I S O L A S I DAN P E R H I T U N G A N

K U M AN PAT O G E N

Pemeriksaan laboratorium merupakan bagian dari rangkaian pemeriksaan untuk

mengetahui penyebab penyakit, menilai perkembangan penyakit setelah diberikan pengobatan
atau menyakinkan kebenaran penyebab penyakit yang diduga berdasarkan gejala klinisnya
yang khas (gejala pathognomonic).
Untuk

mengetahui

penyakit

infeksi,

diusahakan

isolasi

dan

identifikasi

mikroorganisme dari spesimen (sampel) yang diambil dari penderita. Hasil pemeriksaan ini
dipakai sebagai pedoman dalam pengobatan, perawatan ataupun tindakan lainnya pada
penderita.
Mengingat hasilnya yang sangat penting ini, maka pengambilan dan penanganan
spesimen harus dilakukan dengan benar. Secara umum pemeriksaan yang dilakukan di
laboratorium, adalah :
a. Pemeriksaan mikroskopis
b. Ditanam pada perbenihan buatan, binatang percobaan atau perbenihan jaringan
c. Test serologis
Adapun medium yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorgansime tergantung
dari tujuan isolasi. Untuk isolasi bakteri, misalnya Staphylococcus aureus menggunakan
media MSA, Salmonella dan Shigella menggunakan media SSA, Escherichia coli
menggunakan Mac Conkey/Endo Agar/EMBA/BGLBA, Candida albicans menggunakan
media SDA, Neserria gonorrhoae menggunakan media Coklar Agar, golongan kapang
menggunakan media PDA dll.

PENGAMBILAN DAN PENGIRIMAN SPESIMEN

Pengambilan Spesimen merupakan langkah awal yang penting untuk keberhasilan
isolasi dan identifikasi kuman, karena seringkali kegagalan usaha ini bukan disebabkan
kesalahan teknik di laboratorium, melainkan dalam pengambilan spesimen.
Untuk menghindari kesalahan tersebut, maka pengambilan dan pengiriman spesimen
harus dilakukan sebagai berikut :

1. Pengambilan harus dilakukan sebelum penderita diberi pengobatan antibiotik atau

kemoterapeutika.
Kadang-kadang dokter memberikan obat antibiotik berdasarkan gejala penyakitnya, tanpa
melakukan identifikasi kumannya, sehingga isolasi kuman menjadi sulit atau menjadi
tidak mungkin.

Karena itu, pengambilan spesimen harus dilakkan sebelum obat

diberikan.
2. Pengambilan harus dilakukan pada saat di mana kemungkinan besar kumannya bisa
ditemukan.
Spesimen harus diambil pada saat dimana kemungkinan besar kuman bisa ditemukan.
Misalnya untuk mengisolasi Plasmodiium sp. pengambilan darah harus dilakukan saat
penderita sedang deman. Beberapa laboratorium melakukan pengambilan spesimen 3 hari
berturut-turut untuk memperbesar kemungkinan mendapatkan kumannya.
Beberapa jenis kuman patogen hanya bisa ditemukan pada stadium tertentu dari
penyakitnya. Misalnya Treponema pallidum, sangat mudah di isolasi pada saat stadium
awal sipilis dan sukar sekali ditemukan pada stadium lanjut. T. pallidum dengan mudah
bisa diisolasi dari spesimen yang berasal dari ulcus durum (gejala sipilis primer) dan
langsung dilihat dengan mikroskop Dark Field. Telihat bakteri yang berbentuk spiral dan
dapat bergerak.
3. Pengambilan harus dilakukan pada tempat dimana infeksinya sedang berlangsung.
Spesimen harus diambil dari bagian tubuh yang mengalami infeksi aktif karena kadangkadang kumannya hanya terdapat dibagian tersebut. Misalnya, penyakit karena jamur
Epidhermophyton floccusum yang menyebabkan tinea cruris, jamurnya akan mudah
diisolasi dari bagian kullit yang mengalami infeksi aktif, yaitu pada pinggir dari kelainan
kulitnya.
4. Spesimen harus diambil dalam jumlah yang cukup.
Spesimen harus diambil dalam jumlah yang cukup agar bisa memenuhi kebutuhan
berbagai jenis pemeriksaan yang diperlukan. Misalnya sputum biasanya dibagi menjadi
dua (2) bagian masing-masing 5 cc (ml) untuk perbenihan, sehingga paling sedikit
dibutuhkan 10 cc.
5. Pengambilan harus dilakukan dengan alat dan tempat penampungan yang tepat sebelum
dikirim ke laboratorium.

