III.

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia dan Biokimia Pangan,
Laboratorium Nutrisi Pangan, Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas
Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya. Penelitian ini dimulai pada bulan Juli
September 2015.
3.2 Bahan dan Alat
3.2.1 Bahan
Bahan utama yang diperlukan pada penelitian ini adalah buah maja
(Crescentia cujete) yang didapatkan dari pohon maja yang berada di tepi jalan
depan Fakultas Hukum Universitas Brawijaya. Sedangkan bahan lainnya yang
digunakan untuk proses ekstraksi dan pengujian total senyawa bioaktif
antioksidan, total fenol dan total flavonoid diperoleh dari toko Panadia dan
Makmur Sejati, Malang. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 95%, kertas
saring halus, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) 0,2 mM, asam galat, asam
askorbat 0,01 mM, folin-ciocalteau 10%, Na2CO3 7,5%, NaNO2 5%, AlCl3 10%,
NaOH 1 M, aquades pH 7, aluminium foil, dan kertas label.
Bahan untuk pengujian efek hiperglikemik ekstrak buah maja secara in
vivo adalah tikus putih (Rattus norvegicus) wistar jantan, kondisi sehat, umur 2-3
bulan dengan berat 180-200 gram. Hewan coba tikus putih jantan diperoleh dari
peternakan hewan di Singosari, Kabupaten Malang. Pakan tikus yang digunakan
adalah susu PAP. Sedangkan bahan kimia untuk analisis kadar glukosa serum
digunakan glukosa kit (glucose GOD FS) yang terdiri dari larutan standar
mengandung glukosa 100 mg/dl, reagen mengandung fosfat buffer, fenol, 4aminoantipirin, dan glukosa oksidase. Untuk induksi diabetes pada tikus
digunakan aloksan monohidrat.
3.2.2 Alat
Alat yang digunakan selama pelaksanaan penelitian pada proses
ekstraksi dan pengujian total senyawa bioaktif antioksidan, total fenol dan total
flavonoid adalah rotary evaporator, blender merk Philips, timbangan digital merk

37

Denvert Instrument M-310, vortex atau turbo mixer model TM-2000, shaker,
toples plastik, pisau, telenan, tabung reaksi, rak tabung, pipet ukur ukuran 1 ml,
pipet ukur ukuran 5 ml, pipet ukur ukuran 10 ml, gelas ukur 100 ml, erlenmeyer
250 ml, labu ukur ukuran 10 ml, labu ukur ukuran 5 ml, corong,spatula kaca,
spatula besi, beaker glass, bulb, panci, kompor, kain saring, dan baskom.
Alat yang digunakan untuk uji in vivo adalah mikro pipet 10 l, dan 1000
l merk Socorex, disposible tips, vortex atau turbo mixer model TM-2000,
disposable cuvet, spektrofotometer merk Spectro 20D, syringe, timbangan digital
merk Denvert Instrument M-310, hematocrite, sentrifuse, micro tube, timbangan
tikus, alat sonde, tabung reaksi, beaker glass, rak tabung, baskom plastik,
kandang berupa bak plastik berukuran 45 cm x 35,5 cm x 14,5 cm, tutup
kandang tikus dari kawat 36,5 cm x 28 cm x 15,5 cm, sekam, tempat makan
tikus, dan botol minum tikus.
Alat lain yang digunakan untuk analisa kimia GOD-PAP adalah timbangan
digital merk denvert instrument M-310, vortex atau turbo mixer model TM-2000,
disposable cuvet, spektrofotometer merk Spectro 20D, tabung reaksi, rak tabung,
pipet ukur ukuran 1 ml, pipet ukur ukuran 5 ml, pipet ukur ukuran 10 ml, labu ukur
ukuran 10 ml, dan bulb.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Rancangan Percobaan
Pada penelitian pengujian ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dalam
menurunkan glukosa darah tikus kondisi hiperglikemik ini menggunakan metode
pre post control design dengan menggunakan rancangan acak lengkap yang
(RAL) disusun atas dua faktor. Antara kedua faktor ini terjadi interaksi. Faktor 1
terdiri dari 6 level dan faktor kedua terdiri dari 5 level, sehingga didapatkan 30
kombinasi perlakuan. Faktor pertama adalah kelompok perlakuan tikus, yaitu :
K1 : Sebagai kontrol negatif. Tikus normal tanpa perlakuan apapun hanya diberi
pakan susu-PAP.
K2 : Sebagai kontrol positif. Tikus dikondisikan hiperglikemik dengan penyuntikan
aloksan sebanyak 80 mg/kg BB tikus dan diberi pakan susu-PAP.
K3 : Tikus dikondisikan hiperglikemik dengan penyuntikan aloksan sebanyak 80
mg/kg BB tikus dan diberi ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dosis 250
mg/kg BB tikus serta pakan susu-PAP.

