertumbuhan kuman
3. pH sesuai dengan sifat kuman
4. steril

JENIS-JENIS PERBENIHAN

KONSISTENSI

NUTRISI

1. Cair

1. Sederhana

2. Semisolid

2. Diperkaya

3. Padat

MANFAAT

1. Transport
2. Persemaian
3. Diferensial
4. Selektif
5. Eksklusif
6. Khusus

Jenis media berdasarkan konsistensi :

1. Perbenihan cair
Tempat : botol/tabung
Contoh : air pepton, kaldu nutrient, kaldu darah, kaldu
BHI (brain heart infusion), kaldu thioglikolat.

Bentuk pertumbuhan:
keruh (turbidity)
pellicle mis. Vibrio, Pseudomonas
sedimen mis. Kuman anaerob
granulasi mis. Yersinia

Granulasi

2. Perbenihan semisolid (1/2 padat)

Tempat : tabung
Mengandung 0.5% agar-agar
Contoh : Media untuk melihat gerak kuman dan
media transport

3. Perbenihan padat/solid
Tempat : tabung / cawan Petri (plat)
Bahan pemadat mengggunakan
a. agar-agar 1.5-2.0% (agar-agar murni)
b. serum sapi, kelinci, kuda (mis. Perbenihan
Loeffler untuk kuman C. diphtheriae)
c. telur, mis. Perbenihan Loewenstein Jensen
(mengandung telur bebek) utk kuman
M. tuberculosis
Kuman tumbuh koloni
Koloni berbeda bentuk dan macamnya
membantu identifikasi (langkah ke-dua)

Jenis media berdasarkan nutrisi

1. Perbenihan/media sederhana
Mengandung bahan nutrisi pokok
saja
Contoh : media agar nutrient ( isi :
agar-agar + pepton)

2. Perbenihan/media diperkaya (enriched)

Penambahan bahan tertentu
Contoh :
Darah (agar darah),
Serum (Loeffler)
Telur, cairan ascites, as.Amino esensial,
vitamin, yeast dsb.

Jenis media berdasarkan guna/manfaat :

1. Media transport

Fungsi transport spesimen ke lab.

Bentuk semisolid dalam tabung tertutup (prop
plastik)
Mengandung cukup nutrisi utk kuman kuman tdk
mati
Contoh media Charcoal, Carry-Blair, Stuart, Amies.

2. Media persemaian

Bentuk cair, dalam tabung/botol

Fungsi memperbanyak jumlah kuman ttt
dlm spesimen dgn menyingkirkan
faktor-faktor penghambat
pertumbuhan kuman tsb.

Contoh :
media empedu (Gal/bile) S. typhosa
media air pepton alkalik Vibrio (pH 8.0)
media selenit dan Kauffman kuman enteric

3. Media diferensial
Fungsi untuk membedakan sifat
pertumbuhan kuman, karena
mengandung bahan tertentu
Contoh :
media Agar Darah
diferensiasi kuman berdasarkan sifat
hemolisanya thdp eritrosit
media agar Endo
diferensiasi kuman peragi laktosa
dgn non peragi laktosa

Agar darah

Agar Endo

4. Media selektif
Fungsi membiak kuman yang diinginkan
Mengandung bahan yg menghambat
pertumbuhan kuman yg tdk diinginkan
Contoh
media untuk kuman enteric, mis. Media
SS (Salmonella-Shigella); media WB
(Wilson-Blair)

5. Media eksklusif
Media yang daya seleksinya lebih baik

Contoh :
- media TCBS (thiosulphate citrate bile
sucrose) utk Vibrio

6. Media khusus
Mis. untuk kuman anaerob, kuman Gonococcus,
Leptospira dsb.
Media utk kuman anaerob, a.l. :
a. media thioglikolat mengandung Na-thioglikolat
(reduktor O2) dan rezasurin (indikator O2)
b. media Tarozzi mengandung potongan jaringan
segar, mis. hati (sumber enzim katalase,peroksidase &
superoksid-dismutase)
Media untuk Gonococcus Thayer Martin (mengandung
antibiotik vancomicin, colistin, nistatin)
Media untuk Leptospira EMJH & Korthof (mengandung
albumin serum)

 Kuman anaerob tdk memiliki enzim

yg mengubah H2O2 (bersifat toksis)
sehingga akan mati, karena itu perlu
media khusus dan suasana khusus
(anaerob)