Alat untuk mengambil spesimen, misalnya kapas untuk apusan (swab) atau jarum suntik
dan tabungnya tidak boleh mengandung daya hidup kumannya. Alat penyimpanan
spesimen untuk pengiriman ke laboratorium harus steril dan terhindar dari kontaminasi
oleh mikroorganisme lain.
6. Harus segera dikirim ke laboratorium untuk analisis.
Spesimen haru segera dikirim ke laboratorium, apabila tidak memungkinkan

harus

disimpan dalam medium khusus dalam pengirimannya agar kuman tetap hidup.
7. Harus disimpan dalam lingkungan atau medium yang tepat sebelum saatnya diproses.
8. Spesimen harus segera diproses agar kemungkinan untuk berhasilnya proses isolasi lebih
besar.

PROSEDUR ENUMERASI/PERHITUNGAN KOLONI

1) Sampel urin dilakukan pengenceran sampai 10-5, dengan cara :
a. 1 mL urin dimasukkan dalam aquadest/garam fisiologis steril 9 mL menggunakan
mikropipet biru (1000 L) sebagai pengenceran 10-1 (I)
b. 1 mL pengenceran 10-1 (I) dimasukkan dalam aquadest/garam fisiologis steril 9 mL
menggunakan mikropipet biru (1000 L) sebagai pengenceran 10-2 (II)
c. 1 mL pengenceran 10-2 (II) dimasukkan dalam aquadest/garam fisiologis steril 9 mL
menggunakan mikropipet biru (1000 L) sebagai pengenceran 10-2 (III) seterusnya
sampai pengenceran 10-5.
2) Dua pengenceran terakhir dilakukan penanaman dengan duplo (masingmasing
pengenceran 2 cawan) pada media Mc Conkey Agar cawan secara spread plate (100 L)
3) Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam pada suhu 370C.
4) Dihitung jumlah pertumbuhan koloni E. coli (koloni sedang, merah bata/tua, smooth,
keping/sedikit cembung) pada masing-masing cawan.
5). Pertumbuhan koloni dihitung dengan metode Total Plate Count (TPC), yaitu :
jumlah koloni (CFU / mL) a x 1 / n x faktor koreksi

Keterangan :
a
: jumlah koloni
n
: faktor pengenceran (10-1, 10-2, 10-3 dst)
faktor koreksi : metode penanaman (Spread plate : 10; pour plate : 1) (Lay, 1994).

A. Escherichia coli

E. coli merupakan flora normal, hidup komersial di dalam kolon manusia dan di duga
membantu pembuatan vitamin K yang penting untuk pembekuan darah.

E. coli dapat

digunakan untuk/sebagai indikator pencemaran air oleh tinja, terutama untuk air yang
digunakan keperluan rumah tangga. E. coli dapat menyebabkan epidemi penyakit saluran
pencernaan, seperti kolera, tipus, disentri dan penyakit cacing.
E. coli juga dapat menyebabkan pneumonia, endokarditis, infeksi pada luka-luka dan
abses pada berbagai organ. E. coli juga merupakan penyebab utama meningitis pada bayi
yang baru lahir dan penyebab infeksi tractus urinarius (pyelonephritis, cystisis). 60-90%
E. Coli menyebabkan ISK
E.coli yang biasanya menyebabkan infeksi saluran kemih ialah jenis O1, O2, O4, O6,
O7. Jenis-jenis pembawa antigen K dapat menyebabkan timbulnya pielonefritis.Terjadinya
gangguan ginjal berhubungan dengan E. coli nefropatogenik yang memproduksi hemolisisn,
dan antigen K merupakan hal penting pada dapat patogenesis infeksi saluran kemih bagian
atas. ini berhubungan dengan adanya fimbria-P. Jumlah E. coli 105 atau lebih CFU/ml urin
adalah bakteriuria signifikan,walaupun pasien bisa simptomatik atau asimptomaik.
Uretra anterior pria dan wanita mengandung sedikit organisme yang berjenis sama
seperti yang terdapat pada kulit dan perinemium yang biasanya terdapat dalam air kemih
normal dalam jumlah 102 104 CFU/mL.
Diagnosis laboratorium :
a) Sediaan
Endapan air kemih yang dipusingkan diperiksa untuk melihat adanya lekosit, sel darah
merah dan kuman.Sedimen ini dibuat sedian Gram untuk melihat adanya sejumlah besar
lekosit dan kuman Gram negative.
b) Biakan
a)

Bahan pemeriksaan dibiakkan pada lempeng agar darah dan lempeng agar Mc
Conkey. Jika ditemukan kuman peragi laktosa, Gram negative, bergerak aktif, indol
positif, merah metal positif, VP negative dan sitrat negative, di duga sebagai E. coli

b)

Jumlah kuman di dalam air kemih yang melebihi 105 CFU/mL dianggap
sebagai infeksi saluran kemih (bakteriuria nyata).