38

K4 : Tikus dikondisikan hiperglikemik dengan penyuntikan aloksan sebanyak 80

mg/kg BB tikus dan diberi ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dosis 500
mg/kg BB tikus serta pakan susu-PAP.
K5 : Tikus dikondisikan hiperglikemik dengan penyuntikan aloksan sebanyak 80
mg/kg BB tikus dan diberi glibenklamid dosis 0,135 mg/kg BB tikus serta
pakan susu-PAP.
K6 : Tikus dikondisikan hiperglikemik dengan penyuntikan aloksan sebanyak 80
mg/kg BB tikus dan diberi ekstrak air buah maja (Crescentia cujete) dosis
375 mg/kg BB tikus serta pakan susu-PAP.
Faktor kedua adalah waktu (tiap minggu) pengambilan serum darah untuk
evaluasi kadar glukosa dalam darah, yaitu :
T0 : Pengamatan minggu ke-0 analisa glukosa darah
T1 : Pengamatan minggu ke-1 analisa glukosa darah
T2 : Pengamatan minggu ke-2 analisa glukosa darah
T3 : Pengamatan minggu ke-3 analisa glukosa darah
T4 : Pengamatan minggu ke-4 analisa glukosa darah.
Estimasi besar sampel tikus percoban yang akan digunakan ditentukan
menggunakan rumus p (n 1) 15 dengan n merupakan jumlah sampel tiap
perlakuan, dan p sebagai jumlah perlakuan. Penelitian ini menggunakan 6
macam perlakuan, maka jumlah hewan coba untuk masing-masing perlakuan
dapat dicari dengan rumus menjadi :
p (n 1) 15
6 (n 1) 15
6n 6 15
6n 21
n 21 : 6
n 3,5
Berdasarkan rumus diatas diperoleh jumlah tikus percobaan untuk
masing-masing kelompok sebanyak 3 ekor tikus. Tiap kelompok perlakuan diberi
kode masing-masing untuk memudahkan pemberian perlakuan.

39

3.4 Pelaksanaan Penelitian

3.4.1 Pembuatan Ekstrak Buah Maja (Crescentia cujete) Metode Maserasi
1. Buah maja (Crescentia cujete) yang sudah dipilih kemudian dicuci hingga
bersih. Fungsinya adalah untuk diperoleh bahan baku yang baik, tidak ada
kotoran-kotoran serta bagian-bagian lain selain buah maja.
2. Buah dibelah dan dipisahkan antara daging buah dan kulitnya.
3. Ambil bagian buahnya, bagian buahnya mengandung senyawa flavonoid.
4. Sampel dipotong-potong, kemudian dihaluskan untuk pengecilan ukuran
dengan blender. Fungsinya adalah untuk memperluas permukaan bahan dan
keseragaman bahan, sehingga ekstraksi berlangsung lebih optimal.
5. Padatan sampel buah maja yang telah halus diambil sebanyak 50 gram
kemudian dilarutkan dalam pelarut etanol 95% dengan rasio bahan : pelarut
1 : 6 atau 300 ml. Kemudian diekstraksi menggunakan metode maserasi
selama 24 jam dengan suhu ruang (25-27 OC) dan dengan kecepatan 145
rpm.
6. Penyaringan ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dengan pelarut etanol
dilakukan setelah 24 jam proses maserasi yang pertama. Dipisahkan filtrat
dan residu dengan penyaring vakum yang corongnya telah dialasi dengan
kain saring halus.
7. Padatan sampel buah maja yang telah diekstrak yang pertama kemudian
dilarutkan dalam pelarut etanol 95% 300 ml. Kemudian diekstraksi
menggunakan metode maserasi selama 8 jam dengan suhu ruang (25-27 OC)
dan dengan kecepatan 145 rpm.
8. Penyaringan ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dengan pelarut etanol
dilakukan setelah 8 jam proses maserasi yang kedua. Dipisahkan filtrat dan
residu dengan penyaring vakum yang corongnya telah dialasi dengan kain
saring halus.
9. Padatan sampel buah maja yang telah diekstrak yang kedua kemudian
dilarutkan dalam pelarut etanol 95% 300 ml. Kemudian diekstraksi
menggunakan metode maserasi selama 3 jam dengan suhu ruang (25-27 OC)
dan dengan kecepatan 145 rpm.
10. Penyaringan ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dengan pelarut etanol
dilakukan setelah 3 jam proses maserasi yang ketiga. Dipisahkan filtrat dan
residu dengan penyaring vakum yang corongnya telah dialasi dengan kain
saring dan kertas saring halus.
40

