COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA
OBJETIVOS
1. Conocer los principios básicos de los métodos para la medida de concentración de las
sustancias.
3. Realizar una curva espectral, una curva de calibración y establecer sus diferencias.
A. COLORIMETRIA
Amarillo Amarill
o
Azul Verde
Azu
l
94,50
Fuente de Filtro
Hendidura
De entrada HendiduraCubeta Detector
energía radiante Pantalla
de salida
La luz blanca emitida por una lámpara de tungsteno pasa a través de una rendija (apertura), y
luego a través de un lente condensador que vuelve paralelos estos rayos que van a incidir
sobre la solución problema (generalmente es coloreada o tiene la capacidad de absorber la
luz) la cual se coloca en la celda o cubeta. La cubeta es generalmente de vidrio de paredes
paralelas con 1 cm de separación entre ellas en la mayoría de los casos, esta distanciase
conoce como paso de luz..
El Filtro puede estar colocado antes o después de la cubeta y su color se selecciona para
permitir la transmitancia máxima del color no absorbidodia. El color del filtro debe ser
complementario al de la solución que se estudia, por ejemplo, si se quiere examinar una
solución de color azul, se selecciona el filtro rojo que es complementario y permite la
transmisión máxima del color no absorbido (azul) o dicho de otra forma el filtro rojo no
absorbe luz azul permitiendo la máxima transmitancia de este último. Los filtros producen
bandas angostas de transmisión y por lo tanto luz aproximadamente monocromática . Cada
color corresponde a una región del espectro de luz blanca y posee una longitud de onda (λ)
característica que se mide en nanometros (nm) y puede ser seleccionada mediante el uso de
los filtros en los colorímetros. La longitud de onda más usada para mediciones en Bioquímica
Clínica es 340 nm que pertenece al rango ultravioleta. A esta longitud de onda las formas
reducidas de los cofactores NADH, NADPH tienen valores altos de Absorbancia mientras que
sus formas oxidadas (NAD, NADP) no absorben. Una reacción catalizada por enzimas que
utilicen estas coenzimas puede ser medida fácilmente por la aparición o desaparición de
NADH o NADPH.
La luz llega a una fotocelda que genera corriente eléctrica en proporción directa a la
intensidad de la luz incidente, se amplifica la señal y finalmente pasa a un galvanómetro que
proporciona directamente medidas de porcentaje de Transmitancia y Absorbancia.
De cada uno de estos dos factores Longitud y Concentración se deriva la Ley de Lambert y
de Beer respectivamente.
Ley de Lambert
Ι = Ι o . e-k1 . l
Ley de Beer
Ι = Ι o . e-k 2.c
Ι = Ι o . e-k 3.c.l
Transmitancia y Absorbancia
La concentración de la sustancia desconocida, puede calcularse en % transmitancia o en
unidades de Absorbancia. El cociente de las dos intensidades, I/Io, se conoce como
TRANSMITANCIA y se expresa como un porcentaje.
-Log Ι / Ι o = k.c.l
Log Ι o / Ι = k.c.l. = Absorbancia = A
T = 100 __Ι __
Ιo
Expresando en Logaritmos:
Para buscar la concentración de una sustancia desconocida por colorimetría las lecturas
deben hacerse en %T ya que la escala de lectura es lineal porque está dividida
homogénaemente en 100 partes iguales lo que hace su medición más exacta; la escala de
Absorbancia o extinción es logarítmica, se extiende de cero a dos con divisiones desiguales
haciendo poco exacta la lectura principalmente en los valores altos. Sin embargo, en la
práctica debe emplearse valores de Absorbancia, que pueden hallarse mediante la fórmula o
mediante una tabla de conversión para cada valor de transmitancia. Con valores conocidos
de A o %T, es posible hallar la concentración de una sustancia desconocida (solución
absorbente). La relación entre la concentración y el % T no es lineal, por lo cual se requiere
muchos puntos para lograr una medición exacta; en contraposición existe una relación lineal
entre la concentración y la Absorbancia. (Figura 2.5.).
Figura 2.5 Relación entre la absorción de la luz y la concentración
Por lo tanto con un solo punto dado por el patrón (Estándar de concentración conocida) es
posible trazar una curva correcta teniendo en cuenta solo si se ha establecido la relación
lineal (o rango lineal) y descartando los rangos de desviación tanto a altas concentraciones
como a bajas concentraciones
Para que se cumpla la Ley combinada deben darse las siguientes condiciones:
1. La luz preferiblemente debe ser monocromática o la longitud de onda debe estar entre
límites muy estrechos.
B. ESPECTROFOTOMETRIA
La banda de longitudes de onda de la luz que pasa a través del filtro, en el caso dell
colorímetro es muy ancha, por lo cual puede ser difícil distinguir entre dos compuestos que
tengan absorción parecida; en este caso, es recomendable usar un Espectrofotómetro ya que
permite separar picos de absorción muy juntos debido a la presencia del monocromador. Los
Espectrofotómetros son aparatos más sofisticados cuyas 2 ventajas principales son:
b) Permite mayor poder de resolución: esto es medir exactamente dos compuestos que
absorben a longitudes de onda muy cercanas.
I. CURVA ESPECTRAL
A. MATERIALES
B. MÉTODOS
Con los datos obtenidos trazar en papel milimetrado la curva espectral, graficando las
longitudes de onda en la abcisa y las absorbancias en la ordenada e informar el rango de
longitud de onda óptimo l para la solución coloreada utilizada.
Cada sustancia presenta una mayor absorción en una región del espectro (rango de lectura)
a una longitud de onda característica.
Se realiza en papel milimetrado una curva resultante de graficar en la abcisa las diferentes
concentraciones de los patrones procesados y en la ordenada las absorbancias
correspondientes a cada uno. Si se cumple la ley de Beer Lambert uniendo los puntos se
obtendrá una recta, dentro de un rango de absorbancia vs. Concentración. Tambien se
determinarán los rangos de desviación.
Solo con el rango lineal posible hallar cualquier concentración desconocida de la sustancia
analizada, si interpolamos sobre la ordenada el dato correspondiente a la Absorbancia del
desconocido en la abcisa. Dado que muchas curvas cumplen las leyes de Beer Lambert
por la ley matemática de proporciones, se cumple:
Absorbancia 1 Absorbancia 2
____________ : _____________
Concentración 1 Concentración 2
Dado que conocemos la concentración del patrón estándar y las absorbancias de ambos
casos, del patrón y de la muestra, es posible, despejando, hallar la concentración
desconocida:
C standard (C St ) C muestra (C m) A St
En donde:
A = Absorbancia m = Muestra
C = Concentración St = Estándar o patrón
Factor = C St
A St
RECORDAR QUE ESTA PROPORCION ES VALIDA SOLO SI YA ESTÁ COMPROBADO
QUE LAS CURVAS CUMPLEN LAS LEYES DE BEER LAMBERT.
PROCEDIMIENTO
BIBLIOGRAFIA