B. Genus Pseudomonas

Genus Pseudomonas terdiri dari sejumlah kuman batang gram negatif, obligat aerob,
berflegella polar satu atau lebih, umumnya tidak meragi karbohidrat dan mudah tumbuh pada
berbagai medium pembiakan. Organisme ini merupakan flora normal di usus dan kulit.
Kebanyakan spesies Pseudomonas tidak menyebabkan infeksi pada manusia, tetapi
kuman ini penting karena bersifat oportunis patogen, dapat menimbulkan infeksi pada
individu dengan ketahanan tubuh yang menurun yaitu penderita dengan luka bakar, orang
sakit berat atau dengan penyakit metabolik, atau mereka yang sebelumnya memakai atau
mempergunakan alat-alat kedokteran.

Infeksinya biasanya gawat, susah diobati dan

kebanyakan antibiotik tidak efektif terhadapnya dan biasanya merupakan infeksi nosokomial.
Beberapa spesies mengandung pigmen. Pseudomonas aeruginosa merupakan satusatunya spesies yang menghasilkan :
1. Piosianin, zat berwarna kebiru-biruan larut dalam kloroform dan air dan mempunyai
aktivitas anti jasad renik,
2. Fluoresein, zat yang berwarna kehijau-hijauan berfluoresensi, larut dalam air tidak dalam
kloroform.
Selain reaksi biokimia, karakteristik laboratorium yang banyak digunakan ialah percobaan
oksidasi, dimana P. aeruginosa memberikan hasil yang positif.
Pseudomonas aeruginosa dapat menimbulkan infeksi pada saluran pernafasan,
kandung kencing, telinga, kulit dan pada luka-luka yang disebabkan terbakar atau luka
operasi. Bakterinya dapat diketemukan di dalam sputum, urine, darah, feses, pus, secret
telinnga. Juga di dalam makanan, minuman dan air.
Pemeriksaan :
Morfologi :
Gram negative (-) batang, lurus atau bengkok, tidak berspora, tidak berkapsul, bergerak aktif
dengan flagella polar/lopotrik.

Kultur dan Biokimia :

Mudah tumbuh dengan menggunakan medium biasa, strength aerob, tidak meguraikan gula,
katalase positif dan pada umumnya oksidase positif.
Blood Agar plate

: koloni

besar,

putih

abu-abu,

smooth/rough,

keeping,

haemolitis/anhaemolitis, ada yang membuat pigment hijau-biru

Mac Conkey Agar plate : koloni sedang, jernih/keruh, smooth, kadang-kadanng sedikit
kehijau-hijauan, keeping, tepinya tidak rata, tidak menguraikan
gula lactose
Cetrimide Agar

: tumbuh, memproduksi pigment hijau-biru

Nutrient Agar

: tumbuh, memproduksi pigment hijau-biru

TSIA

: lereng : merah, dasar : merah

Reaksi positif

: oksidase, katalase, motil, simmons citrate, arginin dihydrolisa,

gelatine, reduksi nitrat, pertumbuhan pada 42OC

Reaksi negative

: ONPG, D-nase, amylase, lysine dekarboksilase, ornithine

dekarboksilase, aesculine hidrolisa

Pewarnaan GRAM
Dalam pewarnaan gram bakteri diberi zat warna lebih dari satu macam dan diberikan
secara berurutan.

Melalui pewarnaan gram, bakteri dapat dikelompokan menjadi dua

kelompok yaitu : (1). Gram positif, dinding sel akan berwarna ungu dan (2). Gram negatif,
dinding sel akan berwarna merah.
1. Buat preparat ulas dari suspensi kuman seperti : E. coli, S. aureus, S. typhi dll.

2. Lakukan fiksasi dengan hati-hati

3.

Genangi preparat dengan kristal ungu dan dibiarkan selama 30 detik

4. Cuci dengan air mengalir dan dikeringkan

5. Genangi preparat dengan kalium iodida dan dibiarkan selama 45 detik
6. Cuci dengan air mengalir
7. Cuci dengan alkohol aseton sampai warna ungu hilang dan dikeringkan
8. Genangi preparat dengan safranin dan dibiarkan selama 30 detik
9. Cuci dengan air mengalir dan dikeringkan
10. Amati preparat dengan mikroskop.