11. Dilakukan pengumpulan filtrat dari filtrat maserasi yang pertama, filtrat
maserasi yang kedua dan filtrat maserasi yang ketiga untuk selanjutnya di
evaporasi.
12. Proses evaporasi dilakukan dengan menggunakan rotary evaporator pada
tekanan 60 mBar, kecepatan 80 rpm, dan suhu 50 OC selama 7 jam. Proses
pemekatan dilakukan untuk menghilangkan pelarut, memperkecil volume
ekstrak sehingga diperoleh ekstrak pekat.
13. Ekstrak yang diperoleh disimpan pada suhu 4 OC.
14. Analisis pada ekstrak buah maja (Crescentia cujete) ini dilakukan dengan
melihat rendemen yang dihasilkan dan juga dilakukan analisis fungsional
meliputi total flavonoid, total fenol, dan aktivitas antioksidan DPPH IC50 (ppm).
3.4.2 Pembuatan Ekstrak Buah Maja (Crescentia cujete) Metode Infusa
1. Buah maja (Crescentia cujete) yang sudah dipilih kemudian dicuci hingga
bersih. Fungsinya adalah untuk diperoleh bahan baku yang baik, tidak ada
kotoran-kotoran serta bagian-bagian lain selain buah maja.
2. Buah dibelah dan dipisahkan antara daging buah dan kulitnya.
3. Ambil bagian buahnya, bagian buahnya mengandung senyawa flavonoid.
4. Sampel dipotong-potong, kemudian dihaluskan untuk pengecilan ukuran
dengan blender. Fungsinya adalah untuk memperluas permukaan bahan dan
keseragaman bahan, sehingga ekstraksi berlangsung lebih optimal.
5. Padatan sampel buah maja yang telah halus diambil sebanyak 50 gram
kemudian dilarutkan dalam pelarut aquades dengan rasio bahan : pelarut 1 : 5
atau 250 ml.
6. Persiapkan air dalam wadah panci lalu panaskan pada suhu 80-90 OC.
7. Masukkan simplisia buah maja (Crescentia cujete) yang telah dicampur
dengan aquades kedalam beaker glass.
8. Masukkan beaker glass ke dalam panci yang berisi air panas dan diaduk
selama 3 jam.
9. Tunggu hingga dingin dan disaring dengan kain saring.
10. Ekstrak yang diperoleh disimpan pada suhu 4 OC.
11. Analisis pada ekstrak buah maja (Crescentia cujete) ini dilakukan dengan
melihat rendemen yang dihasilkan dan juga dilakukan analisis fungsional
meliputi total flavonoid, total fenol, dan aktivitas antioksidan DPPH IC50 (ppm).

