Anda di halaman 1dari 21

MEDIUM KULTUR

KEBERHASILAN DALAM TEKNOLOGI


SERTA PENGGUNAAN METODE
KULTUR JARINGAN (IN VITRO)
SANGAT TERGANTUNG PADA JENIS
MEDIA YANG DIGUNAKAN.

Macam Media Kultur Jarigan


Medium Murashige & Skoog (MS)
Media MS hampir digunakan untuk semua macam tanaman,
terutama tanaman herbaceus. Media ini mempunyai
konsentrasi garam- garam mineral yang tinggi dan kandungan
Nitrat ynag tinggi (NO3- )

Medium B5
konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan
media MS. Media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan
suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk
meregenerasi seluruh bagian tanaman

Medium Scheck dan Hildebrandt


Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus
tanaman monokotil dan dikotil. Media SH ini cukup luas
penggunaannya, terutama untuk tanaman legume

Macam Media Kultur Jarigan


Medium WPM
Merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah
dari media MS. Media diperuntukkan khusus
tanaman
berkayu. Saat ini WPM banyak digunakan untuk
perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohonpohon

Medium N6
Media N6 mempunyai ciri perbandingan NHdan
NOyang jauh perbandinganya. Amonium yang
diberikan dalam bentuk (NH)SOhanya sebanyak 363
mg/l, sedangkan KNO2830 mg/l

dll
(Suryowinoto, M. 1991)

komponen utama penyusun media kultur.


Pengatur tumbuh: untuk
Garam mineral Hara

Makro: N,P,K,Ca,S,Mg &


Mikro :Fe,Mn,B,Cu,Mo,Cl
dan Co.
Sumber karbon: sukrosa 15% dan glukosa, maltosa,
galaktosa, laktosa (terbaik)
Vitamin : Tiamin,
piridoksin, asam nikotin
dan mio-inositol.

menginduksi pembelahan
sel Auksin : IAA,NAA &
2,4-Diklrofenoksiasetat(2,4-D). Sitokinin :
kinetin, benziladenin(BA),
6-benzilaminopurin (BAP).
Pelengkap organik: dapat
merangsang laju
pertumbuhan sel (air kelapa,
jus jeruk, ekstrak ragi, dll)

GARAM-GARAM MINERAL
Unsur hara makro & mikro diberikan dalam bentuk

Garam anorganik pada media.


Unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3,

KNO3, CaCl2, 2H2O, MGSO4.7H2O, dan KH2PO4.


Unsur mikro diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O,
ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, NaMoO4.2H2O, CuSO4.5H2O,
dan CoCl2.6H2O.
Perbaikan pada penambahan garam mineral NO3 & K

Menunjang pertumbuhan kalus, pertumbuhan pucuk


dan embriogenesis pada banyak tanaman.

SUMBER KARBON
Tanaman kultur tumbuh secara heterotrof dan laju

fotosintesisnya rendah sehingga sintesis karbonnya


tidak cukup
Perlu ditambah gula sebagai sumber karbon dan
energi untuk induksi kalus
Sukrosa dalam media dihidrolisa jadi monosakarida
selama masa kultur.
Dalam kultur kalus dan pucuk 2-4 % optimum,
sdgkan kultur embrio dapat mencapai 12%
Selain sumber energi, gula berfungsi sebagai
tekanan osmotik dalam media

VITAMIN
Vitamin memiliki fungsi katalitik pada sistem enzim dan

dibutuhkan dalam jumlah kecil


Thiamine(B1) yang paling sering dan penting digunakan,
berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang
menghasilkan energi dari karbohidrat dan memindahkan
energi
Piridoksin (B6) dan Niasin (asam nikotianat) dapat
meningkatkan pertumbuhan kalus. Mio-inositol
(vit.tanaman) untuk membantu diferensiasi &
pertumbuhan jaringan kalus
Asam Karbonat bertujuan untuk mencegah terjadinya
pencoklatan pada permukaan irisan jaringan
Vit.E juga dapat merangsang pembentukan kalus dalam
kultur embrio jagung.

ZAT PENGATUR TUMBUH


AUKSIN digunakan untuk

merangsang pertumbuhan kalus,


pemanjangan sel tanaman dan
pembentukan akar adventif
Konsentrasi auksin yang rendah
dapat meningkatkan pembentukan
akar adventif, sedangkan
konsentrasi tinggi akan merangsang
pembentukan kalus dan menekan
morfogenesis
Alamiah: indole acetic acid (IAA)
Sintetik: Naphthaleneaceic acid
(NAA), dan 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4D)

SITOKININ berperan dalam

pembelahan sel, pembentukan


tunas dan proliferasi tunas
aksiler, serta dpt menghambat
pembentukan akar
Alamiah: Zeatin dan 2iP
Sintesis: Kinetin, BAP & BA
(benzyladenine ).
Bila rasio antara auksin dan
sitokinin tinggi maka akan
memacu inisiasi akar dan induksi
pembentukan kalus
Bila rasio antara auksin dan
sitokinin rendah maka akan
memacu proliferasi pucuk adv.