41

3.4.3 Percobaan secara In Vivo

a. Persiapan Dosis Uji Ekstrak Buah Maja (Crescentia cujete)
Pemberian ekstrak buah maja dengan dosis 250 dan 500 mg/kg BB tikus
dilarutkan dalam 2 ml aquades dan dilakukan dengan menggunakan sonde.
Pemilihan dosis 250 dan 500 mg/kg BB tikus pada metode maserasi dan dosis
375 mg/kg BB tikus pada metode infusa karena jumlah flavonoid yang
dibutuhkan oleh tikus saat pemberian ekstrak buah maja (Crescentia cujete)
dengan jumlah tersebut. Volume bahan uji yang diberikan secara oral pada tikus
putih dengan asumsi berat badan 200 gram adalah sebanyak 2-5 ml (Ngatidjan,
2006).
b. Percobaan Pada Hewan Coba (Tikus)
Pengujian ini dilakukan secara in vivo untuk mengetahui potensi ekstrak
buah maja yang mengandung antioksidan dalam menurunkan kadar glukosa
darah pada tikus kondisi hiperglikemik. Tahap ini dilakukan setelah proses
ekstraksi selesai. Langkah-langkah yang dilakukan pada pengujian ini adalah,
yaitu :
1. Sebelum perlakuan, tiap tikus dimasukkan ke dalam kandang individual yang
terbuat dari plastik berjeruji ukuran 45 cm x 35,5 cm x 14,5 cm. Setiap
kandang diberi label sesuai dengan perlakuan untuk memudahkan sebagai
tanda. Kandang dengan kondisi bersih ditempatkan pada suhu ruang dengan
sirkulasi udara yang cukup dan diberi pakan susu-PAP dan minum ad libitum.
2. Tahapan aklimatisasi (adaptasi) ini berlangsung selama 7 hari. Adaptasi ini
bertujuan untuk menyesuaikan tikus dengan lingkungan. Pemberian pakan
pada tikus dilakukan secara ad libitum dan pada setiap harinya diukur berat
badan tikus.
3. Setelah 7 hari masa adaptasi, tikus ditimbang berat badannya. Apabila berat
badan tkus sudah mencapai 200 gram maka tikus tersebut sudah siap untuk
dilakukan perlakuan hiperglikemk.
4. Dilakukan randomisasi agar setiap hewan coba memiliki peluang yang sama
mendapatkan perlakuan.
5. Kemudian tikus dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan masing-masing
kelompok terdiri dari 3 ekor tikus yang sehat. Kelompok 1 merupakan
kelompok tikus normal tanpa pemberian ekstrak. Kelompok 2, 3, 4, 5, dan 6

42

merupakan kelompok tikus hiperglikemik dengan penyuntikan aloksan dosis

80 mg/kg BB secara intraperitoneal (injeksi pada bagian rongga perut) dan
diberi ekstrak buah maja dosis 0 mg/kg BB tikus, 250 mg/kg BB tikus, dan 500
mg/kg BB tikus (untuk ekstrak metode maserasi). Sedangkan untuk
pemberian glibenklamid diberi dosis 0,135 mg/kg BB tikus dan untuk
kelompok perlakuan ekstrak metode infusa digunakan dosis 375 mg/kg BB
tikus.
6. Kadar glukosa darah tikus diukur setelah 3 hari adaptasi usai penyuntikan
aloksan dengan cara mengambil darah secara retro orbital plexus (diambil
dari pembuluh darah di dekat mata). Analisis ini dihitung sebagai kadar
glukosa darah minggu ke-0. Hanya tikus dengan kadar glukosa darah > 200
mg/dl yang digunakan dalam percobaan ini.
7. Ekstrak buah maja (Crescentia cujete) kemudian diberikan pada kelompok ke3 dengan dosis 250 mg/kg BB tikus dan kelompok-4 dengan dosis 500 mg/kg
BB tikus. Pemberian glibenklamid juga diberikan pada kelompok ke-5 dengan
dosis 0,135 mg/kg BB tikus. Pemberian ekstrak air buah maja (Crescentia
cujete) juga diberikan pada kelompok ke-6 dengan dosis 375 mg/kg BB tikus.
Pemberian ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dan glibenklamid dilakukan
setiap hari dengan bantuan alat sonde (force feeding) dengan dosis yang
telah ditentukan.
8. Secara rutin pemberian dosis ekstrak buah maja (Crescentia cujete) dan
glibenklamid diberikan pada pagi hari pukul 07.00. Treatment tersebut
dilakukan selama 28 hari. Pakan tikus diberikan secara ad libitum namun
tetap ditimbang sebanyak 20 gram/hari agar bisa diketahui sisa pakannya tiap
hari. Pengukuran kadar glukosa darah dan berat badan tikus dilakukan tiap
minggunya dan dihitung sebagai minggu ke-1, 2, 3, dan 4.
3.5 Pengamatan Penelitian
Ekstrak buah maja yang dihasilkan akan dilakukan analisis dengan
parameter mutu yang diamati meliputi aktivitas antioksidan metode DPPH
(Hatano, et al., 1989), analisis total flavonoid (Yuwono dan Susanto, 2001), dan
analisis total fenol (Quan, 2007). Kadar glukosa serum darah tikus ditentukan
dengan mengambil darah dari retro orbital plexus tiap minggunya. Kemudian
dilakukan pengujian kadar glukosa serum darah dengan metode Enzymatic
Photometric Test GOD-PAP, serta analisis berat badan dan asupan pakan.

43

Menurut Voigt (1995), metode enzimatik pada pemeriksaan glukosa darah

memberikan hasil dengan spesifitas yang tinggi, karena hanya glukosa yang
akan terukur. Cara ini adalah cara yang digunakan untuk menentukan nilai batas.
Ada 2 macam metode enzimatik yang digunakan, yaitu glucose oxidase dan
metode hexokinase. Tetapi untuk penelitian ini menggunakan glucose oxidase
karena untuk metode hexokinase membutuhkan biaya lebih mahal dan
digunakan untuk uji yang lebih spesifik.
Prinsip metode ini adalah pengukuran glukosa yang ditentukan secara
enzimatik

yaitu

dengan

penambahan

enzim

glukosa

oksidase

(GOD)

mengkatalisis reaksi oksidasi glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen

peroksida. Hidrogen peroksida yang terbentuk bereaksi dengan phenol dan 4amino

phenazone

quinoneimine

dengan

yang

berwarna

bantuan
merah

enzim
muda

peroksidase
dan

dapat

menghasilkan
diukur

dengan

spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm. Intensitas warna yang

terbentuk setara dengan kadar glukosa darah yang terdapat dalam sampel.
Pengukuran dilakukan terjadi setelah reagen dihomogenisasi ke dalam
serum darah dan di inkubasi selama 20 menit pada suhu 20-25 OC. setelah itu
dilakukan pembacaan nilai absorbansi pada panjang gelombang 546 nm.
Reagen yang digunakan pada pengukurannya, yaitu :
Tabel 6. Reagen GOD-PAP
Jenis pelarut
Blanko
Sampel/standar
Aquades
10 L
Reagen
1000 L

Sampel/standar
10 L
1000 L

Dengan rumus perhitungan kadar glukosa darah, yaitu :

Kadar glukosa (mg/dL)

Absorbansi sampel
Absorbansi standar

x Konsentrasi standar

3.6 Analisis Data

Data hasil penelitian tahap 1 dianalisis menggunakan analisis deskriptif.
Data hasil penelitian tahap 2 dianalisis secara kuantitatif dengan menggunakan
analisis ragam ANOVA satu arah (One Way ANOVA) dan apabila tidak terdapat
interaksi namun disalah satu perlakuan atau keduanya terdapat beda sangat

44

nyata, maka dilanjutkan dengan uji beda nyata yaitu BNT (Beda Nyata Terkecil)
menggunakan selang kepercayaan 5%.
3.7 Diagram Alir Penelitian
3.7.1 Pembuatan Simplisia Buah Maja (Crescentia cujete)

Buah maja (Crescentia cujete)

Sortasi
Dicuci dengan air mengalir
Dibelah dan dipisahkan dengan kulit buah
Daging buah maja (Crescentia cujete)