ZAT PENGATUR TUMBUH


Giberelin atau GA3

digunakan untuk
meningkatkan pemanjangan
pucuk2 yang sangat kecil dan
merangsang pembentukan
embrio dari kalus.
Namun GA3 tidak begitu sering
digunakan karena senyawa
tersebut tidak tahan panas dan
tidak dapat diautoklaf.

Asam Absisat (ABA)

berfungsi sebagai zat


penghambat tumbuh
Etilen merupakan ZPT yang
berbentuk gas
Etilen dapat mengakibatkan
terhambatnya perkembangan
kultur, namun pada kisaran
kons.rendah dapat
meningkatkan pembentukan
pucuk adventif

BAHAN PEMADAT MEDIA


Paling banyak digunakan

adalah agar agar mengandung


Ca,Mg,K dan Na atau
pengganti agar seperti, Geltrite
atau Phytagel
Keuntungan pemakaian agaragar :
1. Membeku pd suhu 45 C dan
cair pd suhu 100 C.
2. gel agar bersifat stabil pada
suhu inkubasi
3. Tidak dicerna oleh enzim
tanaman.
4. Tdk bereaksi dgn penyusun
media yang lain.
Kons agar : 0,5-1,0%

Konsentrasi agar yang terlalu

tinggi dapat mengurangi difusi


persenyawaan dari dan ke arah
eksplan shg pengambilannya
kurang sedangkan zat
penghambat dari eksplan tetap
berkumpul disekitar eksplan.

PELENGKAP ORGANIK
Air kelapa dapat digunakan

untuk mempertahankan
pertumbuhan.
Kandungannya: as.amino,
as.organik, as.nukleat, purin,
gula, gula alkohol dan zat
pengatur tumbuhan
Jus Jeruk merupakan sumber
gula, vitamin dan zat pengatur
tumbuh.
Ekstrak Ragi digunakan pd
awal sejarah KJT oleh White
dan Robbins
As.amino,peptida, vitamin
untuk pertumbuhan kultur akar

Penggunaan suplemen

organik sering dihindari


karena tidak spesifik dan
hasil yang diperoleh kadang
tidak dapat diulangi kembali

ARANG AKTIF
Dapat ditambahkan kedalam

media pada berbagai tahap


perkembangan kultur.
Pengaruh arang aktif :
1. Mengadsorpsi senyawa
toksik yg terdapat dlm media
sprti Senyawa Fenol
2. Mengadsopsi zat pengatur
tumbuh shg mencegah
pertumbuhan liar &
membantu embriogenesis.
3. Menstimulasi
pertumbuhan sel
4. Dapat mempengaruhi
kepadatan agar yang
terbentuk

Konsentrasi; 0,5-3%

pH MEDIA
Harus diatur agar tdk

mengganggu fungsi
membran sel dan pH
sitoplasma
Sel tanaman
membutuhkan pH
media yang sedikit
asam 5,6 5,8.
Beberapa tanaman
membutuhkan pH yang
berbeda untuk
pertumbuhan optimum

pH yang tinggi >6.0

membuat media agar


menjadi keras
pH <5.2 membuat
media agar tidak dapat
memadat

Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media


a. Sterilisasi Peralatan

Sterilisasi peralatan
(glassware dan logum) dan
aquades dilakukan dengan
sterilisasi kering (oven
1300c-1700c selama 2-4 jam).
Sterilisasi peralatan dengan
autoclave dilakukan pada
suhu 1210c takanan 15 PSI
selama 1 jam.
Sterilisasi peralatan logam
(pinset, gunting, jarum) yang
digunakan dengan
merendam perakitan tsb
dalam alcohol 95% diikuti
dengan pembakaran dan
pendinginan.

b. Sterilisasi medium
kultur

Metode autoclave

Medium dalam botol kultur


ditutup dengan alumunium
foil pada suhu 1210 C,
tekanan PSI selama 15-40
menit dari waktu medium
mencapai suhu yang
diperlukan.

Metode Filtrasi

Yaitu sterilisasi
menggunakan membrane
filter berukuran 0,45-0,22
mm di dalam kontiener
steril.

(Sriyanti, 1994)

Jenis Kontaminan Media


Internal
Kontaminasi internal

umumnya disebabkan oleh


ketidaksterilan bahan
eksplan itu sendiri.
Pencegahan kontaminasi
Internal dapat dilakukan
dengan sterilisasi kontak.

Eksternal
Kontaminasi eksternal dapat

disebabkan oleh jamur dan


bakteri.
Untuk mengatasi
kontaminasi eksternal dapat
digunakan penggunaan
fungisida, HgCl2 dan klorin
karena dengan sterilisasi
berlapis dapat mereduksi
resiko kontaminan baik yang
berasal dari cendawan,
bakteri maupun kotorankotoran lain yangmenempel
pada permukaan eksplan
(Gunawan, 2007)

Pembuatan Larutan Stok

Rumus perhitungan larutan stok


Untuk menentukan larutan stok yang ingin digunakan
kita dapat menghitungnya dengan menggunakan
rumus:
V1.M1 = V2.M2
Dimana :
V1 = volume yang akan dibuat
V2 = volume larutan stok yang akan diambil
M1 = banyaknya kebutuhan senyawa dalam media
MS
M2 = banyaknya senyawa larutan stok
(Marlin dan Romaida, 2008)

Pembuatan Media Kultur Jaringan


Alat;

Bahan;

Beker glass

Makro

: Tempat pembuatan media


: Mengaduk Bahan
Plastik wrap
: Menutup tempat media
Botol kultur
: Tempat membiakkan
eksplan
Autoclave : Menyimpan media
Microwave: Pemanas/ mengentalkan
larutan
Mikropipet
: Mengambil media MS
Gelas ukur : Mengukur media MS yang

diperlukan
Neraca analitik
: Menimbang bahanbahan
Pipet ukur : Mengambil bahan cair
pH meter : Mengukur pH larutan
Karet
: Mengikat plastik penutup
botol
Kertas label
: Memberi nama pada botol
kultur
Labu ukur : Menampung dan
mencampur larutan kimia
Erlenmeyer
: tabung tempat larutan
sebelum di masukan pada
botol kultur
Stirer

: 25 mL
Mikro A
: 2,5 mL
Fe-Na-EDTA
: 2,5 mL
Vitamin
: 2,5 mL
Fungsi
: Sebagai bahan
pembuatan larutan stok
Sukrosa : Membuat larutan
menjadi tercampur
rata (7,5 gram)
Agar-agar: Mengentalkan Larutan
(1,75 gram)
Aquades : Bahan dasar media
HCL
: untuk ditambahkan ke
larutan jika larutan
bersifat basa
KOH
: untuk ditambahkan ke
larutan jika larutan
bersifat asam

Pembuatan Media Kultur Jaringan


Strelisasi semua peralatan

Pipet larutan stok (Makro 25 mL, mikro 2,5 mL ,


Vitamin 2,5 mL, Fe-Na-EDTA 2,5 mL)

Masukan dalam Beaker gelas dan tambahkan Aquades sampai


Volume 250 mL

Masukan Magnet Stirer kedalam Beaker gelas


dan letakan pada Plate Magnetic Stirer

Nyalakan magnetic stirrer supaya larutan homogen


dan tambahkan Sukrosa (7,5 g/L) sampai larut

Pembuatan Media Kultur Jaringan


Ukur pH Larutan sesuai ketentuan (5,6-5,8), dengan
pH Meter

Jika pH sudah sesuai, tambahkan agar-agar (1,75 g/L) yang sudah


di siapkan,panaskan dengan microwave sampai mendidih dan
larut sempurna
Tiriskan sampai tidak terlalu panas dan tuangkan dalam botol
kultur (Masing-masing 20 mL)

Tutup botol dengan plastic yang sudah di siapkan dan media siap di
sterilisasi dengan Autoclave pada tekanan 1.5 psi selama 20 menit
Setelah di autoclave botol media di pindahkan ke ruang kultur
jaringan dan selanjutnya siap untuk digunakan sebagai media
tanam

Media merupakan salah satu komponen yang penting


dalam metode kultur jaringan. Kesuksesan aplikasi
prosedur kultur jaringan sebagian besar dipengaruhi
oleh medium dengan komposisi yang tepat. Media
yang baik, harus memenuhi syarat nutrisi yang
diperlukan eksplan untuk tumbuh dan berkembang.
Oleh karena itu, di dalam media kultur jaringan
ditambahkan berbagai macam mineral, vitamin,
sumber karbohidrat, dan zat pengatur tumbuh
(hormon)
( Evans et al. 2003)