Dipotong kecil-kecil
Dihaluskan dan ditimbang
Simplisia buah maja (Crescentia cujete)
Gambar 12. Diagram Alir Pembuatan Simplisia Buah Maja (Crescentia
cujete) (Modifikasi Pumklam, et al., 2011)

45

3.7.2 Pembuatan Ekstrak Buah Maja (Crescentia cujete) 2 x 24 jam Metode

Maserasi

Simplisia buah maja (Crescentia cujete)

Ditimbang 50 gr dan dimasukkan dalam erlenmeyer

Etanol 95% 300 ml
Dimaserasi dengan kecepatan 145 rpm selama 24 jam

Disaring kain saring

Padatan
Dilakukan maserasi ke-2 selama 8 jam

Etanol 95% 300 ml

Disaring kain saring

Padatan
Etanol 95% 300 ml
Dilakukan maserasi ke-3 selama 3 jam
Disaring kain + kertas saring
Filtrat

Etanol

Filtrat di evaporasi suhu 40oC, 80 rpm selama 7 jam

Analisis :
Hasil

-Aktivitas antioksidan
(Modifikasi Wulandari, 2010)
-Total fenol (Modifikasi
Wulandari, 2010)
-Total flavonoid (Modifikasi
Wulandari, 2010)

Gambar 13. Diagram Alir Ekstraksi Buah Maja (Crescentia cujete) 2 x 24 jam
Metode Maserasi (Modifikasi Pumklam, et al., 2011)

46

3.7.3 Pembuatan Ekstrak Buah Maja (Crescentia cujete) Metode Infusa

Simplisia buah maja (Crescentia cujete)

Dipisahkan dari kotoran

Diblender kering kecepatan sedang 2 menit

Diambil 50 gr
Aquades 250 ml
Air dalam wadah yang lebih besar dipanaskan
80-90 oC
Simplisia + Aquades
Dimasukkan ke dalam air panas,
diaduk selama 2 jam
Disaring dengan kain saring

Analisis :
-Aktivitas antioksidan

Hasil

(Modifikasi Wulandari, 2010)

-Total fenol (Modifikasi
Wulandari, 2010)
-Total flavonoid (Modifikasi
Wulandari, 2010)

Gambar 14. Diagram Alir Ekstraksi Buah Maja (Crescentia cujete) Metode
Infusa (Modifikasi Pumklam, et al., 2011)

47

3.7.4 Pengujian Efek Hiperglikemik Ekstrak Simplisia Buah Maja

(Crescentia cujete) secara In Vivo
18 Ekor tikus percobaan

Adaptasi lingkungan 7 hari

Randomisasi

Kelompok I
kontrol negatif

Kelompok III

Kelompok V

hiperglikemik +

hiperglikemik +

ekstrak dosis 250

glibenklamid dosis

mg/kg BB

0,135 mg/kg BB

Kelompok IV

Kelompok VI

kontrol positif

hiperglikemik +

hiperglikemik +

hiperglikemik

ekstrak dosis 500

ekstrak air dosis

mg/kg BB

375 mg/kg BB

Kelompok II

Penimbangan berat badan tikus

Penyuntikan
aloksan dosis 80

Pengkondisian hiperglikemik
Adaptasi aloksan dalam tubuh tikus
selama 3 hari
Pengambilan darah

Pengambilan darah secara retro

minggu ke-0

orbital plexus

mg/kg BB tikus
secara
intraperitoneal

Pakan susu-PAP

Ekstrak buah
maja dengan

Sisa pakan
ditimbang
selama

Pemberian pakan secara ad libitum

setiap hari

sonde

perlakuan
Pemeliharaan perlakuan dan
penimbangan BB tikus selama
28 hari

Pengambilan darah
minggu ke-1
Pengambilan darah
minggu ke-2

Pengukuran kadar glukosa darah

metode GOD-PAP

Pengambilan darah
minggu ke-3
Pengambilan darah

Uji
Histopatologi

Hasil

minggu ke-4

Gambar 15. Diagram Alir Bioassay Pengukuran Kadar Glukosa Darah pada
Tikus Hiperglikemia (Modifikasi Wulandari, 2010)

48